專利名稱：去羥基萬古霉素及其制備方法、和其藥物組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的萬古霉素衍生物。具體地說，利用東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis Orientalis)，微生物菌種保藏號為CGMCCNO.1183的菌株發(fā)酵得到該萬古霉素衍生物，通過制備色譜分離純化得到去羥基萬古霉素。

背景技術(shù)：
萬古霉素是五十年代開發(fā)的一種有殺菌作用的糖肽類抗生素，對革蘭陽性球菌有強大的殺菌作用。特別是最近由于表皮葡萄球菌感染有所增加，出現(xiàn)了耐甲氧西林金葡萄球菌的感染，使臨床對萬古霉素的作用尤為重要。因此，萬古霉素是目前臨床上用于治療由甲氧西林耐藥金葡菌引起的嚴重感染疾病的首選藥物。由于萬古霉素的作用機制獨特，其多肽類抗生素在體內(nèi)容易分解，使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用。
此外，國內(nèi)已有去甲萬古霉素同類藥物，實驗表明，去甲萬古霉素同萬古霉素一樣，可以有效地抑制難辨梭狀芽孢桿菌在腸道中的定植和繁殖，從而消除了它的致病性。它是治療難辨梭狀芽孢桿菌偽膜性腸炎的特效藥物，抗菌作用強，是治療厭氧菌感染及一些革蘭式陽性菌的有效藥物。使用中不易產(chǎn)生耐藥性，與其他抗生素無交叉耐藥，具有良好的藥代動力學性質(zhì)。但它始終不能取代進口萬古霉素。

鹽酸萬古霉素分子結(jié)構(gòu) 近年來，迫切需要研發(fā)出治療人類疾病的新抗生素。為了研發(fā)新藥，通常對已知的抗生素物質(zhì)進行分子結(jié)構(gòu)上的結(jié)構(gòu)修飾來取得突破，但是這樣的結(jié)構(gòu)修飾往往會導(dǎo)致新物質(zhì)失去所需的活性。在萬古霉素的發(fā)酵產(chǎn)物有多個衍生物生成，發(fā)酵菌株的不同也會導(dǎo)致衍生物的差異。在已報道的文獻中，我們發(fā)現(xiàn)美國lilly公司申請的專利中就列出了多種萬古霉素的衍生物(專利號EP0159180)，分別為M43A，M43B，M43C，M43D。其結(jié)構(gòu)如下

本申請的發(fā)明人在鹽酸萬古霉素的生產(chǎn)中從萬古霉素的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一種新的萬古霉素衍生物去羥基萬古霉素。通過對其分子結(jié)構(gòu)研究，我們確定該物質(zhì)是一種不同于上述四種萬古霉素衍生物的新物質(zhì)。具體地說，去羥基萬古霉素與萬古霉素的結(jié)構(gòu)極為相似，鑒于萬古霉素良好的抗菌能力，可以推測一旦去羥基萬古霉素被認識清楚，極有可能成為一種新的抗生素。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了得到萬古霉素發(fā)酵過程產(chǎn)生的一種新的萬古霉素衍生物。具體地說，本發(fā)明提供了一種通式I的去羥基萬古霉素。

通式I去羥基萬古霉素分子結(jié)構(gòu) 其中，通式I的去羥基萬古霉素分子中R為H。因此，萬古霉素與去羥基萬古霉素的不同點在于去羥基萬古霉素分子中R為H，而萬古霉素分子中R為OH。
本發(fā)明還提供了去羥基萬古霉素的制備方法，包括以下步驟 (1)利用東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis Orientalis)，微生物菌種保藏號為CGMCCNO.1183的菌株制備含有去羥基萬古霉素的萬古霉素濃縮液； (2)通過柱層析分離純化上述濃縮液得到含有去羥基萬古霉素的鹽酸萬古霉素精濾液； (3)再經(jīng)過色譜分離純化上述精濾液制得去羥基萬古霉素； 其中，在步驟(2)中，在含有鹽-水流動相的凝膠層析柱中進行柱層析分離純化； 在步驟(3)中，在含有緩沖液-甲醇流動相的大孔吸附樹脂色譜柱中進行色譜分離純化。
其中，將所述萬古霉素濃縮液pH調(diào)整至2.8。在凝膠層析柱中，所述流動相為0.1M NH4HCO3水溶液。所述凝膠為葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和聚苯乙烯凝膠。
