呼吸道合胞病毒f蛋白表位的制作方法
【專利說明】呼吸道合胞病毒F蛋白表位 對以電子方式提交的序列表的引用
[0001] 將與本申請一起以電子方式提交的處于ASCII文本文件形式的序列表的內(nèi)容（名 稱：序列表_ascii.txt;大小：31. 3千字節(jié)；以及創(chuàng)建日期2013年3月14日）通過引用以 其全文結(jié)合在此。 背景
[0002] 呼吸道合胞病毒（RSV)是屬于副粘病毒家族的常見感冒病毒。RSV是具劇毒的， 易傳播，并且在小于2歲齡的兒童中是下呼吸道疾病的最常見病因。在單個RSV季節(jié)，高達(dá) 98%的參加日托的兒童會被感染。感染有RSV的0.5%和3. 2%之間的兒童需要住院。在 美國每年報道大約有90, 000例入院以及4500例死亡。歸因于RSV而住院的主要風(fēng)險因素 是早產(chǎn)、慢性肺病、先天性心臟病、免疫功能受損、以及在其他健康兒童中年齡小于6周。除 以充足營養(yǎng)形式進(jìn)行的支持療法和氧療法外沒有可供使用的針對RSV陽性細(xì)支氣管炎的 有效處理?？共《警煼ɡ缋晚f林未被證明在RSV感染中有效。針對RSV預(yù)防目前沒有 可供使用的疫苗。
[0003] 現(xiàn)今唯一可用的RSV特異性治療是一種人源化單克隆抗體帕利珠單抗（也稱為 SYNAGIS?)，其通過美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)用于在高危嬰兒中預(yù)防RSV下呼吸道疾 病。然而，帕利珠單抗不總是有效的。另一種單克隆抗體，莫他珠單抗（在此還稱為"莫他 (mota) "），衍生自具有增強(qiáng)的抗病毒活性的帕利珠單抗。帕利珠單抗和莫他珠單抗兩者都 結(jié)合抗原部位A，即氨基酸258和275之間的RSV-F蛋白上的高度保守區(qū)域。已知最好的抗 F抗體（包括帕利珠單抗和莫他珠單抗）識別兩個構(gòu)象（其中RSV-F可以折疊）共享的表 位，即亞穩(wěn)定的融合前形式和高度穩(wěn)定融合后構(gòu)象。
[0004] 本披露提供了融合前構(gòu)象的RSV-F蛋白上的構(gòu)象表位，由最近鑒定的抗RSV單克 隆抗體D25(披露于W0 2008/147196中）識別。通過靶向融合前RSV-F結(jié)構(gòu)（針對抑制 RSV-F介導(dǎo)的融合的活性靶標(biāo)），本披露還提供了用于篩選更有效的較不易受非生產(chǎn)結(jié)合 事件影響的抗RSV抗體的方法，因此可以提供對RSV感染的更好預(yù)防或治療。 簡要概述
[0005] 在此提供的是呼吸道合胞病毒融合（RSVF)蛋白表面上的構(gòu)象表位，其中該表位 包括在SEQIDN0:7的氨基酸1至34或SEQIDN0:9的氨基酸1至34中的至少個6氨基 酸，其中包括該表位的RSVF蛋白可以被單克隆抗體D25或其抗原結(jié)合片段、變體、類似物 或衍生物特異性結(jié)合，條件是該RSVF蛋白處于融合前構(gòu)象。
[0006] 在一個方面，包括該表位的處于融合前構(gòu)象的RSVF蛋白可以被親和力比如下RSV F蛋白大至少100倍的單克隆抗體D25、或其片段、變體、類似物、或衍生物結(jié)合，所述RSVF 蛋白包括衍生自單克隆抗體抗性突變體（MARM)的F蛋白的氨基酸序列，其中來自這些該 獻(xiàn)冊的？蛋白包括5￡〇10勵：12、5￡〇10勵：13、或5￡〇10勵：14的氨基酸序列。該表位 可能出現(xiàn)在人RSV亞型AF蛋白的表面上，并且還出現(xiàn)在人RSV亞型BF蛋白的表面上。
[0007] 在某些方面，已知破壞RSVF蛋白的融合前構(gòu)象的不同處理（例如，加熱、長期存 儲，固定、或變性）改變或破壞mAbD25與在此提供的構(gòu)象表位的結(jié)合。
[0008] 在此提供的構(gòu)象表位位于F蛋白七殘基重復(fù)序列的C-端。
[0009] 進(jìn)一步提供的是包括上述構(gòu)象表位的，特異性結(jié)合至mAbD25或其抗原結(jié)合片段、 變體、類似物、或衍生物的分離的抗原-抗體結(jié)構(gòu)。在某些方面，該結(jié)構(gòu)是晶體結(jié)構(gòu)。
