癲癇寧在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癲癇寧的新用途，具體涉及癲癇寧在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥 物中的應(yīng)用，屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlazheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶損傷 為主的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行 功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。目前用于治療阿爾茨海默病的藥 物主要分為兩類：乙酰膽堿酯酶抑制劑（如加蘭他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA 受體）拮抗劑（如美金剛），但上述藥物價(jià)格昂貴、副作用顯著（幻覺、意識(shí)混沌、頭暈、頭痛 和疲倦），且只能控制卻不能逆轉(zhuǎn)患者病情。
[0003] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了多年的研究，但是由于其病因復(fù)雜， 該病的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。目前較為主流的學(xué)說是(6-淀粉樣蛋白（AP)學(xué)說，該學(xué) 說的核心是患者大腦中異常沉積的AP通過自由基反應(yīng)、線粒體氧化損傷和炎癥反應(yīng)等一 系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接或者間接作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能異?；?者死亡，引發(fā)認(rèn)知損傷及記憶衰退，最終引起癡呆。
[0004] 阿爾茨海默病患者的大腦皮層和海馬出現(xiàn)P淀粉樣蛋白（AP)聚集形成的老年 斑（SP)是阿爾茨海默病最為主要病理特征之一，(6-淀粉樣蛋白可以有效削弱突觸結(jié)構(gòu)和 功能，是引起阿爾茨海默病的重要物質(zhì)。因此0淀粉樣蛋白已成為公認(rèn)的篩選預(yù)防或治療 阿爾茨海默病藥物的靶標(biāo)。
[0005] 阿爾茨海默病病因復(fù)雜且發(fā)病環(huán)節(jié)較多，目前西藥針對(duì)阿爾茨海默病的某一特定 病理環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)往往會(huì)出現(xiàn)耐藥及嚴(yán)重不良反應(yīng)。而中藥具有多種活性成分、多靶點(diǎn)的 作用特征，使中藥治療阿爾茨海默病具有明顯的優(yōu)越性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供癲癇寧的一種新用途，具體涉及癲癇寧在制備預(yù)防或治療 阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
[0007] 所述的癲癇寧劑型可以為片劑、丸劑、膠囊劑、口服液或顆粒劑。劑型不同不影響 癲癇寧在預(yù)防或治療阿爾茨海默病方面的功能。
[0008] 本發(fā)明公開的所述的癲癇寧在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用，所述 的癲癇寧為癲癇寧片。
[0009] 癲癇寧片劑是由蜘蛛香、石菖蒲、鉤藤、牽牛子、千金子、纈草、甘松、薄荷腦八味藥 經(jīng)過現(xiàn)代制藥工藝精制而成的中成藥。目前，癲癇寧用于風(fēng)痰上擾癲癇病，或用于癔病、失 眠等。
[0010] 本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲株系CL4176作為篩選預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物的 病理模型來評(píng)價(jià)癲癇寧預(yù)防或治療阿爾茨海默病的作用，是基于：阿爾茨海默病患者的大 腦皮層和海馬出現(xiàn)0淀粉樣蛋白（AP)聚集形成的老年斑（SP)是阿爾茨海默病最為主要 病理特征之一，(6-淀粉樣蛋白可以有效削弱突觸結(jié)構(gòu)和功能，是引起阿爾茨海默病的重要 物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲品系CL4176在25°C溫度誘導(dǎo)下肌肉特異性表達(dá)人類在肌 肉組織聚集，最終導(dǎo)致線蟲麻痹。將藥物作用于線蟲株系CL4176,如果線蟲群體麻痹狀況得 到改善，具體表現(xiàn)為線蟲的麻痹時(shí)間顯著延滯，則說明藥物具有預(yù)防或治療阿爾茨海默病 作用。
[0011] 秀麗隱桿線蟲對(duì)外界環(huán)境變化反應(yīng)敏感，利用秀麗線蟲可以對(duì)藥物的毒性進(jìn)行準(zhǔn) 確評(píng)價(jià)，體長(zhǎng)是最為常用的發(fā)育毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。藥物作用于線蟲后，如果線蟲體長(zhǎng)顯著 減小，則說明藥物對(duì)線蟲具有顯著的發(fā)育毒性。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0013] 本發(fā)明評(píng)估癲癇寧對(duì)秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默病模型麻痹表型的作用，結(jié)果證實(shí) 了癲癇寧對(duì)秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默病模型麻痹表型具有明顯的抑制作用，具有預(yù)防或治 療阿爾茨海默病的潛力。
[0014] 因此，中成藥癲癇寧可用于制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物。
【附圖說明】
[0015] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0016] 圖1為陽性藥物鹽酸美金剛對(duì)秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默病模型麻痹表型的影響。
[0017] 圖2為癲癇寧片對(duì)秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默病模型麻痹表型的影響。