在柱層析分離純化中，還包括用0.22um微孔濾膜對柱層析液進行納濾、濃縮、脫鹽。
此外，在色譜分離純化中，所述流動相為緩沖液甲醇＝928。所述緩沖液包括三乙胺和磷酸，且pH＝3.2。所述大孔吸附樹脂為羅門哈斯大孔吸附樹脂。
鑒于去羥基萬古霉素是萬古霉素的副產(chǎn)物，在進行制備色譜分離純化之前，二者的工藝過程是一致的，均采用東方擬無枝酸菌菌株制備去羥基萬古霉素與萬古霉素。因此，在進行制備色譜分離純化之前，采用東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis Orientalis)，微生物菌種保藏號為CG MCCNO.1183菌株制備去羥基萬古霉素，該方法參見本申請人于2004年10月15日提交的中國第200410067197.7號專利申請。根據(jù)本發(fā)明，去羥基萬古霉素的制備方法包括如下 1、利用東方擬無枝酸菌菌株制備含有去羥基萬古霉素的萬古霉素 (1)培養(yǎng)基配方的選擇及確定 通過對培養(yǎng)基配方中的碳源、氮源及無機鹽等的種類及濃度的研究，確定了發(fā)酵水平較高且穩(wěn)定的斜面、種子及發(fā)酵培養(yǎng)基配方。
(2)斜面培養(yǎng)基 經(jīng)培養(yǎng)基配方的篩選比較，確定萬古霉素產(chǎn)生菌的斜面培養(yǎng)基采用高氏一號斜面培養(yǎng)基，具體配方如下 可溶性淀粉2.0％； NaCl 0.05％； KNO3 0.1％； MgSO4 0.05％； FeSO4 0.001％； KH2PO4 0.05％； 瓊脂 2.2％ 消后 pH 7.2-7.4 斜面接種后，于28℃培養(yǎng)7天。生長好的斜面豐滿，表面呈灰白色，菌落呈饅頭狀，表面有淺灰色環(huán)紋，孢子乳白色，直徑在3-5mm之間。
(3)種子培養(yǎng)基 經(jīng)培養(yǎng)基配方的篩選比較，確定萬古霉素產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)基具體配方如下 可溶性淀粉 4.0％； 葡萄糖 1.5％； 甘油 2.0％； 黃豆餅粉(熱榨) 2.0％； KNO3 0.6％； KH2PO4 0.02％； MgCl2 0.02％； 泡敵 0.06％ 消前 pH 6.8 搖瓶種子培養(yǎng)基裝量750ml搖瓶裝量為100ml；培養(yǎng)溫度28℃；培養(yǎng)時間48hr；生長良好的搖瓶種子液pH7.7左右，外觀呈乳黃色，4000rpm離心10min，菌絲量在22％左右；鏡檢菌絲粗壯，無雜菌即可作為種子接入下一級種子罐培養(yǎng)或小試發(fā)酵罐發(fā)酵。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基 經(jīng)培養(yǎng)基配方的篩選比較，確定萬古霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基具體配方如下 甘油 6.0％； 黃豆餅粉(熱榨) 2.0； KH2PO4 0.02％； MgCl2 0.02％； KNO3 0.6％； CaCl2 0.3％； 消前 pH6.8 (5)發(fā)酵條件的選擇及確定 通過試驗，確定了萬古霉素搖瓶及10L玻璃罐發(fā)酵的發(fā)酵條件。包括發(fā)酵溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝量、玻璃罐通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速等。
(6)發(fā)酵溫度 通過在搖瓶條件下，25℃、28℃、30℃三個不同的溫度發(fā)酵試驗，結(jié)果證明在28℃時的發(fā)酵水平最高，發(fā)酵液中的副產(chǎn)物較其余兩個溫度條件為少，因此確定萬古霉素發(fā)酵溫度為28℃。
