專(zhuān)利名稱(chēng)：含高濃度維生素b12活性的組合物的生產(chǎn)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含天然維生素B12的組合物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
維生素B12是對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物很重要的維生素。它可用來(lái)治療惡性貧血和周?chē)窠?jīng)炎以及用作食品添加劑。維生素B12也是重要的增強(qiáng)生長(zhǎng)的動(dòng)物飼養(yǎng)添加劑。
術(shù)語(yǔ)維生素B12是用來(lái)描述類(lèi)咕啉鈷家族的化合物，尤其鈷胺素類(lèi)的化合物。最常用的這類(lèi)化合物是氰鈷胺素，因此術(shù)語(yǔ)維生素B12有時(shí)用來(lái)提及氰鈷胺素。在此說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)維生素B12應(yīng)屬于其廣義的意義，包括所有鈷胺素類(lèi)的類(lèi)咕啉鈷，特別包括分別以氰基、羥基、甲基或5′-脫氧腺苷基為特征的氰鈷胺素，羥鈷胺素，甲基鈷胺素和5′-脫氧腺苷鈷胺素。已知甲素鈷胺素和5′-脫氧腺苷鈷胺素在分離狀態(tài)時(shí)見(jiàn)光不穩(wěn)定并且在水溶液中容易轉(zhuǎn)變?yōu)榱u鈷胺素。因此，幾乎所有商品維生素B12制品所含的穩(wěn)定氰鈷胺素都不是自然界發(fā)現(xiàn)的維生素B12的化學(xué)形態(tài)。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)天然維生素B12定義為包括自然界天然存在的維生素B12的所有化學(xué)形式，因而不包括氰鈷胺素。
在工業(yè)上，幾乎只使用脫氮假單胞菌和丙酸桿菌屬種類(lèi)通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12，然后通過(guò)化學(xué)方法將天然維生素B12轉(zhuǎn)化為氰鈷胺素形式，所用化學(xué)方法包括氰化作用和隨后使用有機(jī)溶劑的抽提和純化步驟(如Spalla等，1989，“維生素B12的微生物生產(chǎn)”，于維生素、色素和生長(zhǎng)因子的生物技術(shù)，E.J.Vandamme編輯，Elsevier，London，New York，第257-284頁(yè)中所論述的)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化步驟和所有隨后的步驟使該生產(chǎn)方法昂貴，對(duì)操作者不安全并對(duì)環(huán)境有害。
經(jīng)消化后，動(dòng)物和人將氰鈷胺素轉(zhuǎn)化成維生素B12的一種天然形式如甲素鈷胺素或5′-脫氧腺苷鈷胺素，有幾種生化轉(zhuǎn)變需要這些天然形式的維生素B12作為輔酶(Ellenbogen，L.，于維生素手冊(cè)，營(yíng)養(yǎng)、生化和臨床方面，L.J.Machlin編輯，Marcel Dekker Inc.，New York和Basel)。此外，動(dòng)物的有效生長(zhǎng)要求動(dòng)物飼料中有足量的維生素B12活性。維生素B12制品常常單獨(dú)作為飼料添加劑或作為含其它維生素和其它飼料添加劑的預(yù)混合物的一部分出售。
因此應(yīng)當(dāng)清楚，直接供應(yīng)5′-脫氧腺苷鈷胺素或甲基鈷胺素而不是氰鈷胺素將是有益的。鑒于這兩種化合物的不穩(wěn)定性，它們不能以分離的形式生產(chǎn)，而是與合成它們的生物的生物質(zhì)一起制成干燥制品。這樣的制品非常適于用作動(dòng)物飼料添加劑。對(duì)于生產(chǎn)甲基鈷胺素和5′-脫氧腺苷鈷胺素，最優(yōu)選的是丙酸桿菌屬的細(xì)菌，因?yàn)椴幌衩摰賳伟釛U菌屬的細(xì)菌已從美國(guó)食品和藥品管理局獲得了GRAS(通常識(shí)別為安全的)身份，并且已知不產(chǎn)生內(nèi)毒素。丙酸酐菌屬種類(lèi)是耐氧，不移動(dòng)，無(wú)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其它特征在于由碳酸，乳酸和多元醇合成大量丙酸。丙酸酐菌屬屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的高“GC”亞門(mén)(T.D.Brook，M.T.Madigan，J.M.Martinko和J.Parker，于微生物學(xué)，第7版，Prentice-Hall International Inc.，1994)。
