（6xHB)抗體具有強(qiáng)結(jié)合）。在圖5B中 的插入圖表明D25和1331H識(shí)別融合前形式的RSV-F蛋白上的不同表位。 實(shí)例5 D25不與結(jié)合至抗原位點(diǎn)A、B、或C的抗體競(jìng)爭(zhēng)
[0091]RSV-F蛋白具有至少6個(gè)不同的通常描述的中和抗原位點(diǎn)。之前鑒定的抗RSV 單克隆抗體，帕利珠單抗:（SYNAGISU )、莫他珠單抗，1153、1121、13/19、92-11C、131-2A、 1331H、以及1308F，結(jié)合至良好表征的抗原位點(diǎn)A/II、B/I、或C，如圖6中所展示的。
[0092] 為了確定D25是否結(jié)合至這些良好表征的抗原區(qū)域中任一個(gè)上，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 測(cè)定來測(cè)試上述抗RSV抗體中任一個(gè)是否可與D25針對(duì)其抗原部位競(jìng)爭(zhēng)。在所有這些結(jié)合 測(cè)定中使用l〇〇ng/ml生物素標(biāo)記D25抗體。未標(biāo)記的D25用作陽性對(duì)照并且R347用作陰 性對(duì)照。在450nm處測(cè)定吸光度。
[0093] 如圖7A-C中所示，已知結(jié)合至抗原位點(diǎn)A、B或C的抗體中沒有一個(gè)能夠與D25針 對(duì)結(jié)合至RSV-F蛋白競(jìng)爭(zhēng)，表明D25不結(jié)合至位點(diǎn)A、B或C。另一方面，如圖7D中所示，具 有未知抗原位點(diǎn)的幾種抗RSV-F抗體，即AM22和AM23,在本結(jié)合測(cè)定中與D25有效競(jìng)爭(zhēng)，表 明D25的表位與AM22和AM23的那些重疊。AM23比AM22與D25更有效地競(jìng)爭(zhēng)，表明其表位 可能更類似于D25的表位。
[0094] AM22 和 AM23 先前分別披露于 US 2012/0070446 A1 以及 US2010/0239593 A1 中。 之前發(fā)現(xiàn)AM23不中和除了一個(gè)臨床分離株（CP096-B15)以外RSV B病毒株中的任一個(gè)。還 示出氨基酸209對(duì)于AM23的中和活性是重要的（圖8)?？傊?，這些結(jié)果表明D25可結(jié)合至 包括氨基酸209的抗原區(qū)域。 實(shí)例6 D25表位的作圖
[0095] 這一實(shí)例報(bào)導(dǎo)，一系列不能通過D25中和的單克隆抗體抗性突變體（MARM)的產(chǎn) 生，以進(jìn)一步確定該RSF-F蛋白的哪些氨基酸對(duì)于D25結(jié)合是關(guān)鍵性的。
[0096] 在該RSV病毒的A分尚株和B分尚株上進(jìn)行此分析。簡(jiǎn)言之，在感染24孔板中的 匯合的HEp2細(xì)胞之前，將1-5X 106pfu/ml的RSV A2或RSV B 18537病毒孵育在450ng/ ml (200XICM)D25mAb中1小時(shí)。感染后達(dá)六天，將各板冷凍并解凍以釋放該病毒，并且將 來自此過程的上清液在H印2細(xì)胞的新匯合層上在用450ng/ml的D25孵育2小時(shí)后進(jìn)行傳 代。如針對(duì)第二次傳代所述進(jìn)行第三次傳代。在3輪選擇之后的病毒產(chǎn)量針對(duì)A2病毒為 8x 105至3x 10 6并且針對(duì)B病毒為1. 3x 10 4至5x 10 4。在第三次傳代之后，將細(xì)胞保留、 溶解并且自這些細(xì)胞分離總RNA。將該F蛋白基因通過PCR擴(kuò)增并測(cè)序。
[0097] 分離八個(gè) D25 MARM(RSV MARM A1-A5 和 B1-B3)。發(fā)現(xiàn) MARM A1-A5 具有相同的突 變（圖9)。發(fā)現(xiàn)MARM B2和B3具有相同的突變（圖9)。
[0098] 針對(duì)RSV MARM A1、B1和B2的突變體F蛋白如以下和圖10A中所示。信號(hào)肽被加 雙下劃線，在野生型RSV F A2蛋白中包括該構(gòu)象表位的區(qū)域被加下劃線。針對(duì)每種突變體 的突變體氨基酸加粗示出。
[0099] 這些突變位于：針對(duì)MARMA1突變體病毒為氨基酸N208Y、在MARMB1突變體病毒 中為氨基酸N201D、并且在MARMB2病毒中為氨基酸L204V。這個(gè)區(qū)域（以上序列中加下劃 線的）在該F蛋白的限定七殘基重復(fù)序列的C-端，其對(duì)于該蛋白的融合過程是關(guān)鍵性的。 這個(gè)鑒定的D25表位區(qū)域（在圖10B中由粗體白色箭頭表示）在RSV-F蛋白的表面上。
[0100] 在以下表2中對(duì)這些序列進(jìn)行比較： 表2 :D25MARM序列，相較于野生型RSV-F蛋白序列（這些突變的殘基處于粗體并且加 下劃線）
實(shí)例7 D25 MARM的中和測(cè)定
