間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心肌梗死的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心肌梗死的新用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，隨著我國人民生活水平的不斷提高，生活節(jié)奏的不斷加快，缺血性心肌梗死的發(fā)病率也在不斷上升。缺血性心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和瘢痕形成，進(jìn)而影響心臟的功能。雖然目前通過冠狀動(dòng)脈介入術(shù)和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等方法，能夠改善患者癥狀，但卻不能替換已壞死的心肌細(xì)胞。心臟移植雖能徹底改善心臟狀態(tài)，但因供體來源稀缺、免疫排斥以及昂貴的治療費(fèi)用等因素，在臨床上很難廣泛應(yīng)用。
[0003]移植干細(xì)胞治療心肌梗死，因其各方面的優(yōu)勢(shì)有望成為治療心肌梗死的一個(gè)治療手段。干細(xì)胞是一種具有多分化潛能和自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞，在特定條件下它可以分化成不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官。特別是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，它存在骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中，對(duì)造血系統(tǒng)起支持誘導(dǎo)作用，具有高度增殖和自我更新能力，在一定條件下也可以誘導(dǎo)分化成特異的組織細(xì)胞，修復(fù)受損的組織或器官。
[0004]可研究表明，基于干細(xì)胞的心血管疾病治療方案雖能夠在一定程度上緩解病情，但治療效果并不理想。這主要是由于人們對(duì)干細(xì)胞的作用機(jī)制仍缺乏認(rèn)識(shí)。另外干細(xì)胞移植有很多副作用包括導(dǎo)致心律失常，并具有致癌性及免疫排斥。以往認(rèn)為干細(xì)胞的治療效果依賴于其分化潛能，但最新研究成果表明移植的干細(xì)胞主要是通過旁分泌作用而發(fā)揮其治療作用，比如干細(xì)胞分泌物能刺激心肌祖細(xì)胞的細(xì)胞周期再進(jìn)入(cell cyclereentry)。最近，本申請(qǐng)?zhí)岢隽藷o細(xì)胞的干細(xì)胞治療(stem cell therapy without stemcells)，也就是移植的不是干細(xì)胞，而是利用干細(xì)胞分泌的外泌小體(exosome)治療心肌梗死的設(shè)想。本發(fā)明就是用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome治療心肌梗死的方案。
[0005]外泌小體是細(xì)胞內(nèi)來源的一群直徑在30 - 100 nm之間的納米級(jí)顆粒，通過細(xì)胞內(nèi)的多泡體(MVB)與細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外。通常B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種不同細(xì)胞類型的細(xì)胞都可以分泌外泌小體。外泌小體成分除了脂質(zhì)、蛋白質(zhì)外，還包括microRNA，IncRNA，circRNA等一些非編碼RNA。通過蛋白組學(xué)及表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)外泌小體中的蛋白組成及所含的RNA分子較為復(fù)雜，不同細(xì)胞來源的外泌小體其組成成分也不盡相同，這說明了外泌小體的功能的特異性。研究表明血液中外泌小體的特異性蛋白的表達(dá)可以做胃癌、胰腺癌等多種疾病的診斷標(biāo)志。研究還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)傳統(tǒng)的干細(xì)胞治療，干細(xì)胞來源的外泌小體，可以利用攜帶的干細(xì)胞特異的miRNAs分子和蛋白分子，刺激靶細(xì)胞向心臟保護(hù)和再生方向發(fā)生轉(zhuǎn)化。除此之外，外泌小體還具有穩(wěn)定性高、應(yīng)用方便、定量精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明將BMSC來源的外泌小體應(yīng)用于心肌梗死的治療之中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有干細(xì)胞移植的副作用，本發(fā)明采用了無細(xì)胞的干細(xì)胞治療，也就是移植的不是干細(xì)胞，而是利用干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心臟病。本發(fā)明的目的是為臨床提供更具特異性、更安全和更易操作的治療心肌梗死方案。
[0007]本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心肌梗死的新用途。具體生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論包括以下方面:
一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用。
[0008]所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所用的外泌小體是來源于健康的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的。
[0009]所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述心肌梗死為因缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的壞死。
[0010]所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用，其特征在于:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體溶解在磷酸鹽緩沖液中制成濃度為lrng/mL的針劑使用。
[0011]有益效果:本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心肌梗死的新用途，建立分離足夠量外泌小體的方法及全面分析外泌小體的體系，規(guī)范外泌小體治療心肌梗死的療程、療效及評(píng)估體系。利用干細(xì)胞分泌的外泌小體治療心臟病的創(chuàng)新方案，不但解決了干細(xì)胞治療帶來的致癌及免疫排斥的危害，而且與干細(xì)胞治療相比具有便于保存、定量以及移植簡單的優(yōu)點(diǎn)。外泌小體的治療方案將為社會(huì)提供治療心血管疾病的新途徑，并節(jié)省大量基金。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下所列實(shí)施例，僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0013]實(shí)施例1大鼠BMSC exosome的分離鑒定實(shí)例1所使用的主要材料和來源分別如下:
BMSC培養(yǎng)試劑DMEM:F12培養(yǎng)基(hyclone公司，美國)、胎牛血清(BI公司，以色列)、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermol公司，美國)、倒置顯微鏡(ZEISS公司，德國)，超凈工作臺(tái)(安泰公司，蘇州)，臺(tái)式離心機(jī)(Thermol公司，美國)，超速離心機(jī)、超速離心管(Beckman公司，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Takara公司，日本)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG 二抗(杭州聯(lián)科生物公司，杭州)，ECL化學(xué)發(fā)光底物(BI公司，以色列)、0.22um無菌濾膜(Millipore公司，美國)；透射電子顯微鏡(FEI Tecnai 12，Philips公司)、FACS檢測(cè)的微球(Lifetechnology公司，美國)，PE標(biāo)記的(D63抗體(b1legend公司，美國)。
[0014]1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的獲得
a)選擇2-3周齡的雄性SD大鼠，頸椎脫白法處死大鼠，將大鼠浸泡在75%酒精中5min_10min 消毒；
b)在無菌條件下取大鼠的雙下肢浸泡于DMEM/F12無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用剪刀和鑷子去除股骨及脛骨上的肌肉； c)用1ml注射器吸取添加青、鏈霉素的DMEM/F12無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，慢慢沖出骨髓，每個(gè)骨頭沖洗2遍，(不可沖洗次數(shù)過多，沖的次數(shù)過多可能會(huì)沖出來更多的雜細(xì)胞)；
d)待骨髓全部沖出，lOOOrpm，離心5min，棄上清，加入新鮮的DMEM/F12+10%FBS的培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，將沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，按照1.5 X 105/cm2的密度將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中；
e)48h后換液并去除未貼壁的細(xì)胞，以后每兩天換液一次，待培養(yǎng)皿中的集落之間互相融合細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，用0.125%胰酶37°C消化lminl5s，收集細(xì)胞1:2傳代，此時(shí)標(biāo)記為P1代；
f)待細(xì)胞傳代至P2代或者P3代時(shí)，取一部分細(xì)胞，用