含海藻糖的穩(wěn)定化因子ix制劑的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年12月16日的題為"含海藻糖的穩(wěn)定化因子IX制劑"的 中國(guó)專利申請(qǐng)No. 200880122207. 9的分案申請(qǐng)。
[000引相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本發(fā)明要求享有于2007年12月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/016,230的優(yōu) 先權(quán)，將其結(jié)合于本文中作為參考。
[0004] 聯(lián)合研究協(xié)議的各方
[0005]運(yùn)項(xiàng)工作是作為InspirationBio地armaceuticals,Inc.和IC0SCo巧.之間的 研究協(xié)議的結(jié)果而產(chǎn)生的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)及在凍干和儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定化，具體而 言，設(shè)及凝血因子如因子IX的穩(wěn)定化。
【背景技術(shù)】
[0007] 因子IX是參與凝血途徑的單鏈糖蛋白。因子IX是一種含有氨基末端信號(hào)膚和前 原（prepro)前導(dǎo)序列（二者在分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)之前斷裂）W及負(fù)責(zé)Ca2+結(jié)合的Gla結(jié) 構(gòu)域的結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子（或結(jié)構(gòu)性配分子，structurallycomplexmolecule)。巧結(jié)合通過 結(jié)合至凝血活性所需的蛋白W及誘導(dǎo)其構(gòu)象變化而在因子IX功能中發(fā)揮重要作用。巧結(jié) 合導(dǎo)致之前埋藏的疏水結(jié)合位點(diǎn)暴露，運(yùn)些結(jié)合位點(diǎn)有利于結(jié)合至有效凝血的憐脂。為了 產(chǎn)生活性蛋白，維持因子IX的巧結(jié)合性質(zhì)是必要的。一旦活化膚被切割，則單鏈因子IX變 成活化的酶因子IXa，一種經(jīng)由鏈間二硫鍵連接的雙鏈糖蛋白。另外，該分子含有多個(gè)N和 0-連接的糖基化位點(diǎn)。因子IX的缺乏導(dǎo)致B型血友病，對(duì)該病目前可利用多種療法，包括 巧爍巧FIX⑧，一種因子IX的重組形式，和Monordne⑥，其來(lái)源于人體血漿。
[000引 Mononii'ie飯的制劑由組氨酸、甘露醇、氯化鋼和聚山梨醇醋80組成。運(yùn)些主 要是已知在冷凍期間表現(xiàn)出共晶轉(zhuǎn)變（eutectictransition)(結(jié)晶行為）的賦形劑。然 而，Mononine⑩制劑不含防凍劑或穩(wěn)定劑，僅有緩沖劑、疏松劑（或蓬松劑，buying agent)、等張劑和表面活性劑。因此，在冷凍、凍干和隨后的儲(chǔ)存期間，該蛋白相對(duì)地未進(jìn)行 物理保護(hù)且由于暴露于冰、水和空氣而產(chǎn)生變性效應(yīng)。運(yùn)里解決的技術(shù)問題是一種改良的 因子IX制劑，其中改善了冷凍、凍干和儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在冷 凍、凍干和儲(chǔ)存期間，在因子IX組合物中包含海藻糖穩(wěn)定了因子IX的巧結(jié)合能力并維持了 運(yùn)種純化蛋白的生物活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)及包含因子IX和海藻糖的凍干組合物。優(yōu)選地，海藻糖W在 凍干和25°C下儲(chǔ)存6個(gè)月期間足W保留超過90%的因子IX的巧結(jié)合性質(zhì)的量存在。
[0010] 優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)W0. 5~3%的量存在。且更優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)w 1~2%的量存在。
[0011] 在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含作為緩沖劑的組氨酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方 式中，該組合物包含甘露醇。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含氯化鋼。在一些優(yōu)選實(shí) 施方式中，該組合物包含聚山梨醇醋80。
[0012] 在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含因子IX和海藻糖，并另外地包含濃度為 5~20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2~5%的甘露醇、濃度為50~80mM的氯化鋼、和按 體積計(jì)濃度為0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋80。
[0013] 本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)及制備因子IX的穩(wěn)定干燥組合物的方法，該方法通過混合 含有因子IX和海藻糖的溶液W獲得一種防凍溶液并冷凍干燥該防凍溶液而獲得因子IX的 穩(wěn)定干燥組合物。優(yōu)選地，因子IX的干燥組合物在25°C下儲(chǔ)存6個(gè)月后保留超過90%的 巧結(jié)合活性。
[0014] 優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)W0. 5~3 %的量存在。而更優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)W 1~2%的量存在。
[0015] 在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶液包含作為緩沖劑的組氨酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方 式中，所述溶液包含甘露醇。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶液包含氯化鋼。在一些優(yōu)選實(shí) 施方式中，所述溶液包含聚山梨醇醋80。
[0016] 在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述溶液包含因子IX和海藻糖并另外地包含濃度 為5~20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2~5%的甘露醇、濃度為50~80mM的氯化鋼、和 按體積計(jì)濃度為0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋80。
[0017] 優(yōu)選地，冷凍干燥操作包括一個(gè)退火步驟。
[0018] 本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)及通過包括W下步驟中的一個(gè)或多個(gè)的方法凍干包含因子 IX和海藻糖的藥物制劑的方法：