[0101] 進(jìn)行RSV微量中和測(cè)定以測(cè)試該分離的D25 MARM。這是基于細(xì)胞的ELISA測(cè)定， 其中將感染的ffip-2細(xì)胞針對(duì)表達(dá)該野生型或突變F蛋白進(jìn)行染色并針對(duì)抗體結(jié)合進(jìn)行測(cè) 試。
[0102] 首先，將單克隆抗體莫他珠單抗與D25針對(duì)對(duì)所有鑒定的D25MARM的中和活性進(jìn) 行比較。將D25或莫他珠單抗（l-1000ng/ml)的稀釋物用于該中和測(cè)定中，并且將野生型 RSV病毒用作陽性對(duì)照。如在圖11中所示，莫他珠單抗能夠以100ng/ml或更少莫他珠單抗 中和野生型RSV病毒和所有D25 MARM兩者（圖11C和11D)，而當(dāng)使用l-1000ng/ml的D25 時(shí)，D25僅能中和野生型病毒而不中和這些MARM中任一個(gè)（圖11A以及11B)。
[0103] 進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)比較D25和帕利珠單抗的中和活性。將D25或帕利珠單抗（0. 01 y g/ ml至10mg/ml)的稀釋物用于該微量中和測(cè)定中，并且將野生型RSV病毒用作陽性對(duì)照。如 在圖12中所示，約1 y g/ml的D25能夠中和野生型RSV病毒，并且大約100 y g/ml帕利珠 單抗能夠中和所有三種D25MARM。D25 MARM B1和MARM B2兩者對(duì)于D25中和完全不敏感 (13B和13C)，表明在位置201和204處的這些氨基酸對(duì)于D25結(jié)合是關(guān)鍵性的。另一方面， D25能夠中和A2 MARM，但最低限度地比中和野生型A2需要的濃度高100倍。 實(shí)例8 HR1和SK表位的構(gòu)建
[0104] 如實(shí)例5中所提到的，所鑒定的對(duì)于D25結(jié)合關(guān)鍵性的區(qū)域是在該F蛋白的限定 的HR1的C-末端，其對(duì)于該蛋白的融合過程是重要的。因此，制備含有該HR1區(qū)域的構(gòu)建 體（表1B)以測(cè)試該D25結(jié)合。
[0105] 此外，在約束建體中七殘基重復(fù)序列的C-末端的延伸和N-末端的截短似乎可以 更好的反映該D25表位的融合前結(jié)構(gòu)。這個(gè)稱為SK-表位的構(gòu)建體包含來自噴瓜胰蛋白酶 抑制劑II (EETI-II)的南瓜節(jié)（squash knot) (SK)構(gòu)建體的第一環(huán)中的A2的RSV-F蛋白 的氨基酸195-228,如圖13中所展示的。RSV-F蛋白的在位置212處的半胱氨酸被絲氨酸 替代。
[0106] 這些構(gòu)建體被表達(dá)于大腸桿菌中并且將這些蛋白進(jìn)行純化用于結(jié)合測(cè)定。 實(shí)例9 相較于HR1區(qū)域，D25更強(qiáng)地結(jié)合至SK-表位
[0107] 進(jìn)行生物膜層干涉技術(shù)分析以比較D25與SK-表位和HR1區(qū)域的結(jié)合親和力。將 D25施加到抗人IgG Fc捕獲傳感器，濃度范圍從1. 5625nM至100nM。將傳感器移至動(dòng)力學(xué) 緩沖液中以建立基線然后移到含有HR1片段或SK-表位構(gòu)建體的孔中。
[0108] 如在圖14中所示，D25以濃度依賴方式結(jié)合至HR1和SK-表位兩者。然而，相較 于HR1，D25對(duì)SK-表位顯示更高的親和力，如計(jì)算的心值（58. 5pM針對(duì)SK-表位，1. 9nM針 對(duì)HR1)所指出的。 氺氺氺
[0109] 本披露范圍不受所描述的具體實(shí)施例的限制，這些實(shí)施例意欲作為本披露的單獨(dú) 方面的簡(jiǎn)單說明，并且在功能上等效的任何組合物或方法均處于本披露的范圍內(nèi)。事實(shí)上， 除了在此示出并且描述的那些，本披露的各種改變從前述說明書和附圖對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員來說將變得清楚。這類改變旨在落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 呼吸道合胞病毒融合（RSV F)蛋白表面上的一個(gè)構(gòu)象表位，該表位包括在SEQ ID NO: 7的氨基酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34中的至少個(gè)6氨基酸，其中包括該 表位的RSV F蛋白可以被單克隆抗體D25或其抗原結(jié)合片段、變體、類似物或衍生物特異性 結(jié)合，其條件是該RSV F蛋白處于融合前構(gòu)象。2. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)象表位，其中包括該表位的處于融合前構(gòu)象的RSV F蛋白可 以被親和力比如下RSV F蛋白大至少100倍的單克隆抗體D25、或其片段、變體、類似物、或 衍生物結(jié)合，所述RSV F蛋白包括SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、或SEQ ID NO: 14的氨基 酸序列。