刺五加組合物及其相關(guān)應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，本發(fā)明提供一種有效成分組成及其含量明確的刺五加組合物，所述刺五加組合物中含有原兒茶酸、綠原酸、刺五加苷B和刺五加苷E。所述的刺五加組合物，其中原兒茶酸：綠原酸：刺五加苷B：刺五加苷E的重量比為10?20：300?400：80?120：60?80。
【專利說明】
刺五加組合物及其相關(guān)應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及刺五加組合物及其相關(guān)應(yīng)用，屬于中藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥刺五加為五加科（Aral iaceae)五加屬（Acanthopanax)灌木植物刺五加 (Acanthopanax senticosus(Rupr · et Maxim. )Harms ·)的根、根莖和莖，廣泛分布于亞洲的 俄羅斯遠東針葉林帶，中國東北、河北及山西，日本和朝鮮的北方地區(qū)均有分布。在明朝李 時珍《本草綱目》稱刺五加，以五葉交加這良，故名五加，又名五花。五加治風濕，壯筋骨，其 功良深，寧得一把五加，不用金玉滿車，又"文章作酒，能成其味，以金買草，不言其貴"之說， 對五加做了很高的贊譽。該藥性溫，味辛、微苦，無毒，入脾腎經(jīng)，具補中，益精，堅精骨，強意 志等功效。主要應(yīng)用于脾肺氣虛證、腎虛腰膝酸痛、心脾不足，失眠、健忘等癥狀。刺五加含 有多種糖苷，為主要有效成分，還含有多糖、異秦皮定、綠原酸、芝麻素、硬脂酸、谷甾醇、 白樺脂酸、苦杏仁苷等。因其明顯的藥理作用，繼而被廣泛應(yīng)用于臨床。自1950年代以來，從 草本考證、資源分布、引種繁殖、生藥鑒定、化學成分、生化藥理、制劑生產(chǎn)及臨床等各方面 進行了有計劃的研究工作，對刺五加的活性物質(zhì)及其藥理作用做了深入研究。近年來，更是 對其做了多方位的研究，并進一步推進了刺五加在醫(yī)藥及其他方面的多方位多層次應(yīng)用。
[0003] 在刺五加相關(guān)藥物制劑中，以刺五加注射液應(yīng)用較廣。其為刺五加經(jīng)提取加工制 成的滅菌水溶液，有平補肝腎，益精壯骨之功能，主治短暫性腦缺血發(fā)作，腦動脈硬化，腦血 栓形成，腦栓塞等?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)刺五加具有神經(jīng)保護、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)等藥 理作用。文獻報道刺五加對缺血缺氧性腦損傷神經(jīng)元損傷有保護作用，對大鼠急性缺血再 灌注視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有保護作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種有效成分組成及其含量明確的刺五加組合物，所述 刺五加組合物中含有原兒茶酸、綠原酸、刺五加苷Β和刺五加苷Ε。
[0005] 在一個實施方案中，所述的刺五加組合物，其中原兒茶酸:綠原酸:刺五加苷Β:刺 五加苷 Ε 的重量比為 10-20:300-400:80-120:60-80。
[0006] 在另一個實施方案中，所述的刺五加組合物，其中原兒茶酸:綠原酸:刺五加苷Β: 刺五加苷 Ε 的重量比為 16 · 6-18 · 4:33 · 67-37 · 5:98 · 4-114 · 7:70 · 9-75 · 6。
[0007] 在本發(fā)明的另一個目的是提供包含所述刺五加組合物的藥物制劑，其由所述組合 物和藥學上可接受的輔料制備成的藥物制劑，所述制劑優(yōu)選為注射劑。
[0008] 在一個實施方案中，所述注射劑所選用的輔料選自水、蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二 氫鈉、氯化鈉、維生素 C和枸櫞酸中一種或兩種以上。
[0009] 本發(fā)明的目的之三是提供所述刺五加組合物在制備治療心腦血管疾病藥物中的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的之四是提供所述刺五加組合物的制備方法，具體步驟如下：
[0011] (1)取刺五加藥材，粉碎過篩，以8-12倍量的水回流提取三次，每次1-2小時，過濾 合并濾液，加乙醇至含醇量至85%，靜置12小時，過濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/5;
[0012] (2)采用乙醇/鹽雙水相萃取方法對濃縮濾液進行萃取，收集乙醇相，減壓蒸餾，真 空干燥，即得。
[0013] 在一個實施方案中，所述乙醇/鹽雙水相為無水乙醇、無機鹽和水組成，所述無水 乙醇、無機鹽和水與濃縮濾液的重量比為2:0.4:2.5:1。
[0014] 在另一個實施方案中，所述無機鹽為磷酸二氫鉀和碳酸鈉，所述磷酸二氫鉀和碳 酸鈉的重量比為2:1。
【具體實施方式】
