用于治療白血病的聯(lián)合用藥物及其在治療白血病中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，公開了一種用于治療白血病的聯(lián)合用藥物及其在治療白血病中的應(yīng)用。本發(fā)明將組蛋白去乙?；?抑制劑和臨床急性髓系白血病常用化療用藥物聯(lián)合使用，可顯著增加新發(fā)白血病和難治復發(fā)白血病的治療完全緩解率，并可以更有效地逆轉(zhuǎn)難治復發(fā)白血病細胞對化療藥物的敏感性。
【專利說明】
用于治療白血病的聯(lián)合用藥物及其在治療白血病中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及用于治療白血病的聯(lián)合用藥物及其在治療白血病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]急性髓系白血病是一種常見血液系統(tǒng)惡性疾病，具有起病急驟、臨床表現(xiàn)兇險、預后較差等特點，對于生命健康有著極大的威脅。
[0003]目前臨床實踐中，針對急性髓系白血病常采用以阿糖胞苷聯(lián)合一種蒽環(huán)類抗生素為主的化療方案。阿糖胞苷是嘧啶類抗代謝藥物，通過抑制細胞中DNA的合成，引起DNA損傷，從而使腫瘤細胞死亡。蒽環(huán)類抗生素是II型DNA拓撲異構(gòu)酶抑制劑，可以使DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，導致DNA損傷。此外還有一些在此基礎(chǔ)上進行改進的化療方案。但是就目前而言，盡管約60%的急性髓系白血病患者在接受常規(guī)化療后可獲得臨床完全緩解，其中大部分患者仍會在治療后復發(fā)。白血病患者一旦復發(fā)，其體內(nèi)的腫瘤細胞對原先化療方案的敏感性就顯著降低，并且復發(fā)后再次造血干細胞移植的療效也極差，其結(jié)果就是復發(fā)的白血病迅速進展，導致患者死亡。此外，常規(guī)的化療方案并不能清除患者體內(nèi)具有干性的白血病細胞(即白血病干細胞)。數(shù)次療程的化療只是將患者體內(nèi)對化療藥物敏感的白血病細胞殺死，而那些具有很強的耐藥性的白血病干細胞則通過藥物篩選留存下來。因此，經(jīng)過多次化療后，白血病患者往往會對常規(guī)的化療方案產(chǎn)生耐受，進展為難治性白血病。難治性白血病的化療敏感性極差，且容易復發(fā)，是白血病臨床治療的難題。
[0004]鑒于此，有必要探索新的治療方案，對于新發(fā)白血病，可以有效的清除患者體內(nèi)的白血病干細胞;而對于耐藥的難治復發(fā)白血病，可以有效逆轉(zhuǎn)白血病細胞耐藥，增加化療的完全緩解率，為后續(xù)治療提供條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，為改善目前常用化療方案對白血病治療效果的不足，提供了一種新的治療白血病的方案，該方案可顯著增加新發(fā)白血病和難治復發(fā)白血病的治療完全緩解率，并可以更有效地逆轉(zhuǎn)難治復發(fā)白血病細胞對化療藥物的敏感性。
[0006]為此，本發(fā)明一方面提供了一種用于治療白血病的聯(lián)合用藥物，該藥物包括組蛋白去乙?；?抑制劑和白血病常規(guī)化療用藥物。
[0007]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，白血病常規(guī)化療用藥物為阿糖胞苷或者阿霉素。
[0008]在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，組蛋白去乙?；?抑制劑為RGFP966或丙戊酸鈉(VPA) 0
[0009]在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，組蛋白去乙?；?抑制劑為口服制劑，白血病常規(guī)化療藥物為靜脈注射針劑。所述口服制劑更加優(yōu)選為膠囊或片劑。
[0010]本發(fā)明再一方面提供了本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用，其中白血病優(yōu)選為急性髓系白血病。
[0011]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，白血病優(yōu)選為復發(fā)性、難治性或藥物耐受性白血病。