3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的構(gòu)象表位，其中該表位被定位在人RSV亞型A F 蛋白的表面上。4. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的構(gòu)象表位，其中該表位被定位在人RSV亞型B F 蛋白的表面上。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述所述的構(gòu)象表位，其中mAb D25與該表位的結(jié)合被 加熱、長(zhǎng)期存儲(chǔ)、固定、或變性改變或破壞。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述所述的構(gòu)象表位，該表位是在F蛋白七殘基重復(fù)序 列的C-端。7. -種分離的結(jié)構(gòu)，包括 (a) 在SEQ ID NO:7的氨基酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34中的至少6個(gè) 氨基酸；特異性地結(jié)合至 (b) 單克隆抗體D25或其抗原結(jié)合片段、變體、類似物、或衍生物。8. 如權(quán)利要求7所述的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是晶體結(jié)構(gòu)。9. 一種分離的融合蛋白，包括 (a) 基本上由SEQ ID NO:7的氨基酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34組成的 RSV F蛋白片段；以及 (b) 多肽骨架； 其中該融合蛋白被約束在如下構(gòu)象內(nèi)，該構(gòu)象可以由單克隆抗體D25或其抗原結(jié)合片 段、變體、類似物、或衍生物特異性結(jié)合。10. 如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中該骨架包括表面暴露的外殼蛋白。11. 如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中所述表面暴露的外殼蛋白是蛋白酶抑制劑。12. 如權(quán)利要求11所述的融合蛋白，其中所述蛋白酶抑制劑是南瓜家族蛋白酶抑制 劑。13. 如權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其中所述蛋白酶抑制劑是噴瓜胰蛋白酶抑制劑 II(EETI-II)〇14. 如權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其中EETI-II的抑制劑環(huán)被SEQ ID NO:7的氨基 酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34替代。15. 如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，包括SEQ ID N0:5的序列。16. -種分離的多核苷酸，編碼如權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。17. -種表達(dá)載體，包含如權(quán)利要求16所述的多核苷酸。18. -種宿主細(xì)胞，包括如權(quán)利要求16所述的多核苷酸或如權(quán)利要求17所述的載體。19. 一種免疫原性組合物，包含如權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的融合蛋白和載體。20. -種用于鑒定抗RSV F蛋白抗體的方法，該方法包括針對(duì)結(jié)合至權(quán)利要求9至15 中任一項(xiàng)所述的融合蛋白但不單獨(dú)結(jié)合至該骨架的抗體來篩選抗體文庫。
【專利摘要】呼吸道合胞病毒是屬于副粘病毒家族的常見感冒病毒。RSV是具劇毒的，易傳播，并且在小于2歲齡的兒童中是下呼吸道疾病的最常見病因。在單個(gè)RSV季節(jié)，高達(dá)98％的參加日托的兒童會(huì)被感染。感染有RSV的0.5％和3.2％之間的兒童需要住院。在美國每年報(bào)道大約有90,000例入院以及4500例死亡。歸因于RSV而住院的主要風(fēng)險(xiǎn)因素是早產(chǎn)、慢性肺病、先天性心臟病、免疫功能受損、以及在其他健康兒童中年齡小于6周。
【IPC分類】A61P31/14
【公開號(hào)】CN105073196
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480007046
【發(fā)明人】N·厄布蘭德
【申請(qǐng)人】米迪繆尼有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2014年1月31日
【公告號(hào)】CA2900110A1, EP2950886A1, WO2014121021A1