羥芐絲肼及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供羥芐絲肼及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用，所述羥芐絲肼的化學(xué)式為：羥芐絲肼為一種現(xiàn)有藥物，其毒理藥理相對比較清晰；研發(fā)成本低，推廣應(yīng)用價值大；羥芐絲肼可以抑制黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌的腫瘤細胞的活性，特別適合結(jié)腸癌和人惡性黑素瘤的治療。
【專利說明】
羥芐絲肼及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及羥芐絲肼及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用，屬 于抗腫瘤藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 羥芐絲肼又稱三羥基絲氨酰肼、色拉肼，是一種外周多巴脫羧酶抑制劑。羥芐絲肼 藥理作用與卡比多巴類似，不易透過血-腦脊液屏障，多用于帕金森病和帕金森綜合征的治 療，其有效的血藥濃度為2.64~4.46μg/ml (9~15.2μΜ)。羥芐絲肼常用于震顫麻痹，多與左 旋多巴合用。口服吸收快，吸收率約58%，在腸內(nèi)代謝，由尿排泄，12小時排泄約90%，一般 羥芐絲肼與左旋多巴按1:4配比應(yīng)用。
[0003] 近年來，隨著人們生活水平的提高，人們的生活習(xí)慣及生活環(huán)境等也發(fā)生了變化。 高脂飲食、吸煙、電離輻射、空氣污染、砷和其他職業(yè)因素等導(dǎo)致腫瘤的發(fā)病率逐年上升，尤 其是黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌近50年來的發(fā)病率和死亡率均明顯增高。
[0004] 黑色素瘤是由異常黑素細胞過度增生引發(fā)的常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占 皮膚腫瘤死亡病例的極大部分。多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見于軟腦膜和脈絡(luò)膜， 是全球性疾病，發(fā)病率逐年增加，每年有十余萬新診斷病例。該腫瘤擴散迅速，危害程度高， 預(yù)后大多很差，因此早期診斷和及時正確治療十分重要。
[0005] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均 占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。
[0006] 結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界 處，以40~50歲年齡組發(fā)病率最高，男女之比為2~3:1。發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位。結(jié)腸 癌發(fā)病的主要原因是高脂肪食譜和纖維素攝入不足。結(jié)腸的慢性炎癥使結(jié)腸癌的發(fā)生率比 一般人群高。有結(jié)腸息肉者，結(jié)腸癌發(fā)病率是無結(jié)腸息肉者的5倍。家族性多發(fā)性腸息肉瘤， 癌變的發(fā)生率更高。遺傳因素可能也參與結(jié)腸癌的發(fā)病。
[0007] 鑒于以上3種腫瘤的高發(fā)病率及嚴重危害性，所以近年來，黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌 受到了社會及人們的廣泛關(guān)注，對于黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌的藥物治療研究成為了一個研 究熱點，及時挖掘出一個對黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌有良好防治效果的藥物至關(guān)重要，對于 保障患者的生命健康具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，羥芐絲肼為一種現(xiàn)有的治療震顫麻痹的藥物，本發(fā)明 發(fā)現(xiàn)該藥物可以抑制腫瘤細胞的活性，可用于制備抗腫瘤藥物。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，提供羥芐絲肼及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物 方面的應(yīng)用，所述羥芐絲肼的化學(xué)式為：
[0010]