[0010] 進(jìn)一步提供的是分離的融合蛋白，其包含基本上由SEQ ID N0:7的氨基酸1至34 或SEQ ID N0:9的氨基酸1至34組成的RSV F蛋白片段；以及多肽骨架，其中該骨架將該F 蛋白片段約束在如下構(gòu)象內(nèi)，該構(gòu)象可以由單克隆抗體D25或其抗原結(jié)合片段、變體、類似 物、或衍生物特異性結(jié)合。在某些方面，該骨架衍生自表面暴露的外殼蛋白，例如蛋白酶抑 制劑，例如南瓜家族蛋白酶抑制劑。在某些具體實(shí)施例中，該骨架是來源于噴瓜（Ecballium elaterium)胰蛋白酶抑制劑II(EETI-II)。在某些方面，EETI-II的抑制劑環(huán)被SEQ ID NO:7的氨基酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34替代。在某些方面，該融合蛋白包 含SEQ ID N0:5的序列。
[0011] 進(jìn)一步提供的是編碼在此提供的融合蛋白的分離的多核苷酸、包括該多核苷酸的 表達(dá)載體和/或包括該多核苷酸或該載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 在某些方面，在此提供的融合蛋白可以是包括該融合蛋白以及載體、賦形劑、和/ 或佐劑的免疫原性組合物的部分。
[0013] 在一個另外的方面，在此提供的融合蛋白可以用在用于鑒定抗RSV F蛋白抗體的 方法中，這些抗RSV F蛋白抗體結(jié)合至在此提供的構(gòu)象表位，其中該方法包括針對結(jié)合至權(quán) 利要求9至15中任一項所述的融合蛋白但不單獨(dú)結(jié)合至該骨架的抗體來篩選抗體文庫。 附圖/圖簡要說明
[0014] 圖1顯示D25單克隆抗體與感染有RSV A2病毒（ATCC VR-1540)的未固定的和丙 酮固定ffip-2細(xì)胞的結(jié)合，與帕利珠單抗、莫他珠單抗和R347 (作為陰性對照）的結(jié)合進(jìn)行 比較。
[0015] 圖2顯示Eu3+-標(biāo)記的莫他珠單抗（"莫他"）和D25與從頭或熱處理的RSV-F蛋 白的結(jié)合。被RSV A2 F蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293個細(xì)胞被保持在冰上或在水浴中在55°C處理 15分鐘。
[0016]圖 3 顯不生物膜層干涉技術(shù)分析（Biolayer Interferometry Analysis)(圖 3A) 以測試莫他珠單抗（"莫他"）和D25與從頭或熱處理的RSV-F蛋白的結(jié)合（圖3B)。R347 用作陰性對照。
[0017] 圖4顯示在4°C儲存之后D25與RSV-F蛋白的結(jié)合的緩慢損失，與在相同條件下莫 他珠單抗（"莫他"）與RSV-F蛋白的結(jié)合進(jìn)行比較，如通過生物膜層干涉技術(shù)分析的。
[0018] 圖5顯示生物膜層干涉技術(shù)分析以測試莫他珠單抗和D25與從頭或熱處理的 RSV-F蛋白的結(jié)合，接著是與兔抗-6-螺旋束多克隆抗體（圖5B)或抗-RSV-F C位點(diǎn)單克 隆抗體1331H(圖5B插入圖）的隨后結(jié)合。莫他珠單抗和D25被固定至抗人IgG Fc捕獲 傳感器（圖5A)。
[0019] 圖6顯示RSV-F蛋白上已知的抗原部位。RSV-F具有至少六個不同的通常描述的 中和抗原位點(diǎn)，包括位點(diǎn)A/II、B/I、和C。
[0020] 圖7顯示競爭結(jié)合測定，使用具有已知的抗原位點(diǎn)的不同的抗-RSV-F抗體，以鑒 定D25表位。對于所有這些結(jié)合測定使用100ng/ml生物素標(biāo)記D25抗體。圖7A-D顯示通 過已知的抗RSV-F抗體分別與A/II、B/I、C或未知位點(diǎn)的結(jié)合的競爭。
[0021] 圖8顯示，氨基酸209對于抗體AM23的中和活性是重要的。
[0022] 圖9顯示在提出的D25抗原性位點(diǎn)中RSV-F野生型序列和D25單克隆抗體抗性突 變體（MARM)的比對。加框的氨基酸指示這些突變。
[0023] 圖10顯示RSV-F蛋白上的D25表位的作圖。圖10A是顯示在鑒定的D25單克隆 抗體抗性突變體（MARM)中的3個氨基酸突變的定位的圖解。圖10B是顯示RSV-F蛋白表 面上的鑒定的D25表位的定位的空間填充模型。粗體白色箭頭指示鑒定的D25結(jié)合的臨界 表位區(qū)域。
[0024] 圖11顯示比較了 D25和莫他珠單抗（"莫他"）單克隆抗體對D25MARM的活性的 中和測定。
[0025] 圖12顯示通過帕利珠單抗和D25單克隆抗體進(jìn)行的對感染有D25MARM的細(xì)胞的 基于細(xì)胞的中和測定。