(7)發(fā)酵最適pH 通過在搖瓶條件下發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5、6.8及7.0三種不同的pH發(fā)酵條件試驗，結(jié)果證明在發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.8時的發(fā)酵水平最高，發(fā)酵液的顏色較另外兩種條件為淺，副產(chǎn)物也較少，因此確定萬古霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.8。
(8)其它發(fā)酵條件 發(fā)酵周期搖瓶發(fā)酵周期為6天，發(fā)酵罐發(fā)酵周期為5-6天。
搖瓶裝量750ml搖瓶裝量為100ml時發(fā)酵水平最高。
10L玻璃罐發(fā)酵參數(shù)通氣量1:1(vol:vol)，攪拌轉(zhuǎn)速550rpm。
2、含有去羥基萬古霉素的鹽酸萬古霉素的分離純化 (1)發(fā)酵液的預(yù)處理 由于在萬古霉素的發(fā)酵終點時發(fā)酵液的pH在7.7左右，因此在發(fā)酵液中萬古霉素是以游離堿的形式存在。而在分離純化的第一步，即將萬古霉素通過交換吸附到大孔吸附樹脂(D1300)上。此交換過程要求抗生素以游離酸的形式存在。因此，需要用稀鹽酸將發(fā)酵液酸化并使其pH調(diào)至3.2左右。在此酸化過程中，同時可加入絮凝劑及助濾劑等使發(fā)酵液易于過濾且獲得質(zhì)量較好的發(fā)酵濾液。
(2)吸附、脫鹽及脫色 為了進一步將發(fā)酵濾液中的萬古霉素與其他的水溶性雜質(zhì)相分離，需要將發(fā)酵濾液通過裝有大孔羧酸型吸附樹脂的樹脂柱，水洗除去其他雜質(zhì)后，再采用乙醇水溶液將抗生素解吸下來。
采用D1300作為吸附樹脂，在將發(fā)酵濾液通過樹脂柱進行吸附前，應(yīng)首先用4N NaOH將發(fā)酵濾液pH回調(diào)至4.5左右。解吸采用pH＝2.0的80％酸性乙醇水溶液。解吸液經(jīng)HPLC分析檢測，萬古霉素積分面積比一般在75％左右，單位平均應(yīng)在10,000μg/ml以上。
上述過程得到的解吸液經(jīng)納濾濃縮脫鹽，再經(jīng)針用活性炭脫色，并加入適量的黃血鹽及硫酸鋅除去鐵離子。收集的上述混合收集液納濾脫鹽濃縮，再加入4N鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.8左右，加入活性炭脫色，黃血鹽及硫酸鋅除去鐵離子后得到脫鹽脫色濃縮液，滿足后續(xù)柱層純化的要求。
(3)柱層純化 通過對大量分離介質(zhì)的選擇試驗，最終確定柱層采用的層析介質(zhì)為Sephadex C-25，并進行了柱層條件、洗脫劑、洗脫方式等方面的深入細致的研究，確定了最佳的純化方案，該純化工藝方案采用0.1MNH4HCO3水溶液進行梯度洗脫，分段收集洗脫液，合格部分合并經(jīng)過納濾濃縮脫鹽即為收得的層析精制液。
將上述濃縮液通過Sephadex C-25凝膠層析柱，依照工藝要求進行進一步的分離純化，以上的層析純化液合并，通過納濾濃縮脫鹽，即可得到層析精制液。合格的精制液經(jīng)活性炭脫色、0.22um微孔濾膜過濾除熱源后，該鹽酸萬古霉素精濾液通過冷凍干燥可獲得含有去羥基鹽酸萬古霉素的鹽酸萬古霉素凍干粉。
3、再經(jīng)過色譜分離純化制得高純度的去羥基萬古霉素。
此外，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了去羥基萬古霉素在制備用于治療易感細菌感染藥物的用途。
而且，本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，其包含藥學有效量的去羥基萬古霉素，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。其中，所述藥物組合物還包括萬古霉素和/或鹽酸萬古霉素。
本發(fā)明人采用制備色譜對鹽酸萬古霉素樣品進行分離純化獲得高純度去羥基萬古霉素的，以用于后續(xù)科研工作。

具體實施例方式 實施例1含有去羥基鹽酸萬古霉素的鹽酸萬古霉素的分離純化 (1)發(fā)酵液的預(yù)處理 用稀鹽酸將發(fā)酵液酸化并使其pH調(diào)至3.2左右。在此酸化過程中，同時可加入黃血鹽(絮凝劑或助濾劑)等使發(fā)酵液易于過濾且獲得質(zhì)量較好的發(fā)酵濾液。