[0015] 還可進一步通過實施例來理解本發(fā)明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方 法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進一步開發(fā)的本發(fā)明的變 化被認為落入本文中描述的和以下要求保護的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0016] 實施例1刺五加組合物制備
[0017] (1)取刺五加藥材100g，粉碎過篩，以10倍量的水回流提取三次，每次1小時，過濾 合并濾液，加乙醇至含醇量至85%，靜置12小時，過濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/5;
[0018] (2)采用乙醇/鹽雙水相萃取方法對濃縮濾液進行萃取，具體為向步驟1獲得的濃 縮濾液中，加入乙醇、無機鹽和水以形成乙醇/鹽雙水相系統(tǒng)，混勻靜置分層，收集乙醇相， 減壓蒸餾，真空干燥，即得。
[0019] 乙醇/鹽雙水相為無水乙醇、無機鹽和水組成，所述無水乙醇、無機鹽和水與濃縮 濾液的重量比為2:0.4:2.5:1。所述無機鹽為磷酸二氫鉀和碳酸鈉，所述磷酸二氫鉀和碳酸 鈉的重量比為2:1。
[0020] 采用HPLC方法對制備得到的刺五加組合物進行檢測，結(jié)果表明所述刺五加組合物 中原兒茶酸、綠原酸、刺五加苷B和刺五加苷E的含量分別為17.6mg/g、35.4mg/g、108.6mg/g 和72.9mg/g〇
[0021 ]實施例2刺五加組合物對PC12細胞的缺氧缺糖模型的保護作用 [0022] PC12細胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤神經(jīng)細胞株）用含10%小牛血清的DMEM液 培養(yǎng)，接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 °C、95 % 02和5 % C02條件下培養(yǎng)至細胞鋪滿單層。實驗分 組:正常對照組，持續(xù)通以95 % 02和5 % C02的混合氣;第二組為缺糖缺氧(0GD)模型組:神經(jīng) 細胞移去正常培養(yǎng)液，換入不含葡萄糖的HBSS溶液（140mM NaCl，3.5mM KCl，12mM MgS〇4， 5mM NaHC03，1.7mM CaCl2,0.4mM KH2P〇4，10mM Hepes),放入專用的缺氧罐，通以95%N2和 5%C02的混合氣，缺糖缺氧6h;治療組，PC12細胞用包含不同藥物組合物的10%小牛血清的 DMEM液預(yù)處理24h后，細胞再經(jīng)上述0GD模型6h。
[0023]各給藥組組合物制備方法如下：
[0024]給藥組1:參見本發(fā)明實施例1
[0025] 給藥組2:參見專利CN201410508745說明書中的實施例1
[0026] 給藥組3:參見專利CN200710117640說明書中的實施例1
[0027]給藥組4:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于使用的乙醇/鹽雙水相存在區(qū)別，具體 是無機鹽僅為磷酸二氫鉀，重量配比不變
[0028] 給藥組5:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于使用的乙醇/鹽雙水相存在區(qū)別，具體 是所述無水乙醇、無機鹽和水與濃縮濾液的重量比為2:0.6:2.5:1，其他均同實施例1
[0029] MTT法測定各組PC12細胞活性(0D590nm)
[0030]
[0031 ] 經(jīng)Oneway-ANOVA檢驗，##表示與正常組相比Ρ〈0 · 01; *和**表示與模型組相比，P〈 0.05和P〈0.01 Γ ~表示與模型組或其他給藥組相比P〈0.01。
[0032] 采用LDH生化試劑盒檢測各組細胞上清液中LDH含量，具體結(jié)果如下：
[0033]
[0034]
[0035] 經(jīng)Oneway-ANOVA檢驗，##表示與正常組相比P〈0 · 01 和**分別表示與模型組相 比，P〈0.05和P〈0.01 Γ ~表示與模型組或其他給藥組相比P〈0.01。
[0036] 實施例3刺五加組合物注射劑制備
[0037]將實施例1制備的刺五加提取物，加滅菌水溶解混勻，調(diào)pH值至6.0;過0.22微米濾 膜，滅菌灌裝即得(每瓶刺五加組合物規(guī)格5mg/ml)。
[0038] 實施例4刺五加組合物制劑對大鼠 MCA0再灌注模型的腦保護作用
[0039] 模型制備
[0040] SD大鼠，禁食過夜，自由飲水。實驗當天用異氟烷氣體麻醉并維持。仰臥位固定，沿 頸正中線切開皮膚，暴露右側(cè)頸總動脈，小心分離頸總動脈分叉至顱底部的血管周圍的神 經(jīng)及筋膜，分離頸外動脈分支枕動脈、甲狀腺上動脈、舌動脈和上顎上頌動脈，結(jié)扎，剪斷。 從頸外動脈游離端插入3#絲線(直徑0.260mm)，從頸外動脈遠心端將尼龍線導入到頸內(nèi)動 脈，插至Wi 1 1 is環(huán)大腦中動脈處，以有效阻斷大腦中動脈，插入的尼龍線長度距頸總動 脈分叉處18~20mm。然后將頸外動脈游離端連同腔內(nèi)尼龍線一并結(jié)扎，以防出血。逐層縫合 皮下筋膜和皮膚，肌肉注射青霉素防止感染。假手術(shù)組動物僅分離出頸內(nèi)動脈。MCAO后2h小 心抽出頸內(nèi)動脈血管腔內(nèi)的尼龍線使頸內(nèi)動脈再灌注，lOmin后進行神經(jīng)缺陷評分，有明顯 神經(jīng)功能缺陷者(>8分)為造型成功。