[0012]在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，組蛋白去乙?；?抑制劑為口服制劑，白血病常規(guī)化療藥物為靜脈注射針劑。所述口服制劑更加優(yōu)選為膠囊或片劑。
[0013]在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物或者應(yīng)用中，組蛋白去乙?；?抑制劑RGFP966的用量為口服每天50_500mg ；丙戊酸鈉的用量為口服每天500-3000mg;白血病常規(guī)化療藥物阿糖胞苷靜脈注射的常規(guī)劑量為每天20-250mg，連續(xù)用藥5-14天，或大劑量每天l-6g，連續(xù)用藥3天;阿霉素靜脈注射的用量為每天20-90mg，連續(xù)用藥3天。
[0014]由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點。
[0015]1、雖然，現(xiàn)有的實驗已經(jīng)證實了組蛋白去乙?；敢种苿┚哂锌鼓[瘤的效應(yīng)，并且FDA已經(jīng)批準了幾種組蛋白去乙酰化酶抑制劑用于腫瘤治療。但是，目前組蛋白去乙酰化酶抑制劑主要用于淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療，對于白血病、尤其是急性髓系白血病的臨床效用并不清楚。本發(fā)明首次探究了組蛋白去乙?；?抑制劑在急性髓系白血病中的抗腫瘤效應(yīng)。
[0016]2、本發(fā)明的細胞實驗表明，盡管在單獨使用組蛋白去乙?；敢种苿┑臈l件下，白血病細胞的增殖和凋亡無明顯改變;但是將阿糖胞苷或者阿霉素與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合使用，則可顯著誘導白血病細胞發(fā)生凋亡，該凋亡誘導效應(yīng)比單一使用任何一種藥物均要顯著。
[0017]3、本發(fā)明采用MLL-AF9白血病小鼠模型，探究了組蛋白去乙?；敢种苿┡c化療藥物聯(lián)合使用的體內(nèi)效果。實驗結(jié)果表明，聯(lián)合使用組蛋白去乙?；敢种苿┖突熕幬锟梢燥@著延長小鼠的生存期，對小鼠體內(nèi)白血病細胞的擴增具有更明顯的抑制效應(yīng)。
[0018]綜上所述，本發(fā)明提供了一種新的治療白血病的方案，即將組蛋白去乙?；?抑制劑和臨床急性髓系白血病常用化療用藥物聯(lián)合使用，該方案可顯著增加新發(fā)白血病和難治復發(fā)白血病的治療完全緩解率，并可以更有效地逆轉(zhuǎn)難治復發(fā)白血病細胞對化療藥物的敏感性。
【附圖說明】
[0019]圖1:白血病細胞株K562耐阿霉素細胞不同處理方式下的凋亡情況圖。
[0020]圖2:白血病細胞株THP-1細胞不同處理方式下的凋亡情況圖。
[0021]圖3:白血病細胞株K562耐阿霉素細胞及使用對照病毒或HDAC3特異敲低病毒感染后，對阿霉素IC50的柱狀圖。
[0022]圖4:不同方式處理后，MLL-AF9白血病小鼠的白血病細胞凋亡百分比柱狀圖。
[0023 ] 圖5:不同處理組MLL-AF9 二次移植小鼠的生存曲線圖。
[0024]?:對照組；■:化療組；▲: VPA處理組；?:化療聯(lián)合VPA處理組。
[0025 ] 圖6:不同處理組MLL-AF9 二次移植小鼠不同時間點外周血白細胞計數(shù)曲線圖。
[0026]#:對照組；■:化療組；▲: VPA處理組；T:化療聯(lián)合VPA處理組。
[0027]圖7:不同處理組MLL-AF9二次移植小鼠骨髓MLL-AF9陽性細胞數(shù)柱狀圖。
[0028]圖8:不同處理組MLL-AF9二次移植小鼠脾臟變化圖。
[0029]左:MLL_AF9陽性細胞數(shù)柱狀圖；
[0030]中:脾臟重量柱狀圖；
[0031 ]右:脾臟解剖標本示意圖。
[0032]圖9:不同處理組MLL-AF9 二次移植小鼠外周血MLL-AF9陽性細胞數(shù)。
【具體實施方式】
[0033]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0034]實施例1:靶向敲低組蛋白去乙酰化酶3可增強阿霉素對K562耐阿霉素細胞的凋亡誘導效應(yīng)。
[0035]本實施例采用小發(fā)夾RNA(shRNA，其載體為pLVX-shRNA2，購于Clontech公司)敲低K562耐阿霉素細胞(細胞購于中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院血液學研究所)(以下簡稱KA細胞)中組蛋白去乙?；?(HDAC3)的表達，并用蛋白印跡技術(shù)驗證敲低效率。
