Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物在抗病毒藥物中 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物及其制備方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【專利說明】
Sa IV i sk i none A的苯并咪性基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生 物的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純瘤疹病毒1型化erpes simplex virus，HSV-l)和單純瘤疹病毒2型化erpes simplex virus，HSV-2)屬于瘤疹科病毒，HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜瘤疹，同 時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴(yán)重感染甚至宮內(nèi)感染的重要病原。
[0003] 呼吸道合胞病毒（Respirato巧Syn巧tial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染， 在嬰幼兒、老年W及免疫缺陷人群引起嚴(yán)重肺炎，是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
[0004] 甲型流感病毒（Influenza A virus,Flu-A)屬于正粘科病毒，在人類和其他生物 每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)感染，甚者 引起肺炎、腦炎甚至死亡。
[0005] 上述Ξ種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物 中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物 最有重要價值。
[0006] 本發(fā)明設(shè)及的化合物I是一個2011年發(fā)表（Ayumi Ohsaki et al.， 2011 . Salviskinone A,a diterpene with a new skeleton from Salvia 口^6￥日131^;[.了日化日11日化0]11日1:1日'3 52(2011)1375-1377)的化合物，我們對化合物1進(jìn)行 了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物HI和化合物IV 制備了組合物，并對該組合物抗病毒活性進(jìn)行了評價，其具有抗病毒活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物ΙΠ 和化合物IV組成，該組合物 中化合物ΠI和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為5 %和95 %。
[000引
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可W制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接 受的鹽具有同樣的藥效。
[00川組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
[0012] W下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加 W限定。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1化合物Salviskinone A的制備
[0014] 化合物Salviskinone A(I)的制備方法參照Ayumi Ohsaki等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Ayumi Ohsaki et al.,2011.Salviskinone A,a diterpene with a new skeleton from Salvia przewalskii.Tetr址e化on Letters 52(2011)1375-1377)的方法。
[0015]
[0016] 實(shí)施例2 Salviskinone A的0-漠乙基衍生物（II)的合成
[0017] 將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四下基漠化錠（TBAB) (0.08g)，1，2-二漠乙燒(3.760g，20.0 Ommol)和6mL的50%氨氧化鋼溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攬拌12h"12h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲燒萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然 后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗涂4次，再用無水硫酸鋼干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.5，v/v)， 收集棟色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棟色粉末(327mg，78%)。
[001 引 iHMffi(500MHz，DMS0-d6)S6.63(s，lH)，6.37(s，lH)，5.81(s，lH)，4.51(s，2H), 3.84(s，lH)，3.79(s，2H)，2.15(s，lH)，2.04(s，lH)，1.91(s，lH)，1.65(s，lH)，1.39(s，3H), 1.08(3,6扣，0.99(3，細(xì)）.
[0019] "C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl88.07(s),183.70(s),154.38(s),147.57(s),140.21 (s),136.40(s),134.71(s),131.25(s),128.40(s),118.83(s),72.12(s),45.49(s),37.54 (s),33.58(s),31.78(s),26.17(s),25.12(s),24.66(s),23.51(s),23.17(s),22.65(s).
[0020] HRMS(ESI)m/z[M+扣+calcd for C2出2泌r03:419.1222;found 419.1220.
[0021]
[0022] 實(shí)施例3 Salviskinone A的0-(苯并咪挫基）乙基衍生物（III)的合成
[0023] 將化合物II(209mg，0.5mmo 1)溶于20mL乙臘當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鐘(345mg， 2.5mmo 1)，艦化鐘（84mg，0.5mmo 1)和苯并咪挫（1180mg，1 Ommo 1)，混合物加熱回流化。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲燒萃取Ξ次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.5，v/v)，收集棟色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物ΠI的棟色固體(215mg，43 % )。
[0024] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S8.15(s，lH),7.54(d，J=25.0Hz，2H),7.15(s，lH), 7.06(s，lH)，6.33(d，J = 84.1Hz，lH)，6.26(s，lH)，5.66(s，lH)，4.38(d，J=15.8Hz，4H)， 3.57(3，1扣，1.96(3，1扣，1.90(3，1扣，1.77(3，把），1.51(3，1扣，1.20(3,3扣，0.99(3，細(xì)）， 0.81(3，細(xì)）.