(2)吸附、脫鹽及脫色 采用D1300作為吸附樹脂，在將發(fā)酵濾液通過樹脂柱進行吸附前，應(yīng)首先用4N NaOH將發(fā)酵濾液pH回調(diào)至4.5左右。解吸采用pH＝2.0的80％酸性乙醇水溶液。解吸液經(jīng)HPLC分析檢測，萬古霉素積分面積比一般在75％左右，單位平均應(yīng)在10,000μg/ml以上。
上述過程得到的解吸液經(jīng)納濾濃縮脫鹽，再用活性炭脫色，并加入適量的黃血鹽及硫酸鋅除去鐵離子。收集的上述混合收集液納濾脫鹽濃縮，再加入4N鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.8左右，加入活性炭脫色，黃血鹽及硫酸鋅除去鐵離子后得到脫鹽脫色濃縮液。
(3)柱層純化 將上述濃縮液通過Sephadex C-25凝膠層析柱，采用0.1MNH4HCO3水溶液進行梯度洗脫，分段收集洗脫液，合并層析純化液，經(jīng)過0.22um微孔濾膜納濾濃縮脫鹽制得的層析精制液。該精制液經(jīng)活性炭脫色過濾除熱源后，該精濾液通過冷凍干燥可獲得含有去羥基鹽酸萬古霉素的鹽酸萬古霉素無菌原料粉。
實施例2再經(jīng)過色譜分離純化制得高純度的去羥基萬古霉素 實驗原料實施例1中含有去羥基萬古霉素的鹽酸萬古霉素無菌原料粉； 實驗儀器 P6000高壓制備泵； UV6000可變波長紫外分光檢測器(由北京創(chuàng)新通恒科技有限公司提供)； C18 MONOMERIC 5×25cm制備色譜柱(GRACE)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀； 羅門哈斯大孔吸附樹脂(XAD1600樹脂)250ml玻璃層析柱； 輔助用玻璃儀器若干。
實驗步驟 1、建立色譜分離條件 兼顧分離度和效率優(yōu)化后的色譜分離條件為 色譜柱C18 MONOMERIC 5×25cm制備色譜柱(GRACE)； 檢測波長280nm； 進樣量150mg； 流速60ml/min； 緩沖液溶解4ml三乙胺于1996ml水中，用H3PO4調(diào)pH至3.2配成緩沖液； 流動相為緩沖液甲醇＝928 載體XAD1600樹脂 得到的AU光譜圖，參見

圖1，其中，5號峰為鹽酸萬古霉素主峰，6號峰為我們的目標雜質(zhì)峰。
2、收集目標雜質(zhì)餾分及除去三乙胺鹽 收集了五十針餾分約6L收集液。
裝250ml XAD1600樹脂層析柱，將收集液上柱吸附。上柱后用大量的水洗充分后，用50％的甲醇水溶液洗脫，收集到60ml洗脫液。
3、濃縮凍干 將60ml洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5ml左右，送凍干機房凍干得到35mg目標物。
4、結(jié)構(gòu)鑒定 待測樣品的1HNMR圖譜給出的質(zhì)子信號峰，總體與萬古霉素的相似。其中，3個甲基單峰δ 0.85(3H，J＝6.0Hz)，δ 0.89(3H，J＝6.5Hz)和δ 1.06(3H，J＝6.5Hz)，以及1個甲基單峰δ 2.26是待測樣品結(jié)構(gòu)中存在與萬古霉素相同的N-methylleucine(A)和vancosaminyl(Van)結(jié)構(gòu)單元的診斷信號。在芳香區(qū)，3個ortho-meta-偶合的ABX體系δ 7.16(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-E4)、6.71(1H，d，Jorth。<8.0Hz，H-E7)、6.76(1H，brd J＝8Hz，Jmeta<1.0Hz，H-E8)、7.41(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-B5)、7.13(1H，d，Jortho＝8.0Hz，H-B8)和7.16(1H，d，Jortho<1.0Hz，H-B9)，δ 7.84(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-F5)、7.31(1H，d，Jortho＝8.0Hz，H-F8)、和7.45(1H，brd J＝8Hz，Jmeta<1.0Hz，H-F9)，以及2個meta-偶合的AB自旋體系δ 5.47(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-D4)和5.20(1H，brs，Jortho<1.0Hz，H-D8)、6.38(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-G6)和(1H，brs，Jmeta<1.0Hz，H-G8)。