專(zhuān)利申請(qǐng)RU 2001953(抗生素酶研究技術(shù)所)提及謝氏丙酸桿菌的噴霧干燥方法，這種方法已用于生產(chǎn)含生物質(zhì)的5′-脫氧腺基鈷胺素。來(lái)自產(chǎn)甲烷細(xì)菌的生物質(zhì)的甲基鈷胺類(lèi)可從Gedeon Richter公司商業(yè)購(gòu)買(mǎi)，然而，這些制品中的維生素B12含量被發(fā)酵期間合成維生素B12的水平所限制，結(jié)果是，這些制品的維生素B12含量不超過(guò)0.1％(重量/重量)。組合物中維生素B12的濃度常規(guī)上以維生素B12的干重占組合物干重的百分率定量。
氰鈷胺素的濃縮產(chǎn)品(即＞0.1％重量/重量)可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)。然而，飼料廠(chǎng)和預(yù)混合物制造廠(chǎng)不能使用這種產(chǎn)品，因?yàn)橛捎谒撵o電特性，在飼料廠(chǎng)和預(yù)混合物制造廠(chǎng)的加工過(guò)程中，當(dāng)配制成濃度＞0.1％(重量/重量)的產(chǎn)品時(shí)，氰鈷胺素會(huì)與其載體分離。分離是篩分，風(fēng)篩或使組合物保持較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)的特殊問(wèn)題。
本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，通過(guò)這種方法可以生產(chǎn)含相對(duì)高濃度(＞0.1％重量/重量)天然維生素B12的組合物。這些新的濃縮產(chǎn)品可用于例如動(dòng)物飼料、人類(lèi)食品中或用作化妝品的成分。這些新的濃縮產(chǎn)品的使用和運(yùn)輸更方便，從而可以減少費(fèi)用。因?yàn)樗鼈兛梢栽诩庸み^(guò)程中降低維生素B12與載體的分離，所以它們可以被飼料廠(chǎng)和預(yù)混合物制造廠(chǎng)有效地利用。這種方法容易在工業(yè)規(guī)模上操作并對(duì)環(huán)境相對(duì)有益，因?yàn)椴恍枰褂糜袡C(jī)溶劑或氰化作用。
發(fā)明描述本發(fā)明提供制備含天然維生素B12的組合物的方法，該組合物含有干物質(zhì)濃度超過(guò)0.1％(重量/重量)的維生素B12。此方法包括以下步驟a)獲取含天然維生素B12的微生物細(xì)胞，b)使微生物細(xì)胞裂開(kāi)，導(dǎo)致含維生素B12的細(xì)胞的至少部分可溶成分釋放到包含這些細(xì)胞的液體中，c)分離裂開(kāi)的細(xì)胞和含維生素B12的液體，并且可選擇地d)制備維生素B12和至少一部分裂開(kāi)細(xì)胞的混合物。
優(yōu)選地，使用已知合成維生素B12的微生物，以工業(yè)發(fā)酵方法獲得含維生素B12的微生物細(xì)胞。這些微生物包括屬于醋酸桿菌屬，氣桿菌屬，土壤桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，節(jié)桿菌屬，固氮菌屬，芽孢桿菌屬，梭菌屬，棒桿菌屬，埃希氏菌屬，真桿菌屬，黃桿菌屬，甲烷桿菌屬，甲烷八疊球菌屬，分枝桿菌屬，丙酸桿菌屬，變形菌屬，假單胞菌屬，根瘤菌屬，紅假單胞菌屬，沙門(mén)氏菌屬，沙雷氏菌屬，鏈球菌屬，鏈霉菌屬和黃單胞菌屬的細(xì)菌。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌對(duì)于人和/或動(dòng)物消費(fèi)是安全的并且不產(chǎn)生內(nèi)或外毒素。更優(yōu)選地，該細(xì)菌已從美國(guó)食品和藥品管理局獲得了GRAS(通常識(shí)別為安全的)身份。本發(fā)明方法中所用的最優(yōu)選細(xì)菌是丙酸桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選的丙酸桿菌屬種類(lèi)是費(fèi)氏丙酸桿菌或謝氏丙酸桿菌。