[0011] 進一步地，所述腫瘤為黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌。
[0012] 進一步地，所述腫瘤為黑素瘤。
[0013]進一步地，所述腫瘤為結(jié)腸癌。
[0014] 進一步地，所述抗腫瘤藥物由活性成分和必要的輔料組成，所述活性成分為羥芐 絲肼或/和羥芐絲肼在藥學(xué)上可接受的鹽。
[0015] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，羥芐絲肼能夠抑制各種腫瘤細胞的活性，可以抑制惡性黑色素 瘤、肺癌、結(jié)腸癌等細胞的增殖、侵襲、迀移及腫瘤的生長，特別適合用于人惡性黑素瘤、結(jié) 腸癌。
[0016] 本發(fā)明首先采用酪氨酸激酶活性抑制體外篩選試驗(ELISA法)初步篩選出羥芐絲 肼對黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌防治作用的分子機制，再分別采用MTS法檢測羥芐絲肼對細胞 增殖的影響、Transwell實驗檢測羥芐絲肼對細胞侵襲的影響、劃痕實驗檢測羥芐絲肼對細 胞迀移的影響、Western Blot檢測羥芐絲肼對人惡性黑素瘤SK-mel-28細胞凋亡相關(guān)信號 通路蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量的羥芐絲肼（IOuM)能夠抑制黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸 癌細胞的增殖、侵襲及迀移，并且通過VEGFR-3、PDGFR-β、C-Ki t、ErbB2、ABL等分子機制起作 用，同時羥芐絲肼能夠逆轉(zhuǎn)惡性黑色素瘤的耐藥性，對耐藥性黑素瘤也有防治效果。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是，羥芐絲肼為一種現(xiàn)有藥物，其毒理藥理相對比較清晰;研發(fā) 成本低，推廣應(yīng)用價值大;羥芐絲肼可以抑制黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌的腫瘤細胞的活性，特別 適合人惡性黑素瘤的治療。
【附圖說明】
[0018] 圖Ia表示不同濃度的羥芐絲肼在不同時間對人惡性黑素瘤A375細胞增殖的抑制 作用；圖Ib表示不同濃度的羥芐絲肼在不同時間對肺癌A549細胞增殖的抑制作用；圖Ic表 示不同濃度的羥芐絲肼在不同時間對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖的抑制作用；圖Id表示不同濃 度的羥芐絲肼在不同時間對人惡性黑素瘤SK-mel-28細胞增殖的抑制作用；圖Ie表示不同 濃度的羥芐絲肼在不同時間對人惡黑耐藥株RA細胞增殖的抑制作用；
[0019] 圖If表示不同濃度維羅非尼能夠抑制人惡性黑素瘤A375細胞的增殖；圖Ig表示與 圖If相比較，不同濃度維羅非尼對人惡黑耐藥株RA的增殖無明顯抑制作用，從而進一步驗 證RA的耐藥性。
[0020] 圖2a-2表示實驗組，即低劑量的羥芐絲肼（IOuM)抑制人惡性黑素瘤A375細胞的侵 襲(處理24h)的顯微鏡圖片；圖2a-l表示為圖2a-2的對照組實驗，即羥芐絲肼為OuM;圖2a-3 表示圖2a_l和圖2a_2圖中細胞數(shù)量的柱狀圖；
[0021] 圖2b-2表示實驗組，即低劑量的羥芐絲肼（IOuM)抑制肺癌A549細胞的侵襲(處理 24h)的顯微鏡圖片；圖2b-l表示為圖2b-2的對照組實驗，即羥芐絲肼為OuM;圖2b-3表示圖 2b-l和圖2b-2圖中細胞數(shù)量的柱狀圖；
[0022]圖2c-2表示實驗組，即低劑量的羥芐絲肼（IOuM)抑制結(jié)腸癌HCTl 16細胞的侵襲 (處理24h)的顯微鏡圖片；圖2c-l表示為圖2c-2的對照組實驗，即羥芐絲肼為OuM;圖2c-3表 示圖2c-l和圖2c-2圖中細胞數(shù)量的柱狀圖；
[0023]圖2d-2表示實驗組，即低劑量的羥芐絲肼（IOuM)抑制人惡性黑素瘤SK-mel-28細 胞的侵襲(處理24h)的顯微鏡圖片；圖2d-2表示為圖2d-l的對照組實驗，即羥芐絲肼為OuM; 圖2d-3表示圖2d-l和圖2d-2圖中細胞數(shù)量的柱狀圖；
[0024]圖2a_2d系列（注:①n = 3，各實驗組與對照組比較，#*P〈0.001;②各圖結(jié)晶紫染 色圖片顯微鏡倍數(shù)為X100;③各柱形圖的橫坐標表示濃度，縱坐標表示細胞數(shù)量）
[0025] 圖3a表示ΙΟμΜ羥芐絲肼在不同時間對A375細胞迀移的抑制作用；圖3b表示ΙΟμΜ羥 芐絲肼在不同時間對Α549細胞迀移的抑制作用；圖3c表示ΙΟμΜ羥芐絲肼在不同時間對 HCT116細胞迀移的抑制作用；圖3d表示ΙΟμΜ羥芐絲肼在不同時間對SK-mel-28細胞迀移的 抑制作用；圖3e表示ΙΟμΜ輕芐絲肼在不同時間對RA細胞迀移的抑制作用。
