FACS鑒定MSCs表面標(biāo)志分子(CD34 CD45 CD90+ CD29+ CD105+)。
[0015]2.BMSC外泌小體的獲取
a)將P3代的BMSC傳至P4代時(shí)，換用去除外泌小體的血清進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)上清；
b)將收集的細(xì)胞上清2，000g，離心10min，以去除死細(xì)胞，并將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心管，再次10，000g離心30 min,以去除細(xì)胞碎片；
c)將離心后的培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移入超速離心管中，100，000g離心70min,棄上清，用PBS重懸底部沉淀后，再次100, 000g離心70 min ；
d)再次用PBS重懸后，用0.22um無(wú)菌濾膜過濾除菌，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)后，分裝后于一 80°C保存。
[0016]注:本步驟中的離心均在4°C條件下進(jìn)行。
[0017]外泌小體的鑒定
3.1電鏡鑒定
a)將獲得exosome調(diào)整濃度至1000ug/mL，加入等體積的濃度為5%的戊二醛(exosome終濃度為500ug/mL，戊二醛終濃度為2.5%)固定exosome ；
b)吸取5ul懸液滴到碳膜銅網(wǎng)上，紅外燈下5min至干燥，然后滴加1%磷鎢酸1滴，紅外燈下5min至干燥，120KV下電鏡觀察。
[0018]檢測(cè)
提取exosome后，利用BCA試劑盒測(cè)定exosome蛋白濃度。取10ug的exosome于EP管中用于流式測(cè)定，步驟如下:
a)加入10ul的乳膠免疫微球，室溫孵15min ;再加PBS至1 ml，繼續(xù)在室溫下孵育2h，間斷混勻；
b)加110ul 1M甘氨酸，輕柔混勻，室溫孵育30 min ；
c)室溫4000rpm離心3 min，棄上清。1ml 0.5% BSA重懸免疫微球沉淀，室溫4000rpm離心3min，棄上清，重復(fù)洗滌2次；
d)100ul 0.5%BSA 重懸，加入 5ul 抗大鼠 CD63-PE 抗體，4°C孵育 30min ；lml 的 0.5%BSA離心洗滌3次；
e)200ul 0.5%的BSA重懸后，用流式進(jìn)一步檢測(cè)。
[0019]鑒定
a)用PBS將exosome蛋白濃度調(diào)至1.25mg/ml，吸取80ul加入20ul的5X SDS上樣緩沖液，此時(shí)蛋白濃度即為lmg/ml，100°C，5min煮樣；
b)吸取蛋白量20ug的exosome上樣，行分離膠濃度為15%的SDS-PAGE。ΙΟΟν恒壓，2h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%牛奶室溫封閉2h ;
c)將封閉好的膜與兔抗大鼠抗體(1:500稀釋)進(jìn)行孵育，4°C，過夜。PBST洗膜，3次，每次5min，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:10000稀釋)室溫孵育45min ;
d)PBST洗膜，3次，每次5min，加上ECL發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行檢測(cè)。
[0020]實(shí)施例2大鼠BMSC來(lái)源的外泌小體對(duì)心肌梗死的治療作用
實(shí)例2所使用的主要材料和來(lái)源分別如下:
SD大鼠(昭衍(蘇州)新藥研究中心提供，此實(shí)驗(yàn)由蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn))；小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，上海)，心電監(jiān)護(hù)儀(日本光電公司，日本)，硫酸阿托品(浙江金力制藥有限公司，海寧)水合氯醛(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院自制，蘇州)，手術(shù)器械(六六視覺公司，蘇州)，縫合針線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司，上海)，組織化學(xué)染色試劑(索萊寶公司，北京);
1、大鼠心肌梗死模型的建立
a)選用280g左右的雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用LAD結(jié)扎法制作心梗模型。模型組大鼠在麻醉前5-10min注射0.lml的硫酸阿托品，抑制氣管分泌物，然后10%的水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉，切開氣管行氣管插管，接空氣呼吸機(jī)，呼吸頻率80次/min，潮氣量8ml，吸呼比1: 1。左胸縱切口切開外層皮膚，剝離胸大肌，第三、四肋間橫切口開胸，暴露心臟，用鑷子撕開心包膜。在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間可以看見左冠狀靜脈主干走行，LAD與之伴行。在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的連線距左心耳下緣約3mm處，將LAD連同少量心肌組織一起縫扎，進(jìn)針深度約1_，寬度控制在4-6_。逐層關(guān)胸，縫合氣管。結(jié)扎后30min記錄心電圖。假手術(shù)組僅縫線而不打結(jié)，其余同模型組；
b)結(jié)扎后肉眼可見心尖變白，心電圖監(jiān)測(cè)有ST段的抬高，2周后取左心室組織進(jìn)行心臟組織染色，可看到明顯的纖維化，證明心梗模型建立成功。
[0021 ] 2.BMSC來(lái)源的外泌小體在心梗模型治療中的應(yīng)用
a)按照上述方法LAD結(jié)扎后，選擇結(jié)扎位點(diǎn)附近的左下、右下兩個(gè)位點(diǎn)注射PBS重懸外泌小體懸液進(jìn)行治療，每只大鼠exosome用量為20ug/20ul，每個(gè)位點(diǎn)10ug，以PBS作為陰性對(duì)照；
b)分別在術(shù)后的1周和2周處死大鼠，取左心室組織進(jìn)行心臟組織染色，觀察治療效果Ο
[0022]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所用的外泌小體是來(lái)源于健康的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述心肌梗死為因缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的壞死。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體溶解在磷酸鹽緩沖液中制成濃度為lmg/mL的針劑使用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心肌梗死的新用途，建立分離足夠量外泌小體的方法及全面分析外泌小體的體系，規(guī)范外泌小體治療心肌梗死的療程、療效及評(píng)估體系。利用干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心臟病的創(chuàng)新方案，不但解決了干細(xì)胞治療帶來(lái)的致癌及免疫排斥的危害，而且與干細(xì)胞治療相比具有便于保存、定量以及移植簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。外泌小體的治療方案將為社會(huì)提供治療心血管疾病的新途徑，并節(jié)省大量基金。
【IPC分類】A61K35/28, A61P9/10
【公開號(hào)】CN105395571
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511013053
【發(fā)明人】李楊欣
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日