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)非常了解，與許多其它微生物代謝物的生產(chǎn)一樣，使用從設(shè)計(jì)為提高任一特定菌株所需特征的程序得到的菌株進(jìn)行維生素B12的工業(yè)生產(chǎn)。這些程序基本上包括用誘變劑處理生產(chǎn)菌株并篩選表現(xiàn)提高了產(chǎn)量或其它優(yōu)點(diǎn)的突變體。已描述了幾種用于合理篩選過(guò)量生產(chǎn)維生素B12的突變微生物的技術(shù)〔Spalla，C.，Grein，A.，Garofo，L和Ferni，G.，維生素B12的微生物生產(chǎn)，于維生素、色素和生長(zhǎng)因子的生物技術(shù)，第257-284頁(yè)(E.J.Vandamme編輯)Elsevier，London/NY，1989〕。這樣的突變菌株在本發(fā)明優(yōu)選方法中使用能夠進(jìn)一步增加所得組合物中維生素B12的濃度。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“天然維生素B12”定義為包括所有自然界天然存在的維生素B12的化學(xué)形式，不包括維生素B12的氰鈷胺形式。在本發(fā)明優(yōu)選的方法和組合物中，天然維生素B12包括5′-脫氧腺基鈷胺素和/或甲基鈷胺素。
在本發(fā)明方法中，處理含維生素B12的微生物細(xì)胞以引起細(xì)胞膜裂解或其它破裂。裂解形容微生物細(xì)胞的裂開(kāi)，這樣使含維生素B12的細(xì)胞的(至少部分)可溶成分釋放到包含這些細(xì)胞的液體中。優(yōu)選的使細(xì)胞裂開(kāi)的處理是熱處理，包括巴氏滅菌法或在高壓滅菌器中加熱；用溶細(xì)菌的酶如溶菌酶處理；機(jī)械破碎細(xì)胞，包括研磨或使用剪切力；用引起細(xì)胞裂解的化學(xué)品如去污劑或有機(jī)溶劑處理；以及這些處理方法的結(jié)合使用。裂解或其它膜破裂產(chǎn)生溶菌產(chǎn)物，溶菌產(chǎn)物可以分成固相和液相。
在本發(fā)明優(yōu)選方法中，將至少部分固相(裂開(kāi)細(xì)胞)加入含天然維生素B12的液相中，以使得到的組合物是含生物質(zhì)的混合物，即優(yōu)選地裂開(kāi)的微生物細(xì)胞和天然維生素B12。這些組合物的維生素B12含量或濃度表達(dá)為基于組合物的干物質(zhì)含量的維生素B12的重量百分比。
本發(fā)明的方法生產(chǎn)含干物質(zhì)濃度大于0.1％(重量/重量)的維生素B12的組合物。在優(yōu)選方法中，組合物含有濃度大于0.2％(重量/重量)的天然維生素B12，較優(yōu)選地大于0.4％(重量/重量)，更優(yōu)選地大于0.6％(重量/重量)；還更優(yōu)選地大于0.8％(重量/重量)，并且最優(yōu)選地大于1.0％(重量/重量)。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物的維生素B12濃度不超過(guò)10％(重量/重量)，更優(yōu)選地，維生素B12的濃度不超過(guò)5％(重量/重量)。
在本發(fā)明的方法中，將含由細(xì)胞裂開(kāi)產(chǎn)生的細(xì)胞碎片的溶菌產(chǎn)物的固相與含釋放的維生素B12的液體分開(kāi)。有一些不同的固-液分離技術(shù)，包括離心和過(guò)濾技術(shù)，可供技術(shù)人員使用以進(jìn)行分離。優(yōu)選的分離固體細(xì)胞碎片和含維生素B12的液體的方法是超濾。
在本發(fā)明優(yōu)選方法中，在分離細(xì)胞和含維生素B12的液體后，沖洗裂開(kāi)的微生物細(xì)胞并且將洗出液與維生素B12合并。優(yōu)選地通過(guò)用去離子水滲濾實(shí)施沖洗，優(yōu)選去離子水用于沖洗裂開(kāi)的細(xì)胞。然后將含維生素B12的滲濾液與含維生素B12的液相合并。
在本發(fā)明優(yōu)選方法中，進(jìn)一步將含天然維生素B12的液相用于干燥處理。可以使用任何適當(dāng)?shù)母稍锓椒?，例如噴霧干燥，流體床干燥，冷凍干燥，或真空干燥。
在本發(fā)明優(yōu)選方法中，在進(jìn)行裂解前沖洗含維生素B12的微生物細(xì)胞，以通過(guò)除去培養(yǎng)基成份來(lái)進(jìn)一步增加干物質(zhì)中維生素B12的濃度。優(yōu)選地，優(yōu)選使用去離子水通過(guò)滲濾進(jìn)行所述沖洗。