[002引"C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl87.90(s),183.51(s),154.17(s),147.37(s),146.27 (s),139.98(s),139.63(s),136.22(s),134.51(s),133.48(s),131.05(s),128.18(s), 123.93(s)，123.35(s)，118.56(d，J = 9.細(xì)z)，110.85(s)，68.55(s)，45.29(s)，44.74(s)， 37.34(s),33.36(s),25.96(s),24.94(s),24.46(s),23.32(s),22.96(s),22.42(s).
[0026] HRMS化SI):m/z[M+H]+calcd for C2姐33化〇3:457.2491;found:457.2493。
[0027]
[00巧]實(shí)施例4 Salviskinone A的0-(二徑乙胺基）乙基衍生物的合成
[0029] 將化合物II(209mg，0.5mmo 1)溶于30mL乙臘當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鐘(690mg， S.Ommol)，艦化鐘（252mg，1.5mmol)和二乙醇胺（1051mg，lOmmol)，混合物加熱回流9h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲燒萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和 食鹽水洗涂合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn) 物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100:0.5，v/v)，收集黃色集中洗脫帶 并揮去溶劑即得到Salviskinone A的0-(二徑乙胺基）乙基衍生物的淡黃色固體（159.5mg, 72%)。
[0030] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S6.52(s，lH)，6.40(s，lH)，5.71(s，lH)，4.15(s，2H), 3.70(s，lH)，3.37(s，4H)，3.00(s，2H)，2.50(s，4H)，2.07(s，lH)，1.96(s，lH)，1.83(s，lH), 1.57((1，1 = 1.4化，3扣，1.30(3,3扣，0.99(3，細(xì)），0.90(3,6扣.
[0031] 1化 NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl88.01(s),183.52(s),154.08(s),147.15(s),140.11 (s),136.23(s),134.42(s),130.84(s),128.31(s),118.62(s),68.93(s),58.73(s),56.61 (s),53.94(s),45.20(s),37.13(s),33.49(s),25.96(s),24.84(s),24.26(s),23.43(s), 22.97(s),22.33(s).
[0032] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26出8N〇5:444.2750;found:444.2746。
[0033]
[0034] 實(shí)施例5 Salviskinone A的0-(二氯乙胺基）乙基衍生物的合成
[0035] 將實(shí)施例4制備的Salviskinone A的0-(二徑乙胺基）乙基衍生物（0.222邑， 0.5mmol)溶于6mL氯仿，逐滴加入氯化亞諷(0.238g，2mmol)，反應(yīng)物加熱回流化。將反應(yīng)物 冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞諷，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化 (石油酸/丙酬100:0.3，v/v)，得到Salviskinone A的0-(二氯乙胺基）乙基衍生物的淡黃色 固體（170.0mg，71%)。
[0036] 1h NMR(500MHz，Chloroform-dl)S6.51(s，lH)，6.22(s，lH)，5.72(s，lH)，4.16(s, lH),3.66(s,lH),3.44(s,4H),3.01(s,2H),2.80(s,2H),2.64(s,2H),2.04(s,lH),1.98(s, 1扣，1.85(3，1扣，1.59(3，1扣，1.28(3,3扣，0.97(3,6扣，0.93(3，細(xì)）.
[0037] "C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl87.90(s),183.41(s),153.97(s),147.04(s),140.00 (s),136.12(s),134.31(s),130.73(s),128.20(s),118.51(s),68.82(s),55.57(s),53.94 (s),45.20(s),39.10(s),37.02(s),33.39(s),25.87(s),24.76(s),24.19(s),23.33(s), 22.88(s),22.25(s).
[003引 HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2姐36Ci2N03:480.2072;found:480.2070。
[0039]
[0040] 實(shí)施例6 Salviskinone A的0-(二（2-甲硫基乙基)胺基）乙基衍生物的合成將實(shí) 施例5制備的Salviskinone A的〇-(二氯乙胺基）乙基衍生物(0.240g，0.5mmol)溶于15血乙 醇，室溫下加入甲硫醇鋼(0.21 g，3mmo 1)，反應(yīng)物加熱回流比。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物 用硅膠柱層析進(jìn)行純化（石油酸/丙酬100 :0.5，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV (0.169g，67%)。
[004U 1h NMR(500MHz，Chloroform-dl)S6.48(s，lH)，6.41(s，lH)，5.65(s，lH)，4.12(s, 2H)，3.99(s，lH)，2.94(s，2H)，2.53(d，J=15.4Hz，8H)，1.99(s，lH)，1.94(s，6H)，1.90(s， 1扣，1.77(3，1扣，1.51(3，1扣，1.23(3,3扣，0.92(3,6扣，0.83(3，細(xì)）.