[0026] 圖13是說明了 SK-表位的構(gòu)建的圖解。加下劃線的序列對應(yīng)于RSV A2 F蛋白的 氨基酸195-211，并且加雙下劃線的序列對應(yīng)于RSV A2 F蛋白的氨基酸212-228,該RSV A2 F蛋白具有C212S取代。
[0027] 圖14顯示通過生物膜層干涉技術(shù)分析的D25與RSV A2 F蛋白的HR1區(qū)域或SK-表 位的結(jié)合的比較。 詳細(xì)說明 定義
[0028] 貫穿本披露，術(shù)語"一個（a/an) "或"一種（a/an) "實(shí)體是指一個或多個或一種或 多種該實(shí)體；例如，"一種多核苷酸"應(yīng)被理解為表示一種或多種多核苷酸。因此，術(shù)語"一 個"（或"一種"）、"一個或多個（一種或多種）"、以及"至少一個""至少一種"）在此可 互換地使用。
[0029] 此外，在本文中使用"和/或"應(yīng)當(dāng)理解為在有或沒有另一者的情況下，兩個指定 的特征或組分中的每一者的特定披露。因此，如在此在措詞如"A和/或B"中所使用的術(shù) 語"和/或"旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"（單獨(dú)）、以及"B"（單獨(dú)）。同樣，如在措詞 如"A、B和/或C"中所使用的術(shù)語"和/或"旨在涵蓋以下方面中的每一者：A、B、和C ;A、 B、或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A (單獨(dú)）；B (單獨(dú)）；以及C (單獨(dú)）。
[0030] 應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)用語言"包含"來說明方面時，還提供了關(guān)于"由……組成"和/或"主 要由……組成"描述的其他類似方面。
[0031] 除非另外定義，在此所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本披露涉及的領(lǐng)域所屬 的技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。例如，生物醫(yī)學(xué)與分子生物學(xué)簡明詞典（Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo, Pei-Show，第二版，2002, CRC 出版社；細(xì)胞與分子生物學(xué)詞典（The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第 三版，1999,學(xué)術(shù)出版社（Academic Press);以及生物化學(xué)與分子生物學(xué)牛津詞典（Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修訂版，2000,牛津大學(xué)出版社 (Oxford University Press)為技術(shù)人員提供了在本披露中使用的許多術(shù)語的通用詞典。
[0032] 單位、前綴和符號均以它們的國際單位系統(tǒng)（SI)接受形式表示。數(shù)值范圍包括定 義該范圍的數(shù)字。除非另外指明，否則氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左到右書寫。在 此提供的小標(biāo)題不是本披露的不同方面的限制，可以通過作為一個整體參考本說明書來獲 得這些方面。因此，通過以其全文參考說明書，更完全地定義了就在以下定義的術(shù)語。
[0033] 如在此使用的，術(shù)語"多肽"旨在涵蓋單數(shù)"多肽"以及復(fù)數(shù)"多肽"，并且包含兩個 或更多個氨基酸的任何鏈或多個鏈。因此，如在此使用的，"肽"、"肽片段"、"蛋白"、"氨基酸 鏈"、"氨基酸序列"、或用來指代兩個或更多個氨基酸的鏈或多個鏈的任何其他術(shù)語，都一 般被包括在定義"多肽"中，盡管這些術(shù)語的每一者都可具有更具體的含義。術(shù)語"多肽"可 以用來替代任何這些術(shù)語或者與其可互換地使用。該術(shù)語進(jìn)一步包括已經(jīng)歷翻譯后或合成 后修飾的多肽，這些修飾例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、通過已知保護(hù)/阻斷基團(tuán) 進(jìn)行的衍生、蛋白水解裂解或通過非天然存在的氨基酸進(jìn)行的修飾。
[0034] 更確切地說，如在