[0018] 圖3為蜘蛛香、石菖蒲、鉤藤及其癲癇寧片的藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0019] 圖4為蜘蛛香與癲癇寧片的毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下提供具體實(shí)施例以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的癲癇寧在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默 病藥物中的應(yīng)用，但不限于這些實(shí)施例。
[0021] 實(shí)施例一鹽酸美金剛對(duì)秀麗隱桿線蟲CL4176的作用
[0022] 1 ?生物材料
[0023] (1)秀麗隱桿線蟲 CL4176 購(gòu)自 Caenorhabditis Genetics Center ;為轉(zhuǎn)基因品 系，在25°C溫度誘導(dǎo)下肌肉特異性表達(dá)人類A P，A P在肌肉組織聚集，最終導(dǎo)致線蟲麻痹， 本實(shí)施例采用秀麗線蟲品系CL4176作為篩選預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物的病理模型。
[0024] (2)大腸桿菌0P50 (尿啼啶滲漏突變株），購(gòu)自CaenorhabditisGenetics Center，作為秀麗隱桿線蟲的食物。
[0025] 2?試劑
[0026] (1)鹽酸美金剛（MEM)，化學(xué)名稱：1_氨基_3,5_二甲基金剛烷胺鹽酸鹽，分子式： C 12H21N ^HCl,購(gòu)自百靈威科技，CAS :41100-52-1 ;鹽酸美金剛為非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑， 用于治療中重度至重度阿爾茨海默型癡呆，文獻(xiàn)報(bào)道美金剛（2. 16mg/ml)能夠顯著抑制轉(zhuǎn) 基因線蟲株系CL4176麻痹表型，本實(shí)施例將其作為陽性藥物。
[0027] (2)固體NGM(Nematode Growth Medium)培養(yǎng)基成分與制作（以1升為例）：
[0028]
[0029] 固體NGM培養(yǎng)基配制好后，121°C下高壓恒溫滅菌20min，在無菌操作臺(tái)下加入 5mg/ml膽固醇lml，IM MgSO4 lml, IMCaCl2 Iml,搖勾，趁熱倒入已滅菌的9cm培養(yǎng)板，約 20ml/板。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。
[0030] (3)配制含鹽酸美金剛的NGM培養(yǎng)基
[0031] 鹽酸美金剛?cè)芙庥跓o菌水中，配制成為2. 16mg/ml的母液；將美金剛母液加 入融化的NGM培養(yǎng)基中，配制為含鹽酸美金剛終濃度為215. 76 y g/ml、107. 88 y g/ml、 21. 58 y g/ml、4. 32 y g/ml、0. 86 y g/ml 的 NGM 培養(yǎng)基。
[0032] 空白對(duì)照為同樣條件下加入與鹽酸美金剛等體積無菌水的NGM培養(yǎng)基。
[0033] 上述培養(yǎng)基上均涂布大腸桿菌0P50作為線蟲的食物。
[0034] (4) M9 液配方
[0035]
[0036] (5)裂解液的配制：6. 4%NaClO3溶液和IMNaOH溶液按體積比1:1混合。
[0037] 3?實(shí)施步驟
[0038] (1)線蟲的培養(yǎng)：
[0039] 將線蟲接在涂有大腸桿菌0P50的固體NGM板上，然后置于16°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 當(dāng)線蟲長(zhǎng)到成蟲時(shí)進(jìn)行同步化處理。
[0040] ⑵線蟲同步化：
[0041] 挑選含有大量成蟲并且有部分線蟲卵已經(jīng)孵出的NGM培養(yǎng)基，用M9液將線蟲從培 養(yǎng)基上沖下，轉(zhuǎn)移到離心管中，靜置使線蟲自由沉降至管底，棄上清。視線蟲量多少向離心 管中加入線蟲堿裂解液，在漩禍攪拌器上振蕩5-7分鐘待線蟲全部斷裂時(shí)停止渦旋，并分 裝于I. 5mL離心管中，用M9溶液洗線蟲卵三次。
[0042] (3)鹽酸美金剛（MEM)對(duì)秀麗隱桿線蟲CL4176的作用
[0043] 線蟲同步化后將線蟲卵轉(zhuǎn)移到涂布有0P50并混合不同濃度鹽酸美金剛的NGM培 養(yǎng)基上，空白對(duì)照為涂布有0P50并加有與鹽酸美金剛等體積無菌水的NGM培養(yǎng)基。每個(gè)培 養(yǎng)基60條線蟲，每個(gè)藥物濃度以三個(gè)培養(yǎng)基作為平行，16°C培養(yǎng)3天至L3期。
[0044] 為了使線蟲表達(dá)六!]，將L3期線蟲轉(zhuǎn)至25°C下進(jìn)行誘導(dǎo)，34h后開始計(jì)數(shù)線蟲麻痹 條數(shù)。每?jī)尚r(shí)計(jì)數(shù)一次，直至所有線蟲都麻痹（麻痹是指機(jī)械刺激線蟲身體時(shí)，線蟲不能 運(yùn)動(dòng)或者只有頭部運(yùn)動(dòng)），結(jié)果見圖1。
[0045] 由圖1可以看出，水溶解的陽性藥物鹽酸美金剛在21.58μg/ml、4.32μg/ml、 0. 86 y g/ml時(shí)能夠顯著抑制CL4176麻痹表型，215. 76 y g/ml和107. 88 y g/ml鹽酸美金 剛強(qiáng)烈抑制線蟲發(fā)育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)體系正常，說明本發(fā)明能夠采用秀麗線蟲品系 CL4176作為篩選預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物。
[0046] 實(shí)施例二癲癇寧片對(duì)秀麗隱桿線蟲CL4176的作用
[0047] 1.生物材料同實(shí)施例一。
[0048] 2?試劑
[0049] (1)癲癇寧片：生產(chǎn)廠家：昆明中藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020771。
[0050] (2)固體NGM(NematodeGrowthMedium)培養(yǎng)基成分與制作（以1升為例）：同實(shí) 施例一。
[0051] (3)配制含水溶解的癲癇寧片NGM培養(yǎng)基
[0052] 火焰加熱癲癇寧片，剝?nèi)ヌ且隆d癇寧片用研缽研成粉末，溶解于無菌水中，并 配置成為150mg/ml癲癇寧片水溶液，室溫下超聲30min，并于1000 Orpm下離心10min，取上 清，于