專利名稱：表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬用于污染微生物降解領(lǐng)域，特別是涉及一種表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解 方法。
背景技術(shù)：
Jensen在1966年首次報道了環(huán)境中多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls， PCBs)的污 染，從此，PCBs的存在和它的持久性己成為人們所關(guān)注的熱點問題。由于PCBs的持久性 和難于降解性，PCBs是環(huán)境中最重要的污染物之一，其廣泛積累于土壤、水、沉積物和大 氣中。目前處理PCBs污染的方法主要是物理或者化學(xué)技術(shù)，兩者都存在或者價格昂貴或 者產(chǎn)生二次污染的問題。而微生物處理技術(shù)作為經(jīng)濟、有效的方法而被各國采納并開展研 究。
微生物針對不同的污染物會分泌不同的酶參與反應(yīng)，從而改變有機污染物的結(jié)構(gòu)，將 其降解成為簡單有機物，降低其不利的影響。在PCBs的降解過程中存在著兩種不同的作 用模式厭氧脫氯作用和好氧生物降解作用。
由于微生物對環(huán)境的適應(yīng)性強，且污染過程經(jīng)歷一段自然馴化期，因而可以通過馴化 從自然環(huán)境中篩選到可降解某一污染物的微生物降解菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物降解多氯聯(lián)苯的方法，通過表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯 降解，為其污染治理和應(yīng)用提供技術(shù)方法。
本發(fā)明的表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，包括
(1) 將表皮葡萄球菌接種于多氯聯(lián)苯降解培養(yǎng)基28 32"C搖床培養(yǎng)24 120h;
(2) 培養(yǎng)物經(jīng)高效液相色譜測定，可分析該菌株對多氯聯(lián)苯的降解效果；
(3) 在添加了外加碳源葡萄糖后，提高了多氯聯(lián)苯的降解效率，獲得降解多氯聯(lián)苯的條 件。
所述表皮葡萄球菌是從上海松江污水處理廠的活性污泥中篩選出來的，此菌株屬于微 球菌科(wz'cracoccaceae)，葡萄球菌屬。該菌株的馴化培養(yǎng)基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯(lián)苯。 該菌落為圓形，邊緣整齊，乳白色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈球狀，革蘭氏染色陰性， 菌體周圍有粘液層包裹。
所述的多氯聯(lián)苯降解培養(yǎng)基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯聯(lián)苯一丙酮溶液， pH6.8-7.2。
所述的降解多氯聯(lián)苯的條件為pH7.0， 30°C，搖床的轉(zhuǎn)動頻率150rpm。
有益效果
表皮葡萄球菌在pH7.0， 30°C，搖床的轉(zhuǎn)動頻率150rpm，在添加了外加碳源葡萄糖的 降解培養(yǎng)基中發(fā)酵5天，表皮葡萄球菌對2,3'，4'5-四氯聯(lián)苯的降解效率達到93.33%。


圖1是表皮葡萄球菌(5to; /^/ococc^印/cfem7/^y)所屬種群系統(tǒng)樹；
圖2是2,3',4',5-四氯聯(lián)苯一丙酮溶液作為標準樣品的高效液相色譜圖3是降解培養(yǎng)基(DM)作為對照樣品的高效液相色譜圖4是降解培養(yǎng)基(DM)中表皮葡萄球菌對PCBs降解的高效液相色譜圖5是在添加了外加碳源葡萄糖的降解培養(yǎng)基中表皮葡萄球菌對PCBs的降解效率。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限
定的范圍。
實施例1多氯聯(lián)苯降解菌的分離鑒定
1、菌株的分離
(1)采集上海松江污水處理廠的活性污泥，置于一個長60cm，寬40cm，高50cm的玻 璃馴化裝置，在不加營養(yǎng)物質(zhì)，沒有進水出水交換的基礎(chǔ)上用空壓機曝氣3天，然后進行 換水，排出裝置中大約10L的泥水混合物，加入營養(yǎng)液并進行不間斷曝氣。在培養(yǎng)了 10 天后在加入營養(yǎng)液的同時開始加入PCBs的廢液進行馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)馴化兩個月。培養(yǎng)液 的配制葡萄糖5克、尿素2克、磷酸二氫鉀l克。配制成大約IO升左右的營養(yǎng)液。
(2)將馴化后的水樣沉淀30分鐘后取上清夜，然后用8層紗布過濾兩遍，濾液與富集 培養(yǎng)基按體積1:5的比例配成溶液移入錐形瓶中，放在搖床上培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速為150r/min， 溫度為3(TC，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0。富集培養(yǎng)基(Enrichment Medium)的主要成分為 牛肉浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L， pH7.4 7.6。
在馴化培養(yǎng)中利用聯(lián)苯作為唯一碳源再進行馴化培養(yǎng)。取馴化培養(yǎng)基100ml移入250ml的錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為7.0，在無菌條件下移入富集培養(yǎng)基的混濁液lml。放入 搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，溫度為30°C，培養(yǎng)時間為兩個星期。馴化培養(yǎng)基 (Domestication Medium)的主要成分為0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯(lián)苯。
菌株劃線分離，分離培養(yǎng)基SM (SeparateMedium)的主要成分為牛肉浸膏5g/L、 蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂粉20g/L、聯(lián)苯0.5g/L。得到單一菌株，在純化富集培 養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。純化富集培養(yǎng)基PEM (Purification Enrichment Medium)主要成分為 0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/L MgS04， 0.1 g/L CaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 2g/L聯(lián)苯。
2、菌株的鑒定
(1) 菌體及菌落形態(tài)特征
菌株個體為球狀，革蘭氏染色陰性，菌體周圍有粘液層包裹；其菌落為圓形，邊緣整 齊，乳白色，光滑，濕潤，凸起。