另一方面，本發(fā)明提供在本發(fā)明的方法中得到的含維生素B12的組合物。優(yōu)選地，在這些組合物中的大部分維生素B12活性是以天然維生素B12的形式。本發(fā)明的組合物的特征在于維生素B12以大于0.1％(重量/重量)的濃度(基于干物質(zhì))存在。在本發(fā)明優(yōu)選的組合物中，維生素B12的濃度大于0.2％(重量/重量)，優(yōu)選地大于0.4％(重量/重量)，較優(yōu)選地大于0.6％(重量/重量)，更優(yōu)選地大于0.8％(重量/重量)，最優(yōu)選地大于1.0％(重量/重量)。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的維生素B12濃度不超過(guò)10％(重量/重量)，更優(yōu)選地維生素B12的濃度不超過(guò)5％(重量/重量)。本發(fā)明的組合物包含維生素B12和載體，該載體優(yōu)選地包含生物質(zhì)，例如整個(gè)細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。包含在這些組合物中的生物質(zhì)優(yōu)選地來(lái)自能夠合成維生素B12的微生物，例如上述的細(xì)菌，其中丙酸桿菌屬種類(lèi)是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是干燥的組合物，其中干燥定義為按重量比水含量小于15％，優(yōu)選地小于10％，更優(yōu)選地小于5％。
在本發(fā)明優(yōu)選的干燥組合物中，維生素B12活性基本上均勻地分布于含載體和維生素B12的粉末或顆粒狀粉末中。因此，有利的是這些組合物中的維生素B12不會(huì)較大程度地與組合物的其它成分分離，特別是在組合物加工過(guò)程中受到重力，篩分，風(fēng)篩或靜電力時(shí)，甚至在以大于0.1％(重量/重量)的濃度使用時(shí)。應(yīng)當(dāng)理解，此處加工包括將本發(fā)明的組合物加工成飼料和飼料預(yù)混合物。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的組合物可用作或用于動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)飼料添加劑產(chǎn)品。為此目的，將含維生素B12的組合物直接或以預(yù)混合物形式添加到其它飼料成分中，其中預(yù)混合物也包括其它維生素，礦物質(zhì)和/或生物活性成分。如具體實(shí)例中所示，喂給動(dòng)物含本發(fā)明組合物的食物可以促進(jìn)其生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的另一方面，含維生素B12的組合物可用作或用于人類(lèi)食品添加劑產(chǎn)品和/或摻入化妝品制品，如香波或浴液。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)維生素B12的檢測(cè)如美國(guó)藥典，國(guó)家配方，1995，第1719-1721頁(yè)，美國(guó)藥典條約，Inc.，Rockville MD中詳細(xì)描述的，基于乳乳桿菌ATCC 7830的生長(zhǎng)反應(yīng)，用比濁計(jì)生物分析法檢測(cè)維生素B12活性。血漿中B12的濃度使用商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的放射性分析試劑盒(Bio-Rad Laboratories Ltd，Hemel Hempstead，UK)測(cè)定血漿B12。在含二硫蘇糖醇和氰化物的溶液中將血漿樣品和維生素B12(57Co)混合。將混合物煮沸30分鐘使內(nèi)源結(jié)合蛋白失活并將各種形式的維生素B12轉(zhuǎn)變?yōu)榍桠挵匪?。使混合物冷卻，然后與固相的(與多聚體珠粒結(jié)合的)親和純化的豬內(nèi)因子混合。這可以將反應(yīng)混合物pH值調(diào)節(jié)和緩沖至9.35。然后將反應(yīng)混合物在室溫下溫育60分鐘。在溫育期間，內(nèi)源和標(biāo)記的維生素基于它們相對(duì)濃度競(jìng)爭(zhēng)有限的結(jié)合位點(diǎn)。然后將反應(yīng)混合物于1500g離心10分鐘。與固相結(jié)合蛋白結(jié)合的標(biāo)記和未標(biāo)記維生素以沉淀的形式集中在試管底部，未結(jié)合的維生素留在上清液中。吸出上清液并測(cè)定與沉淀相關(guān)的放射性活性。使用人血清白蛋白中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可確定血漿樣品中維生素B12的濃度。使用AssayZap通用分析計(jì)算機(jī)(2.32版本，Biosoft，Cambridge，UK)劃出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并確定未知濃度。