[0041 ]分組及給藥
[0042]具體分為假手術(shù)組、模型組及給藥組。采用尾靜脈輸注給藥的方式給藥，給藥體積 以最大給藥體積計算，即均定容成2.251111/10(^(大鼠體重），輸注時間12〇1]1；[11，每天一次，連 續(xù)3天，各給藥組劑量相當于12.5mg/kg。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水。
[0043]神經(jīng)功能缺陷評分
[0044] 分別于治療前、治療后，根據(jù)附表評分標準，采用盲法對動物進行神經(jīng)功能缺陷評 分，用于評價神經(jīng)功能損害程度，總分為16分，分數(shù)越高，表明動物神經(jīng)功能損害程度越嚴 重。
[0045] MCAO/R大鼠神經(jīng)功能損害程度評分標準
[0046]
[0047] 具體結(jié)果如下：
[0048]
[0049]對比例1為專利CN201410508745說明書中的實施例1方法制備的刺五加注射液，單 日給藥劑量同實施例3組，12.5mg/kg/D
[0050] 對比例2為注射劑制備方法同實施例3，其中刺五加組合物制備方法同實施例2中 的給藥組4，單日給藥劑量同實施例3組，12.5mg/kg/D
[0051] 對比例3為注射劑制備方法同實施例3，其中刺五加組合物制備方法同實施例2中 的給藥組5，單日給藥劑量同實施例3組，12.5mg/kg/D
[0052] 腦梗死范圍測定
[0053] 實驗結(jié)束后取腦，沿冠狀面切成2mm厚的切片，間隔取上述一半腦片放入2%TTC染 液中，避光37°C溫孵lOmin進行染色，采用C00LPIX955數(shù)碼相機成像系統(tǒng)將數(shù)字影象存儲于 計算機中，并用圖象分析系統(tǒng)v4.0軟件測量梗死區(qū)和全腦面積，計算腦梗死范圍（梗死區(qū)面 積占全腦面積百分比），具體結(jié)果如下：
[0054]
[0055]抗氧化指標測定
[0056] 取各組大鼠腦梗死區(qū)邊緣腦組織適量，勻漿提取蛋白，然后采用ELISA試劑盒檢測 GSH-px和MDA含量，具體結(jié)果如下：
[0057]
[0058] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權(quán)項】
1. 一種有效成分組成及其含量明確的刺五加組合物，所述刺五加組合物中含有原兒茶 酸、綠原酸、刺五加苷B和刺五加苷E。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺五加組合物，其特征在于，所述的刺五加組合物，其中原兒 茶酸:綠原酸:刺五加苷B:刺五加苷E的重量比為10-20:300-400:80-120:60-80。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺五加組合物，所述的刺五加組合物，其中原兒茶酸:綠原酸： 刺五加苷B:刺五加苷E的重量比為16.6-18.4:33.67-37.5: 98.4-114.7:70.9-75.6〇4. 一種包含權(quán)利要求1-3任一項所述刺五加組合物的藥物制劑，其由所述組合物和藥 學上可接受的輔料制備成的藥物制劑，所述制劑為注射劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，所述注射劑所選用的輔料選自水、蔗糖、磷酸氫二 鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、維生素 C和枸櫞酸中一種或兩種以上。6. 權(quán)利要求1-3任一項所述刺五加組合物在制備治療心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。7. -種制備權(quán)利要求1-3任一項所述刺五加組合物的制備方法，具體步驟如下： (1) 取刺五加藥材，粉碎過篩，以8-12倍量的水回流提取三次，每次1-2小時，過濾合并 濾液，加乙醇至含醇量至85%，靜置12小時，過濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/5; (2) 采用乙醇/鹽雙水相萃取方法對濃縮濾液進行萃取，收集乙醇相，減壓蒸餾，真空干 燥，即得。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述乙醇/鹽雙水相為無水乙醇、無機 鹽和水組成，所述無水乙醇、無機鹽和水與濃縮濾液的重量比為2:0.4:2.5:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述無機鹽為磷酸二氫鉀和碳酸鈉， 所述磷酸二氫鉀和碳酸鈉的重量比為2:1。
【文檔編號】A61K31/7034GK106038580SQ201610648413
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月9日 公開號201610648413.X, CN 106038580 A, CN 106038580A, CN 201610648413, CN-A-106038580, CN106038580 A, CN106038580A, CN201610648413, CN201610648413.X
【發(fā)明人】方同華, 徐秀杰, 賈文娟, 周廣紅, 王維龍, 王博
【申請人】哈爾濱珍寶制藥有限公司