(2) 通過16S rDNA序列測定和分析比較，該序列與表皮葡萄球菌16S rDNA序列的 同源性達到99%，確定該菌株為表皮葡萄球菌(Sto戶/^/ococciw印fflfeA7w'cfo),其16SrDNA 序列如表l。
實施例2表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解分析 將表皮葡萄球菌接種到經(jīng)滅菌的馴化培養(yǎng)基中(0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯(lián)苯)，置于恒溫 搖床內(nèi)，30°C， 150rpm，培養(yǎng)14天。然后接種于PCBs降解培養(yǎng)基(DegradationMedium) (0.5g/LKH2PO4、 0.5g/LK2HPO4、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NIL02SO4、 100mg/L2，3，,4，,5-四氯聯(lián)苯一丙酮溶液、pH7.0)，樣品經(jīng)高效液相色譜測定， 分析該菌對PCBs的降解效果。 液相色譜條件
① 單柱單檢測系統(tǒng)，長250mm，內(nèi)徑5mm活性炭柱。
② 載體比例色譜級甲醇10%，純凈水90%
③ 柱溫150°C
④ 泵及泵壓范圍二元泵，20 400Pa
⑤ 進樣方式手動進樣⑥ 進樣量50 UL
⑦ 波長范圍檢測波長230nm，參比波長360nm
先用2,3'，4'，5-四氯聯(lián)苯一丙酮溶液作為標準樣品測得樣品中的PCBs在7. 5min處出現(xiàn) 波峰，如圖2。確定了PCBs標準樣品的出峰時間，就可以進一步分析PCBs的降解效果。 通過在降解培養(yǎng)基(DN)中未接種表皮葡萄球菌作為對照和接種表皮葡萄球菌樣品的高效 液相色譜圖比較(如圖3、圖4)可以得到PCBs的初始濃度為15. 7ng/ix L，最終濃度為5. 9ng/ U L ，降解效率為62. 4%。
實施例3外加碳源對多氯聯(lián)苯降解效率的影響
(1) 將表皮葡萄球菌，接入富集培養(yǎng)基EM內(nèi)，置于搖床內(nèi)3(TC， 150rpm，富集培養(yǎng) 5天。
(2) 配制三份50ml的降解培養(yǎng)基DM，其中一份添加2g/L葡萄糖做外加碳源，置于 150ml錐形瓶中。一瓶不接種留作空白，另兩瓶分別接種100ul富集菌液。搖床30'C， 150rpm培養(yǎng)。
(3) 在無菌操作條件下，分別于接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d取出5ml菌液。
(4) 樣品預(yù)處理
① 將菌液置于分液漏斗內(nèi)，分三次加入二氯甲烷。第一、二次加入2ml，第三次加入 lml。每次加入后充分振蕩，靜置片刻。待上下完全分層后，取出下層油相層。
② 將上述所取的油相，用無水硫酸鈉過濾。并統(tǒng)一濃縮至lml。 液相色譜條件與實施例2中的液相色譜條件相同。
經(jīng)分析測定，得到表皮葡萄球菌降解多氯聯(lián)苯的條件在pH7.0， 30'C,搖床的轉(zhuǎn)動 頻率150rpm，添加了外加碳源葡萄糖的降解培養(yǎng)基中發(fā)酵5天，表皮葡萄球菌對2,3',4'5-四氯聯(lián)苯的降解效率達到93.33%，見圖5。表1 16S rDNA序列 caccttcgac ggctagctcc aaatggttac tccaccggct tcgggtgtta caaactctcg 60 tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgtagca tgctgatcta 120 cgattactag cgattccagc ttcatatagt cgagttgcag actacaatcc gaactgagaa 180 caactttatg ggatttgctt gacctcgcgg tttcgctacc ctttgtattg tccattgtag 240 cacgtgtgta gcccaaatca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300 ggtttgtcac cggcagtcaa cttagagtgc ccaacttaat gatggcaact aagcttaagg 360 gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420 accacctgtc actctgtccc ccgaagggga aaactctatc tctagagggg tcagaggatg 480 tcaagatttg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540 gcgggtcccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg 600 cttaatgcgt tagctgcagc acttaagggc ggaaaccccc taacactt 648
權(quán)利要求
1. 表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，包括(1)將表皮葡萄球菌接種于多氯聯(lián)苯降解培養(yǎng)基28～32℃搖床培養(yǎng)24～120h；(2)培養(yǎng)物經(jīng)高效液相色譜測定，分析該菌株對多氯聯(lián)苯的降解效果；(3)在添加了外加碳源葡萄糖后，獲得降解多氯聯(lián)苯的條件。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，其特征在于所述表皮葡萄球菌是從上海松江污水處理廠的活性污泥中篩選出來的，其馴化培養(yǎng)基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯(lián)苯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，其特征在于所述的多氯聯(lián)苯降解培養(yǎng)基是0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/LK2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0g/L(NH4)2SO4、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯聯(lián)苯_丙酮溶液、pH 6.8-7.2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，其特征在于所述的降 解多氯聯(lián)苯的條件為pH7.0， 30°C，搖床的轉(zhuǎn)動頻率150rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解方法，包括將表皮葡萄球菌接種于多氯聯(lián)苯降解培養(yǎng)基28～32℃搖床培養(yǎng)24～120h，其培養(yǎng)物經(jīng)高效液相色譜測定，可分析該菌株對PCBs的降解效果。在添加了外加碳源葡萄糖后，可提高表皮葡萄球菌對多氯聯(lián)苯的降解效率，獲得該菌降解多氯聯(lián)苯的條件。
文檔編號A62D3/00GK101428171SQ200810041050
公開日2009年5月13日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者任昱宗, 龐曉倩, 瑤 彭, 趙曉祥 申請人:東華大學(xué)