血漿樣品需稀釋10-50倍，使之處于檢測(cè)的最靈敏范圍內(nèi)。對(duì)照實(shí)施例1根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，用費(fèi)氏丙酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵(見(jiàn)例如Spalla等，1989，“維生素B12的微生物生產(chǎn)”，于維生素、色素和生長(zhǎng)因子的生物技術(shù)，E.J.Vandamme編輯，Elsevier，London，NewYork，第257-284頁(yè))。適當(dāng)?shù)馁M(fèi)氏丙酸桿菌菌株來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為ATCC 6207。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到含有10mg/l5’-脫氧腺苷鈷胺素效價(jià)和具7.5％干物質(zhì)含量的培養(yǎng)液。噴霧干燥該培養(yǎng)液得到具0.01％維生素B12濃度的產(chǎn)品。
為了獲得更高的維生素B12濃度，進(jìn)行培養(yǎng)液的固液分離。維生素B12在費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞內(nèi)，因此去除(細(xì)胞外)培養(yǎng)基成份和隨后生物質(zhì)的噴霧干燥將得到具較高維生素B12濃度的噴霧干燥產(chǎn)品。
在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上，以5000～6000xg的最大g力進(jìn)行離心步驟。這種g力與工業(yè)規(guī)模上所用離心機(jī)的離心力相同。將1000ml等分培養(yǎng)液在Beckmann JM/6E離心機(jī)中于5000rpm離心10分鐘。然而，在此條件下沒(méi)有得到生物質(zhì)和培養(yǎng)液的分離。
因?yàn)樵诠I(yè)規(guī)模上，由于經(jīng)濟(jì)因素，較高離心力更不受歡迎，所以我們測(cè)試使用超濾分離培養(yǎng)液中的液體和固體是否可行。
通過(guò)30kD AMICON旋轉(zhuǎn)纏繞元件(0.09m2)使用1巴的上樣壓對(duì)初始濃度為每升4.5mg維生素B12(干物質(zhì)中的維生素B12為0.02％)的2000ml培養(yǎng)液進(jìn)行超濾。在這樣的條件下可以使維生素B12樣品濃縮5倍。平均滲透流速是30l/m2h。濃縮液中維生素B12的濃度是20mg/l，而在透過(guò)液中可檢測(cè)到小于0.2mg/l的維生素B12。與超濾前的0.02％相比，以干物質(zhì)含量表達(dá)的濃縮液中維生素B12的濃度是0.05％。
為了進(jìn)一步增加維生素B12在干物質(zhì)中的效價(jià)，接下去我們對(duì)生物質(zhì)的滲濾進(jìn)行測(cè)試。
用去離子水對(duì)上述實(shí)驗(yàn)中得到的超濾濃縮液沖洗6次，得到20mg/l濃度的維生素B12效價(jià)。在滲濾液中沒(méi)有檢測(cè)到維生素B12活性。隨后濃縮液的噴霧干燥得到具0.06％維生素B12濃度的噴霧干燥產(chǎn)品。
我們從以上實(shí)驗(yàn)推斷，以來(lái)自具5-10mg/l維生素B12效價(jià)的培養(yǎng)液的干物質(zhì)為基礎(chǔ)，不可能得到維生素B12濃度大于0.06％的產(chǎn)品。實(shí)施例2
為了防止干燥產(chǎn)品中存在存活的生產(chǎn)有機(jī)體，即存治細(xì)胞，對(duì)如實(shí)施例1所述獲得的培養(yǎng)液于65℃進(jìn)行30分鐘巴氏滅菌步驟。如上所述對(duì)經(jīng)處理的培養(yǎng)液進(jìn)行超濾。