[0036]以2X105/ml的密度重懸細胞，采取不同的處理方式，然后于24小時、48小時和72小時收集細胞，使用Annexin V-APC單染法流式檢測陽性細胞(即凋亡細胞)的比例。
[0037]各處理組分別為KA細胞組，KA細胞HDAC3敲低組，KA細胞HDAC3敲低并使用0.5yg/ml阿霉素處理組，KA細胞HDAC3敲低并使用1.0yg/ml阿霉素處理組，KA細胞HDAC3敲低并使用2.0yg/ml阿霉素處理組。
[0038]Annexin V-APC染色方案如下:(I)收集單細胞懸液，離心并用冰冷I3BS清洗細胞2遍；(2)取1\105細胞重懸于10(^1 IXbinding buffer中，加入Annexin V-APC 2μ1;⑶室溫避光孵育15分鐘，然后加入300μ1 IXbinding buffer，流式檢測。
[0039]檢測結(jié)果如說明書附圖1所示。其中附圖1(A)從左至右分別為對照組，HDAC3敲低組，HDAC3敲低并使用0.5yg/ml阿霉素處理組，HDAC3敲低并使用1.0yg/ml阿霉素處理組，HDAC3敲低并使用2.0yg/ml阿霉素處理組。從上至下分別為24小時，48小時和72小時處理組。附圖1(B)中的柱狀圖表示各處理方式下細胞凋亡的變化。
[0040]從說明書附圖1可以看出，敲低KA細胞中的HDAC3，可增高不同濃度下阿霉素所引起的KA細胞凋亡。因此，HDAC3敲低可增加KA細胞對阿霉素的敏感性。
[0041 ]實施例2:靶向抑制組蛋白去乙酰化酶3可增強阿糖胞苷對THP-1細胞的凋亡誘導效應(yīng)。
[0042]本實施例以2 X 105/ml的密度重懸THP-1細胞(細胞購于中科院細胞庫)，采取不同的處理方式，然后于24小時和48小時收集細胞，使用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測陽性細胞(即凋亡細胞)的比例。
[0043]各處理組分別為對照組，阿糖胞苷(以下稱為Ara-c)處理組，RGFP966(HDAC3特異性抑制劑)處理組，Ara-c和RGFP966聯(lián)合處理組。其中Ara-c濃度為5μΜ，RGFP濃度為2μΜ。
[0044]Annexin V-FITC/PI染色方案如下:(I)收集單細胞懸液，離心并用冰冷I3BS清洗細胞2遍；(2)取I X 15細胞重懸于ΙΟΟμΙ IXbinding buffer中，加入Annexin V-FITC和PI各2μ1;(3)室溫避光孵育15分鐘，然后加入300μ1 IXbinding buffer，流式檢測。
[0045]檢測結(jié)果如說明書附圖2所示。其中附圖2(A)從左至右分別為對照組，Ara-c處理組，RGFP966處理組，Ara-c和RGFP966聯(lián)合處理組。從上至下分別為24小時和48小時處理組。附圖2(B)中的柱狀圖表示各處理方式下細胞凋亡的變化。
[0046]從說明書附圖2可以看出，單獨使用Ara-c或者RGFP966對THP-1細胞并無明顯的凋亡誘導效應(yīng)，但是聯(lián)合使用Ara-c和RGFP966時，THP-1細胞發(fā)生明顯凋亡。
[0047]實施例3:靶向敲低組蛋白去乙酰化酶3可增加KA細胞對阿霉素的敏感性。
[0048]本實施例中，KA細胞及采用對照病毒或HDAC3特異敲低病毒感染后，使用CCK-8試劑盒(試劑盒購于東仁化學科技(上海)有限公司)檢測阿霉素對各細胞的IC50值(半數(shù)抑制率)。
[0049]以下是CCK-8檢測細胞存活和增殖的原理:CCK_8試劑中含有WST-8，它可以在細胞線粒體脫氫酶的作用下還原為高度水溶性黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan)。生成的甲臜產(chǎn)物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。然后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測在450nm波長處的吸光度值(A)，即可反映活細胞的數(shù)量。
[0050]取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整濃度，以每孔2 X 14個細胞接種于96孔板，體積為90μ1。并設(shè)置調(diào)零孔(只加入ΙΟΟμΙ的培養(yǎng)基；由于使用的阿霉素有自發(fā)熒光，因此當實驗涉及阿霉素時，調(diào)零孔為90μ1培養(yǎng)基+10μ1相應(yīng)濃度的阿霉素)、對照孔(細胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共90μ1)和不同濃度加藥組(每種濃度設(shè)置3個復孔，KA和KA vector組的藥物濃度分別為