[0026] 圖4表示W(wǎng)estern Blot檢測羥芐絲肼對SK-mel-28細胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白的 表達。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0028] 實驗材料
[0029] 細胞系：人惡性黑素瘤A375、SK-mel-28、SK-mel-5細胞株;肺癌A549細胞株;結(jié)腸 癌HCTl 16細胞株;惡黑耐藥株RA。
[0030] 羥芐絲肼（編號B101489,純度彡98%)購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司， PBS溶解至相應(yīng)濃度母液于-20 °C保存。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國 Hyclone公司，抗PARP購自Cell Signaling Technology?？笹APDH抗體購自 Santa公司?；|(zhì) 膠Matrigel購自美國BD公司。C〇2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。倒置顯微鏡購自日本 Olympus公司。臺式離心機購自美國BECKMAN公司。
[0031] 實驗方法
[0032] 1、細胞培養(yǎng):A375、SK-mel-28、SK-mel-5、A549、HCT116 均用含 10 % 胎牛血清的 DMEM，耐藥株RA用含2μΜ維羅非尼、10 %胎牛血清的DMEM，常規(guī)37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 取對數(shù)生長期細胞進行試驗。
[0033] 2、MTS法檢測羥芐絲肼對細胞增殖的影響：分試驗組和對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。試 驗組加入羥芐絲肼原液（IOmM)，終濃度分別為10μΜ、20μΜ、50μΜ，對照組加等量的I3BS。分別 于24、48、72h加入MTS并于培養(yǎng)箱孵育2h，然后酶標儀檢測490nm波長下的各孔吸光度值 (OD)0
[0034] 3、Transwe 11實驗檢測輕節(jié)絲肼對細胞侵襲的影響：用24孔Transwe 11小室，按說 明書方法進行。每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗組細胞分別加入含ΙΟμΜ羥芐絲肼的培養(yǎng)液，對照組加 等量PBS。下室按600μ1/孔加入趨化液(DMEM+20%FBS)。置于培養(yǎng)箱中孵育24h。倒置顯微鏡 下觀察穿膜細胞數(shù)。于100倍光鏡下分別選取5個視野(上、下、左、右和中間）照相，計數(shù)。
[0035] 4、劃痕實驗檢測羥芐絲肼對細胞迀移的影響：分別將各細胞(5X 105/ml)接種到6 孔板，每孔500μ1，于培養(yǎng)箱中孵育。待細胞生長至70~80%，用200微升的槍頭垂直孔板輕 輕直線刮除細胞，PBS緩沖液沖洗2次，除去所刮除細胞及細胞碎片。實驗組分別加入含ΙΟμΜ 羥芐絲肼的培養(yǎng)液，對照組加等量PBS。倒置顯微鏡下觀察，100倍光鏡下照相。繼續(xù)于培養(yǎng) 箱孵育24h、48h，倒置顯微鏡下觀察，100倍光鏡下照相，計數(shù)各組劃痕部位迀移來的細胞 數(shù)。
[0036] 5、Western Blot分析：分別用ΙΟμΜ輕芐絲肼處理SK-mel-28細胞6h、12h、24h、48h， 對照組加等量的I3BS。收集細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30min，提取蛋白，后用Western Blot檢測蛋白表達情況。
[0037] 6、統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用 t檢驗。各組與對照組比較，P〈0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。
[0038] 實驗結(jié)果
[0039] -、酪氨酸激酶活性抑制體外篩選試驗(ELI SA法)初步篩選出羥芐絲肼對黑色素 瘤、肺癌、結(jié)腸癌防治作用的分子機制
[0040] 表1表示酪氨酸激酶活性抑制體外篩選試驗(ELISA法)初步篩選出羥芐絲肼對黑 色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌防治作用的分子機制。當抑制率多50%時表示藥物有效，從表1中可以 看出低劑量的羥芐絲肼（IOuM)能夠抑制酪氨酸激酶VEGFR-3、roGFR-f3、C-Kit、ErbB2、ABI^ 活性。