用0.2-0.4％的維生素B12濃度(按干物質(zhì))可觀察到粉紅色透過(guò)液。認(rèn)為巴氏滅菌法引起費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞(至少部分)的裂解，并使細(xì)胞內(nèi)的維生素B12釋放至培養(yǎng)基中。通過(guò)在噴霧干燥前混合透過(guò)液和經(jīng)巴氏滅菌的培養(yǎng)液，可以獲得含濃度范圍為0.06％至0.3％(基于干物質(zhì))的維生素B12的干燥產(chǎn)品。
更詳細(xì)地，將350ml經(jīng)熱處理的培養(yǎng)液在上面實(shí)施例1所述條件下超濾。濃縮液用2500ml去離子水滲濾。將澄清的粉紅色透過(guò)液和滲濾液合并并與750ml經(jīng)巴氏滅菌的超濾濃縮液混合。在實(shí)驗(yàn)室Buchi噴霧干燥器中噴霧干燥混合物，其中入口溫度設(shè)在180℃，出口溫度設(shè)在104℃。這樣得到的噴霧干燥產(chǎn)品的維生素B12濃度是0.13％。實(shí)施例3在實(shí)驗(yàn)工廠(chǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵中獲得1200ml含8mg/l維生素B12的培養(yǎng)液，并且使用20KD膜和38l/m2h的初始水流速度在DDS超濾元件M37中進(jìn)行超濾。超濾期間溫度保持在室溫。循環(huán)流速是大約15m3/h。上樣壓設(shè)為約7帕。培養(yǎng)液濃縮了11.5倍(平均流速23l/m2/h)。在室溫下用500升去離子水沖洗濃縮液直至達(dá)到約3mS/cm的傳導(dǎo)性。
在90℃處理所得濃縮液6小時(shí)。將部分經(jīng)熱處理的濃縮液滲濾，得到約300升含維生素B12的透過(guò)液。殘留物在4℃保存。
在真空下于40℃在玻璃蒸發(fā)器中以實(shí)驗(yàn)規(guī)模濃縮透過(guò)液，得到約6升濃縮液。
通過(guò)將適量的殘留物和濃縮的透過(guò)液混合構(gòu)成混合物，混合物在NIRO噴霧干燥器中噴霧干燥。入口空氣溫度設(shè)在160℃，出口溫度調(diào)整在約90-95℃。在5小時(shí)操作時(shí)間內(nèi)，大約45升混合物被噴霧干燥(約9kg/小時(shí))。這產(chǎn)生了1307g含1100mg/kg(即0.11％)維生素B12活性的噴霧干燥物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)例4在與實(shí)施例3中所述實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)中，使用改良的費(fèi)氏丙酸桿菌菌株CBS 929.97進(jìn)行發(fā)酵。得到的發(fā)酵培養(yǎng)液中的維生素B12濃度是40mg/l。超濾和滲濾基本上如實(shí)施例3所述的進(jìn)行。
使用超濾，將100升40mg/l的培養(yǎng)液濃縮至約40升。使用滲濾，用200升去離子水沖洗濃縮液。所得到的經(jīng)沖洗的濃縮液含有96.5mg/kg維生素B12活性和6.72％干物質(zhì)(經(jīng)沖洗的濃縮液的噴霧干燥將產(chǎn)生0.14％的維生素B12活性)。
隨后將已沖洗的濃縮液在90℃裂解5分鐘，接著通過(guò)超濾分離細(xì)胞碎片和液體。透過(guò)液的有效維生素B12濃度達(dá)到干物質(zhì)的0.87％(根據(jù)52.1mg/kg維生素B12活性和0.6％干物質(zhì)含量計(jì)算)。在真空于65℃預(yù)濃縮透過(guò)液后，將不同數(shù)量的透過(guò)液和濃縮液混合并干燥。所得到的干燥產(chǎn)物的維生素B12效價(jià)在下面給出濃縮液∶透過(guò)液 維生素B12活性(按干物質(zhì))1∶1 0.5％3∶7 0.65％2∶8 0.72％8∶2 0.29％1997年7月10日已將費(fèi)氏丙酸桿菌CBS 929.97保藏在真菌菌種保藏中心，Baarn，The Netherlands。實(shí)施例5天然維生素B12在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用用小雞進(jìn)行試驗(yàn)，比較天然維生素B12和氰鈷胺素的效力。將1日齡雄性小雞隨機(jī)分到籠中。每個(gè)籠中放8只動(dòng)物。將籠子放在人工加熱、通風(fēng)和照明的雞舍中。在1日和14日齡時(shí)接種抗New Castele病的疫苗。動(dòng)物從第1天開(kāi)始不限量地接受實(shí)驗(yàn)食物，前10天以碎屑形式，以后以塊狀形式。水可以自由得到。實(shí)驗(yàn)持續(xù)了28天。在第28天時(shí)，將動(dòng)物稱(chēng)重，確定飼料消費(fèi)量并抽取血樣。血樣從每籠隨機(jī)挑選的4只小雞中抽取。血樣收集在已加肝素的試管中。將試管離心并將血漿冷凍(-18℃)直到進(jìn)行維生素B12分析。如上所述在實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析(血漿B12的濃度)。