10、20、30、40、50、60、70、80yg/ml，KA shHDAC3組的藥物濃度為0.5、1、2、3、4、5、6、8、1yg/ml)，每孔體系為ΙΟΟμΙ。在實驗孔周圍一圈空白孔加入ΙΟΟμΙ的無菌roS，防止培養(yǎng)過程中細胞液蒸發(fā)，干擾實驗結(jié)果。37 0C繼續(xù)培養(yǎng)。48小時后每孔加入10μ1 CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，完全顯色后，用酶標儀于450nm處檢測每孔的吸光度(A)值。每3個孔取均值，結(jié)果以細胞抑制率表示:抑制率(％) = 100-(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)X 100%。并使用軟件計算出IC50 值。
[0051]檢測結(jié)果如說明書附圖3所示。從說明書附圖3可以看出，靶向敲低HDAC3后，KA細胞對阿霉素的敏感性升高。
[0052]實施例4:組蛋白去乙?；敢种苿┍焖徕c可增強阿糖胞苷對MLL-AFWJ、鼠白血病細胞的凋亡誘導效應(yīng)。
[0053]本實施例中，首先建立MLL-AF9融合基因白血病小鼠模型。
[0054]具體方法如下:處死6-8周齡的C56BL/6小鼠(小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司)，分離兩側(cè)股骨和脛骨。將股骨和脛骨置于培養(yǎng)皿中，用注射器吸取含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將骨髓吹出，并反復吹打數(shù)次，得到單個骨髓細胞懸液，然后用70微米濾網(wǎng)濾過細胞懸液。將骨髓細胞懸液離心，收集沉淀。將所得到的骨髓細胞用磁珠分選緩沖液重懸，計數(shù)細胞量，然后加入適量的抗小鼠CDl 17磁珠，于冰上孵育20分鐘，每5分鐘震蕩混勻。然后加入30毫升磁珠分選緩沖液清洗，離心得到細胞沉淀。用0.5-1毫升磁珠分選緩沖液重懸細胞，進行磁珠分選，富集得到CD117陽性的骨髓細胞。離心后用完全培養(yǎng)基重懸(完全培養(yǎng)基成分:20 %胎牛血清，5 % WEH1-3B細胞培養(yǎng)上清，I X青霉素_鏈霉素，I X谷氨酰胺，100ng/ml小鼠干細胞因子，10ng/ml小鼠白介素3，10ng/ml小鼠白介素6，用IMDM補足)。用表達MLL-AF9的逆病毒細胞進行感染，24小時候重復感染一次。將細胞經(jīng)小鼠尾靜脈注入經(jīng)過致死劑量(800cGy)輻照的C57BL/6小鼠體內(nèi)。每周檢測外周血表達綠色熒光蛋白的白細胞比例，用于判斷小鼠白血病的發(fā)病情況，作為第一代MLL-AF9白血病小鼠。
[0055]當受體C57BL/6小鼠外周血綠色熒光蛋白陽性細胞比例達到80%左右時，表明已經(jīng)是白血病發(fā)病末期。將小鼠處死，分離兩側(cè)股骨和脛骨中的白血病細胞，并用完全培養(yǎng)基以I X1Vml密度重懸細胞，采用不同的處理方式，然后于48小時收集細胞，使用AnnexinV-PE/7-AAD雙染法流式檢測陽性細胞(即凋亡細胞)的比例。各組分別為對照組，Ara-c處理組，丙戊酸鈉(VPA，一類HDAC抑制劑)處理組，Ara-c和VPA聯(lián)合處理組。Ara-c濃度為5nm，VPA濃度為0.2mM。
[0056]檢測結(jié)果如說明書附圖4所示。從說明書附圖4可以看出，單獨使用Ara-c或者VPA對MLL-AFWj、鼠白血病細胞并無明顯的凋亡誘導效應(yīng)，但是聯(lián)合使用Ara-c和VPA時，細胞發(fā)生明顯凋亡。
[0057]實施例5:組蛋白去乙?；敢种苿┍焖徕c聯(lián)合化療對白血病有顯著治療效應(yīng)。
[0058]本實施例中，分離第一代MLL-AF9白血病小鼠的白血病細胞，經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)過非致死劑量(400cGy)輻照的C57BL/6小鼠體內(nèi)，構(gòu)建為第二代MLL-AF9白血病小鼠模型。移植I周后將小鼠分組，分別采取不同的處理方式:對照組(用?表示，小鼠數(shù)量為15只)，化療組(小鼠給予阿糖胞苷和阿霉素處理，用■表示，小鼠數(shù)量為15只)，VPA處理組(小鼠給予VPA處理，用▲表示，小鼠數(shù)量為15只)，化療聯(lián)合VPA組(小鼠給予阿糖胞苷，阿霉素和VPA共同處理，用?或▼表示，小鼠數(shù)量為15只)。給藥劑量和時間為:阿糖胞苷100mg/kg X 5天，阿霉素3mg/kgX3天，VPA 300mg/kgX5天。