[0042] 1化 NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl87.81(s),183.42(s),154.08(s),147.28(s),139.90 (s),136.12(s),134.44(s),130.96(s),128.09(s),118.53(s),68.94(s),53.83(s),52.15 (s),45.21(s),37.24(s),33.29(s),31.87(s),25.85(s),24.86(s),24.38(s),23.21(s), 22.88(s),22.34(s),14.38(s).
[0043] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2姐42N〇3S2:504.2606;found:504.2603。
[0044]
[0045] 實(shí)施例7組合物抗病毒活性
[0046] ( - )實(shí)驗(yàn)例:組合物對瘤疹病毒的作用研究：
[0047] (1)細(xì)胞株與病毒株：
[004引人胚腎細(xì)胞化EK293，為HSV-1、HSV-2病毒敏感細(xì)胞)購自美國Clontech公司；單純 瘤疹病毒1型化SV-1) Sm44株、單純瘤癥病毒2型化SV-2) 333株引自中國CDC病毒病研究所。
[0049] (2)細(xì)胞毒性測定：
[0050] 組合物的制備:將研磨之后過200目網(wǎng)的5mg化合物III的粉末和研磨之后過200目 網(wǎng)的95mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用滿輪攬拌儀混合即得到lOOmg組合物，使 用時用水溶解運(yùn)1 OOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[0051] 參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將各樣品^2倍比做系列稀釋（2? ~5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的肥K293上，每孔lOOuL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔 (A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定0D值，將實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組 0D值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TDso)。
[0052] (3)抑毒試驗(yàn)：
[0053] 參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品按稀釋順序化3^4)橫向接 種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔lOOuL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100 個TCIDso的病毒lOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè) F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37 °C、5 %C〇2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察 4d。病毒對照出現(xiàn)90% W上WE時，加1 %中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長54化m波長讀取A值， 各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed- Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICsQ)，最終將TDsq和ICsQ相比獲得抑毒指數(shù)(ΤΙ)。
[0054] (4)結(jié)果：
[0055] ①樣品TDso的測定:對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物ΙΠ 和化合物IV的TDs廟肥K293分別為2-2'25、2-2'1 2、2-2'39。
[0056] ②抑毒實(shí)驗(yàn):對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-UHSV-2病毒對 照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%W上的C陽，HSV巧陽SV 2在肥K293C陽則W腫脹、多細(xì)胞融合 化SV 1致多個細(xì)胞融和成大泡，而服V 2致融合為小泡）、變圓、脫落為主要特征。
[0057] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:HSV 1-肥K293在第10稀釋度之前、HSV 2-肥K293組在第9稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn) CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[005引而化合物ΙΠ 和化合物IV處理組在2-3~6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 [0化9] 將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測45化mA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICso，ICso與TDso相比獲得組合物的ΤΙ:抑制 服V-UHSV-2在肥Κ293細(xì)胞發(fā)生CPE，IC日日分別為2-11'34、2-11'"，11分別為545.0、596.3?；?物III的TI:對應(yīng)的IC50分別為2^i4、2^'72，TI分別為2.0、6.1?；衔?￥的11:對應(yīng)的眠〇分 別為 2-4'48、2-4'74, TI 分別為 4.3、5.1。
[0060] 結(jié)論：組合物具有顯著的抗瘤疹科病毒（包括HSV-1、皿V-2)的作用，而且安全性 高，因此組合物在治療瘤疹病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。化合物III和化合物IV不 具有顯著的抗瘤疹科病毒(包括HSV-1、皿V-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III和 化合物IV在治療瘤疹病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0061] (二)實(shí)驗(yàn)例:組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
[0062] (1)組合物、化合物III和化合物IV的配置:將藥物溶于細(xì)胞維持液(含2%新生牛 血清的MEM，GIBIC0公司產(chǎn)品）中備用。
[0063] (2)細(xì)胞株與病毒株：
[0064] 人胚腎細(xì)胞化EK293，RSV病毒敏感細(xì)胞)購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病毒 (RSV) Long株引自中國CDC病毒病研究所。
[0065] (3)細(xì)胞毒性測定：
[0066] 參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實(shí)驗(yàn)研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品W2倍比做系列 稀釋(2<^^6)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的皿1(293上，每孔100祉，每稀釋度縱向 重復(fù)3孔(A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞為空白對照， 顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在54化m波長測定0D值，將實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞 對照組0D值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TDso)。
[0067] (4)抑毒試驗(yàn)：