[0041 ]表1酪氨酸激酶活性抑制體外篩選試驗
[0045] 注：SUl1248，BIBW2992，Dasatinib，AEW541，PD173074，Ibrutinib，PF562271， ABT860等為各激酶的抑制劑。
[0046] 其中，篩選方法:酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA);酪氨酸激酶:酶譜;作用時間：Ih;結(jié) 果評定:無效：1〇μΜ〈50 %，有效：ΙΟμΜ彡50 %。
[0047]二、MTS檢測不同濃度羥芐絲肼對各細胞增殖的抑制作用
[0048] 羥芐絲肼能夠抑制人惡性黑素瘤Α375、SK-mel-28細胞，肺癌Α549細胞，結(jié)腸癌 HCT116細胞及惡黑耐藥株RA細胞的增殖（圖Ia-圖Ie)。羥芐絲肼分別在ΙΟμΜ~50μΜ濃度范 圍內(nèi)對六375、31(1161-28、六549、!1(：1'116、1^細胞活性抑制作用呈量效關(guān)系，在0~7211內(nèi)呈時 效關(guān)系。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈〇.05)。
[0049] 圖13-圖]^中，各濃度組與對照組比較，*表示？〈0.05，**表示？〈0.01，***表示卩〈 O-OOl0
[0050]三、Transwell實驗檢測羥芐絲肼對各細胞侵襲的影響
[0051 ] 如圖2a_圖2d所示，從柱形圖上可以看出，相對于對照組(OuM)，經(jīng)濃度為ΙΟμΜ輕芐 絲肼處理Α375、SK-mel-28、A549、HCT116細胞24h，實驗組細胞侵襲數(shù)量低于對照組，差異有 統(tǒng)計學(xué)意義(#撲〈0.001)，說明一定濃度的羥芐絲肼能抑制4375、31(1161-28^549、!1(：1'116 細胞侵襲（圖2a-圖2d)。各柱形圖顯示，其中，抑制結(jié)腸癌HCT116細胞的效果最好，其次為人 惡性黑素瘤A375細胞。
[0052] 四、劃痕實驗檢測羥芐絲肼對各細胞迀移的影響
[0053] 經(jīng)終濃度為ΙΟμΜ羥芐絲肼分別處理六375、31(1161-28、4549、!1(：1'116、1^細胞2411、 48h后，實驗組細胞迀移能力低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*Ρ〈0.05)，說明一定濃度的羥 芐絲肼能抑制Α375、SK-mel-28、Α549、HCT116、RA細胞迀移（圖3a-圖3e)。
[0054] 五、Western Blot檢測輕節(jié)絲肼對SK-mel-28細胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白的表達 [0055]用1(^]\1輕芐絲肼處理51(1161-28細胞611、1211、2411、4811，168七6?181(^結(jié)果顯示51(-mel-28細胞PARP在48h時出現(xiàn)切割，GATOH為內(nèi)參照（圖4)。即低劑量的羥芐絲肼（IOuM)可以 上調(diào)PARP的裂解片段表達，引起細胞凋亡的發(fā)生。
【主權(quán)項】
1. ?節(jié)絲阱及其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用，所述徑節(jié)絲阱的 化學(xué)式為：2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為黑素瘤。4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為人惡性黑素瘤。5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為結(jié)腸癌。6. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物由活性成分和必要的輔料組 成，所述活性成分為徑節(jié)絲阱或/和徑節(jié)絲阱在藥學(xué)上可接受的鹽。
【文檔編號】A61P35/04GK106074474SQ201610422044
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610422044.2, CN 106074474 A, CN 106074474A, CN 201610422044, CN-A-106074474, CN106074474 A, CN106074474A, CN201610422044, CN201610422044.2
【發(fā)明人】陳翔, 彭聰, 黃遵南, 周優(yōu)優(yōu)
【申請人】中南大學(xué)湘雅醫(yī)院