[0059]說明書附圖5顯示了檢測各組小鼠的生存情況。如圖5所示，與對照組相比較，VPA處理可以輕微延長小鼠的生存期，但是無明顯統(tǒng)計學差異?；熆梢燥@著延長小鼠的生存期，而化療和VPA聯(lián)合可進一步顯著延長生存期。
[0060]說明書附圖6顯示了移植后每周監(jiān)測外周血白細胞的數(shù)量，其中每組包含5只小鼠。如圖6所示，化療可以降低外周血白細胞的數(shù)量，而化療和VPA聯(lián)合可進一步降低外周血白細胞的數(shù)量。
[0061]移植后21天，處死部分白血病小鼠，分離小鼠的左右股骨和肱骨中的骨髓細胞，計數(shù)骨髓細胞中MLL-AF9陽性白血病細胞的數(shù)量，其中每組包含3只小鼠。如圖7所示，化療和VPA聯(lián)合組小鼠骨髓中MLL-AF9陽性的白血病細胞數(shù)量顯著低于其他各組。
[0062]移植后21天，處死部分白血病小鼠，分離小鼠的脾臟，拍照并稱量脾臟的重量，計數(shù)脾臟中MLL-AF9陽性白血病細胞的數(shù)量，其中每組包含3只小鼠。如圖8所示，化療和VPA聯(lián)合組小鼠脾臟中MLL-AF9陽性的白血病細胞數(shù)量顯著低于其他各組，并且脾臟的重要和體積也更接近于正常。
[0063 ] 移植后21天，計數(shù)外周血中MLL-AF9陽性白血病細胞的數(shù)量，其中每組包含5只小鼠。如圖9所示，化療和VPA聯(lián)合組小鼠外周血MLL-AF9陽性的白血病細胞數(shù)量顯著低于其他各組。
【主權(quán)項】
1.一種用于治療白血病的聯(lián)合用藥物，所述藥物包括組蛋白去乙?；?抑制劑和白血病常規(guī)化療用藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合用藥物，其中白血病常規(guī)化療用藥物為阿糖胞苷或阿霉素。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)合用藥物，其中組蛋白去乙酰化酶3抑制劑為RGFP966或丙戊酸鈉(VPA)。4.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的聯(lián)合用藥物，其中組蛋白去乙?；?抑制劑為口服制劑，白血病常規(guī)化療藥物為靜脈注射針劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聯(lián)合用藥物，所述口服制劑為膠囊或片劑。6.上述權(quán)利要求任一項所述的聯(lián)合用藥物在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用，其中白血病優(yōu)選為急性髓系白血病。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中白血病是復發(fā)性、難治性或藥物耐受性白血病。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其中組蛋白去乙?；?抑制劑為口服制劑，白血病常規(guī)化療藥物為靜脈注射針劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述口服制劑為膠囊或片劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的聯(lián)合用藥物，或者權(quán)利要求6-9中任一項所述的應(yīng)用，其中組蛋白去乙?；?抑制劑RGFP966的用量為口服每天50-500mg;丙戊酸鈉的用量為口服每天500-3000mg;白血病常規(guī)化療藥物阿糖胞苷靜脈注射的常規(guī)劑量為每天20-250mg，連續(xù)用藥5-14天，或大劑量每天l-6g，連續(xù)用藥3天;阿霉素靜脈注射的用量為每天20-90mg，連續(xù)用藥3天。
【文檔編號】A61K45/06GK105920604SQ201610403985
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】龍俊, 胡炯, 李軍民, 鄭仲征
【申請人】上海荻碩貝肯生物科技有限公司