[0068] 參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實(shí)驗(yàn)研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品按稀釋順序(2 ^3)橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔lOOuL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、 B、C行加含100個TCIDso的病毒lOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥 物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C02培養(yǎng)，每日觀察 CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90% W上WE時，加1 %中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm 波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存 活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（IC50)，最終將TDso和IC50相比獲得抑毒指數(shù) (ΤΙ)〇
[0069] (5)結(jié)果：
[0070] ①樣品TDso的測定:對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物IΠ 和化合物IV對肥K293的TDso分別為2 A 25、2 A13、2 A 68。
[0071] ②抑毒實(shí)驗(yàn):對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在第 2d出現(xiàn)90%W上的CPE，RSV在HEK293CPEW折光性增強(qiáng)、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0072] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0073] RSV-皿K293試驗(yàn)組細(xì)胞在第9稀釋度之前，細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，WE隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0074] 而化合物ΙΠ 和化合物IV處理組在濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
[00巧]將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測45化mA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICso，ICso與TDso相比獲得ΤΙ:組合物抑制RSV 在肥K293細(xì)胞發(fā)生CPE，ICsQ為2-11 ·"，ΤΙ為596.3;化合物ΠI的ICsQ為2-4· U，ΤΙ為4.0;化合物 1￥的1枯〇為2-4'64，了1為3.9。
[0076] 結(jié)論:組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可W用來制備 抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV的作用，不可W用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
[0077] (Ξ)實(shí)驗(yàn)例:組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0078] (1)細(xì)胞株與病毒株:狗腎細(xì)胞(MDCK，流感病毒敏感細(xì)胞）引自中國CDC病毒病研 究所;流感病毒甲型(Flu Α) 1995. All: 32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
[0079] (2)細(xì)胞毒性測定：
[0080] 參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將各樣品^2倍比做系列稀釋（2 -1~-S)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔lOOuL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔 (A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定0D值，將實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組 0D值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TDso)。
[0081 ] (3)抑毒試驗(yàn)：
[0082]參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008; 24( 1): 25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板 孔中的單層細(xì)胞上，每孔lOOuL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCIDso 的病毒lOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為 病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對 照出現(xiàn)90 % W上WE時，加1 %中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去 除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方 法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TDso和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[OOW] (4)結(jié)果：
[0084]①樣品TDso的測定:對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物IΠ 和化合物IV對的TDs廟MDCK分別為'28、'67、W。
[00化]②抑毒實(shí)驗(yàn):對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu A在MDCK (PEW 折光性增強(qiáng)、壞死、破碎為主要特征。
[0086] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE: FluA-MDCK組 細(xì)胞在第8稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0087] 而化合物ΙΠ 和化合物IV處理組在濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 [008引將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TDso相比獲得TI:組合物抑制 Flu A在MDCK細(xì)胞發(fā)生CPE，IC5Q為2-11·92，TI為744.4;化合物ΠI 的IC5Q為2-4·38，TI為3.6;化 合物 IV 的 IC50 為 2-4'89，TI 為 1.3。
[0089] 結(jié)論:組合物對甲型流感病毒具有很強(qiáng)的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒沒 有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染 疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0090] 實(shí)施例8本發(fā)明所設(shè)及組合物片劑的制備
[0091] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0092] 實(shí)施例9本發(fā)明所設(shè)及組合物膠囊的制備
[0093] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 π I和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為5 %和95 %，IV。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為5 %和9 5 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為甲型流 感病毒。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為單純皰 疹病毒。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為呼吸道 合胞病毒。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述單純皰疹病毒 為單純皰疹病毒1型或者單純皰癥病毒2型。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述單純皰疹病毒 1型為單純皰疹病毒1型的Sm44株。
【文檔編號】A61P31/12GK105998006SQ201610256821
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】王卓婷
【申請人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司