在此實(shí)驗(yàn)中包括3個(gè)處理I.沒(méi)有加維生素B12的基本食物II.添加了氰鈷胺素(30ppb活性物質(zhì))的基本食物III.添加了天然維生素B12(300ppb活性物質(zhì))的基本食物。
每個(gè)處理重復(fù)5次。
表1列出了基本食物的成分，表2為結(jié)果。表1 基本食物的成分(％)
*無(wú)維生素B12表2氰鈷胺和天然維生素B12對(duì)1至28日齡動(dòng)物的平均生長(zhǎng)、飼料攝入和飼料轉(zhuǎn)化率及第28日血漿維生素B12含量的影響。
實(shí)施例6維生素B12活性與載體的分離活性化合物與載體的分離可能由顆粒形狀，密度和體積密度，流動(dòng)性，粘附和靜電特征，含水量和吸濕性引起。在預(yù)混合物和復(fù)合物飼料的生產(chǎn)期間和隨后的運(yùn)輸和貯存期間可能發(fā)生這種分離過(guò)程。
這種分離在預(yù)混合物中尤為關(guān)鍵，其中預(yù)混合物包含諸如維生素和微量元素的微量成分和諸如礦物質(zhì)和載體的大量成分。
將現(xiàn)有商品氰鈷胺素制品(從Rhone Poulenc獲得，商標(biāo)名為MicrovietB12)的反混合特性與如實(shí)施例4所述制備的天然維生素B12制品進(jìn)行比較。
石灰?guī)r在現(xiàn)有商品氰鈷胺素制品中用作載體。
如

圖1所示，試驗(yàn)物質(zhì)通過(guò)振動(dòng)槽從貯存容器中流出形成堆。
從中心抽取3個(gè)樣品并混合。用來(lái)自堆底的樣品重復(fù)此程序。如上所述分析樣品的維生素B12活性并與最初的均勻混合物比較。如下計(jì)算樣品與最初均勻混合物的偏差。
權(quán)利要求
1.一種制備天然維生素B12的方法，該方法包括(a)在一定條件下培養(yǎng)微生物細(xì)胞使之在細(xì)胞內(nèi)合成天然維生素B12；并且(b)裂解或破裂已合成天然維生素B12的微生物細(xì)胞的外膜以便釋放維生素B12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中裂解產(chǎn)生溶菌產(chǎn)物，并且分離溶菌產(chǎn)物的固相和液相，液相包含天然維生素B12。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括沖洗溶菌產(chǎn)物的固相并將洗出液和溶菌產(chǎn)物液相混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中溶菌產(chǎn)物固相的沖洗通過(guò)滲濾實(shí)施。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將至少部分溶菌產(chǎn)物的固相添加到含天然維生素B12的液相中。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在裂解前沖洗微生物細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中裂解前微生物細(xì)胞的沖洗通過(guò)滲濾實(shí)施。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括干燥含天然維生素B12的液相。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中微生物細(xì)胞是來(lái)自1個(gè)或多個(gè)以下菌屬的細(xì)胞醋酸桿菌屬，氣桿菌屬，土壤桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，節(jié)桿菌屬，固氮菌屬，芽孢桿菌屬，梭菌屬，棒桿菌屬，埃希氏菌屬，真桿菌屬，黃桿菌屬，甲烷桿菌屬，甲烷八疊球菌屬，分枝桿菌屬，丙酸桿菌屬，變形菌屬，假單胞菌屬，根瘤菌屬，紅假單胞菌屬，沙門(mén)氏菌屬，沙雷氏菌屬，鏈球菌屬，鏈霉菌屬和黃單胞菌屬。