[0019] (a)在-40°c或更低的溫度下冷凍包含因子IX和海藻糖的藥物制劑；
[0020] 化）在約-20°C和-35°C之間退火該藥物制劑；
[0021](C)將該藥物制劑的溫度降低至-40°C或更低；
[0022] (d)在5°C~20°C于減壓下在第一干燥步驟中干燥該藥物制劑；和
[0023] (e)在45°C~55°C于減壓下在第二干燥步驟中干燥該藥物制劑。
[0024] 優(yōu)選地，該藥物制劑還包含濃度為5~20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2~5% 的甘露醇、濃度為50~80mM的氯化鋼、和按體積計(jì)濃度為0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋 80 〇
[0025] 根據(jù)W下對(duì)優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)顯而 易見。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 現(xiàn)在將參照優(yōu)選實(shí)施方式的附圖，描述本發(fā)明的運(yùn)些和其他特征，運(yùn)些優(yōu)選實(shí)施 方式用于舉例說(shuō)明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。
[0027] 圖1示出了因子IX在40°C/75%RH下的穩(wěn)定性。""表示在lOmM組氨酸、3%甘 露醇、66mMNaCl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白巧l)。"?" 表示在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化Cl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 % 海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0028] 圖2A和2B示出了在儲(chǔ)存12周之后因子IX組合物的SE-HPLC洗脫曲線圖。圖 2A示出了在10mM組氨酸、3%甘露醇、66mM化Cl和 0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的 0. 4mg/mL因子IX蛋白o(hù)n)。圖2B示出了在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0. 0075% 聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0029] 圖3A和3B示出了在儲(chǔ)存12周之后因子IX的SE-HPLC(巧）洗脫曲線圖。圖3A 示出了在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化C1和0. 0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中的 0. 4mg/mL因子IX蛋白o(hù)n)。圖3B示出了在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0. 0075% 聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0030] 圖4示出了在40°C775%RH下因子IX巧結(jié)合穩(wěn)定性。""表示在lOmM組氨酸、 3%甘露醇、66mM化Cl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白an)。 "?"表示在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具 有1%海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0031] 圖5示出了在非還原（A)和還原做條件下儲(chǔ)存12周之后，因子IX制劑 的SDS-PAGE分析。圖5中圖A:泳道1，空白；泳道2,標(biāo)記物；泳道3,因子IX參考標(biāo) 準(zhǔn)（Mononme風(fēng)）；泳道 4,0. 4mg/ml，R1，凍干（lyo)-20°C;泳道 5,0. 4mg/ml，R2,凍 干-20°C;泳道 6,0. 4mg/ml，R1，凍干 2 ~8°C;泳道 7,0. 4mg/ml，R2,凍干 2 ~8°C;泳道 8， 0. 4mg/ml，R1，凍干 25°C;泳道 9,0. 4mg/mL，R2,凍干 25°C;泳道 10,0. 4mg/mL，R1，凍干 40°C; 泳道11,0. 4mg/ml，R2,凍干40°C;泳道12,標(biāo)記物。圖5中圖B:泳道1和2,標(biāo)記物；泳道 3,因子IX參考標(biāo)準(zhǔn)（Mononine夠）；泳道 4,0. 4mg/ml，R1，凍干-20°C;泳道 5,0. 4mg/ml， R2,凍干-20°C;泳道 6,0. 4mg/mL，R1，凍干 2 ~8°C;泳道 7,0. 4mg/mL，R2,凍干 2 ~8°C; 泳道 8,0. 4mg/mL，R1，凍干 25°C;泳道 9,0. 4mg/mL，R2,凍干 25°C;泳道 10,0. 4mg/ml，R1， 凍干40°C;泳道11,0. 4mg/ml，R2,凍干40°C;泳道12,標(biāo)記物。
[0032] 圖6示出了因子IX組合物在儲(chǔ)存12周之后的陰離子交換HPLC洗脫曲線圖。圖6 中A圖示出了在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化C1和0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中 的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧1)。圖6中B圖示出了在lOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM化CI、 0. 0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 盡管所描述的實(shí)施方式代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解，對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員而言可W進(jìn)行變形而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神。因此本發(fā)明的范圍將僅僅由所附 權(quán)利要求進(jìn)行確定。
[0034] 本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)及在海藻糖存在下凍干因子IX的方法W及含海藻糖的因子 IX制劑。在添加和沒有添加海藻糖的情況下對(duì)因子IX制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中海藻糖是一種在 凍干工藝期間不會(huì)結(jié)晶的防凍劑。隨著冷凍至較低溫度，海藻糖保持為一種經(jīng)歷玻璃轉(zhuǎn)化 的濃縮物。因此，在海藻糖存在下，蛋白得W保存，通過冷凍和凍干而保持混合無(wú)定形狀態(tài) 并被穩(wěn)定化。海藻糖改善了儲(chǔ)存的因子IX蛋白的穩(wěn)定