本發(fā)明通過上面的實施例進行舉例說明，但是，應(yīng)當理解，本發(fā)明并不限于這里所描述的特殊實例和實施方案。在這里包含這些特殊實例和實施方案的目的在于幫助本領(lǐng)域中的技術(shù)人員實踐本發(fā)明。任何本領(lǐng)域中的技術(shù)人員很容易在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下進行進一步的改進和完善，因此本發(fā)明只受到本發(fā)明權(quán)利要求的內(nèi)容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的備選方案和等同方案。
權(quán)利要求
1、一種如下通式I的去羥基萬古霉素
其中，式中R為H。
2、一種如權(quán)利要求1所述的去羥基萬古霉素的制備方法，所述方法包括如下步驟
(1)利用東方擬無枝酸菌菌株制備含有去羥基萬古霉素的萬古霉素濃縮液；
(2)通過柱層析分離純化上述濃縮液得到含有去羥基萬古霉素的鹽酸萬古霉素精濾液；
(3)再經(jīng)過色譜分離純化上述無菌原料粉制得去羥基萬古霉素；
其中，在步驟(2)中，在含有鹽-水流動相的凝膠層析柱中進行柱層析分離純化；
在步驟(3)中，在含有緩沖液-甲醇流動相的大孔吸附樹脂色譜柱中進行色譜分離純化。
3、如權(quán)利要求2所述的制備方法，將所述萬古霉素濃縮液pH調(diào)整至2.8。
4、如權(quán)利要求2所述的制備方法，在凝膠層析柱中，所述流動相為0.1M NH4HCO3水溶液。
5、如權(quán)利要求2所述的制備方法，所述凝膠為葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和聚苯乙烯凝膠。
6、如權(quán)利要求2所述的制備方法，在柱層析分離純化中，還包括用0.22um微孔濾膜對柱層析液進行納濾、濃縮、脫鹽。
7、如權(quán)利要求2所述的制備方法，在色譜分離純化中，所述流動相為緩沖液甲醇＝92:8。
8、如權(quán)利要求2或7所述的制備方法，所述緩沖液包括三乙胺和磷酸，且pH＝3.2。
9、如權(quán)利要求2所述的制備方法，所述大孔吸附樹脂為羅門哈斯大孔吸附樹脂。
10、一種藥物組合物，其包含藥學有效量的如權(quán)利要求1所述的去羥基萬古霉素，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
11、如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，還包括萬古霉素和/或鹽酸萬古霉素。
12、一種如權(quán)利要求10或11所述的包含去羥基萬古霉素的藥物組合物在制備用于治療易感細菌感染藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種去羥基萬古霉素及其制備方法，所述方法包括如下步驟(1)利用東方擬無枝酸菌，微生物菌種保藏號為CGMCCNO.1183菌種制備去羥基萬古霉素的萬古霉素濃縮液；(2)通過柱層析分離純化上述濃縮液得到含有去羥基萬古霉素的鹽酸萬古霉素精濾液；和(3)再經(jīng)過色譜分離純化上述精濾液制得去羥基萬古霉素。其中，在含有鹽-水流動相的凝膠層析柱中進行柱層析分離純化；在含有緩沖液-甲醇流動相的大孔吸附樹脂色譜柱中進行色譜分離純化。此外，本發(fā)明還提供一種包含藥學有效量的去羥基萬古霉素的藥物組合物，以及該藥物組合物在制備用于治療易感細菌感染藥物的用途。
文檔編號A61P31/00GK101397333SQ20071015202
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日
發(fā)明者徐炳祥, 謝海松, 歡 余, 偉 毛, 葉偉東 申請人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