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中微生物細(xì)胞是細(xì)菌屬丙酸桿菌屬的細(xì)胞。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中裂解由熱處理、巴氏滅菌法、用溶菌酶處理、機(jī)械破碎或化學(xué)處理單獨(dú)或相互結(jié)合引起。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至11中任何一項(xiàng)所述的方法，其中溶菌產(chǎn)物的固相和液相的分離通過(guò)超濾或微量過(guò)濾實(shí)施。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中天然維生素B12是5′-脫氧腺苷鈷胺素或甲基鈷胺素。
14.基于組合物的干物質(zhì)含量以超過(guò)0.1％的重量比含有天然維生素B12的組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，可通過(guò)權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的方法得到。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的組合物是干燥的組合物，其中天然維生素B12基本上均勻分布于整個(gè)組合物中，并且當(dāng)受到篩分、風(fēng)篩、重力或靜電力影響時(shí)，維生素B12不與其它成分分離。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任何一項(xiàng)所述的組合物，包含生物質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中生物質(zhì)來(lái)自單個(gè)或混合兩個(gè)或多個(gè)如下細(xì)菌屬的細(xì)菌醋酸桿菌屬，氣桿菌屬，土壤桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，節(jié)桿菌屬，固氮菌屬，芽孢桿菌屬，梭菌屬，棒桿菌屬，埃希氏菌屬，真桿菌屬，黃桿菌屬，甲烷桿菌屬，甲烷八疊球菌屬，分枝桿菌屬，丙酸桿菌屬，變形菌屬，假單胞菌屬，根瘤菌屬，紅假單胞菌屬，沙門(mén)氏菌屬，沙雷氏菌屬，鏈球菌屬，鏈霉菌屬和黃單胞菌屬。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中細(xì)菌屬是丙酸桿菌屬。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中天然維生素B12是5′-脫氧腺苷鈷胺素或甲基鈷胺素。
21.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任何一項(xiàng)所述的組合物在食品添加劑生產(chǎn)中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任何一項(xiàng)所述的組合物在化妝制品生產(chǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供制備含天然維生素B12的組合物的方法,其中所述方法包括以下步驟:a)獲取含天然維生素B12的微生物細(xì)胞,b)使微生物細(xì)胞裂開(kāi),導(dǎo)致含維生素B12的細(xì)胞的至少部分可溶成分釋放到包含這些細(xì)胞的液體中,c)分離裂開(kāi)的細(xì)胞和含維生素B12的液體,d)制備維生素B12和至少一部分裂開(kāi)細(xì)胞的混合物,其中混合物含有干物質(zhì)濃度超過(guò)0.1%(重量/重量)的維生素B12。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1229440SQ97197234
公開(kāi)日1999年9月22日 申請(qǐng)日期1997年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月12日
發(fā)明者H·L·比爾 申請(qǐng)人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司