一種真皮組織仿生多孔支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用仿生材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種以絲蛋白和海藻酸為原料， 制備真皮組織仿生多孔支架的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 燒創(chuàng)傷等開(kāi)放性傷口所造成的皮膚缺損是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，在皮膚缺損修復(fù) 過(guò)程中，傷口過(guò)度愈合會(huì)導(dǎo)致病理性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢 痕疙瘩，會(huì)導(dǎo)致瘙癢、毀容、殘疾等一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，有時(shí)甚至誘發(fā)惡性腫瘤，嚴(yán)重降低 患者的生存質(zhì)量。因此，病理性瘢痕的防治一直是燒傷、整形等外科學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的醫(yī) 學(xué)問(wèn)題。
[0003] 近年來(lái)，隨著創(chuàng)面愈合機(jī)制研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到，瘢痕形成與真皮組織缺 失程度具有高度相關(guān)性，這一理論在臨床實(shí)踐中得到了佐證，如淺度燒傷創(chuàng)面在愈合后新 生組織與正常皮膚類(lèi)似，而深度燒傷創(chuàng)面在愈合后將形成病理性瘢痕。這一理論提示：真皮 組織的存在能夠抑制瘢痕形成。因此，發(fā)揮真皮組織作用的真皮替代物已被臨床用于促進(jìn) 深度皮膚缺損創(chuàng)面的愈合和抑制瘢痕形成。然而，現(xiàn)有真皮替代物仍然未達(dá)到抑制病理性 瘢痕發(fā)生和發(fā)展的目標(biāo)。目前，已上市真皮替代物產(chǎn)品可分為兩類(lèi)：脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和體外 合成高分子支架。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是由人尸體皮、豬皮、豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細(xì)胞處理所得 到的成分異質(zhì)的高分子支架材料，其主要成分為膠原蛋白。體外合成高分子支架是由合成 高分子（如polyglactin)或動(dòng)物源天然高分子（如膠原蛋白和/或糖胺聚糖）等體外合 成的高分子支架。
[0004] 已有仿真皮材料在促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和抑制瘢痕形成兩方面發(fā)揮了有效作用，但在臨 床應(yīng)用過(guò)程中仍然存在不足之處。首先，由于加工工藝難以控制，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)類(lèi)仿生真 皮的質(zhì)量不穩(wěn)定，各生產(chǎn)批次之間往往存在質(zhì)量差別，這將影響其作為真皮替代物修復(fù)創(chuàng) 面的應(yīng)用效果，并可能造成二次手術(shù)等嚴(yán)重后果。其次，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)仿生真皮存在生物 污染的可能性，由于原料人尸體皮可能攜帶病毒，并且這些病毒在材料加工過(guò)程中未被有 效清除，而導(dǎo)致病毒傳播。再次，體外合成仿生真皮在創(chuàng)面的降解速度與組織生成的速度不 匹配，往往因降解過(guò)快而導(dǎo)致其促進(jìn)傷口修復(fù)和抑制瘢痕形成的作用減弱。另外，現(xiàn)有仿生 真皮在抑制瘢痕形成方面的作用效果遠(yuǎn)未達(dá)到促進(jìn)功能性類(lèi)真皮組織再生的目標(biāo)。究其原 因，仿生真皮在加工過(guò)程中結(jié)構(gòu)被破壞和體外合成仿生真皮未實(shí)現(xiàn)對(duì)真皮組織的仿生是影 響仿真皮材料促進(jìn)真皮組織再生的重要因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種真皮組織仿生多孔支架的制備方 法。本發(fā)明真皮組織仿生多孔支架材料可有效促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和抑制瘢痕形成，燒創(chuàng)傷等開(kāi) 放性傷口有很好的治療效果。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，所述真皮組織仿生多空支架所含原料的 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為：絲蛋白50%~90%，海藻酸10%~50% ;具體制備步驟為：
[0008] (1)將蠶繭置于Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水潤(rùn)洗3次，制得蠶絲 素纖維；然后將蠶絲素纖維置于溴化鋰溶液中，37°C條件下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液； 最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3天后，得絲蛋白溶液，調(diào)節(jié)溶液 質(zhì)量百分濃度為5% ;
[0009] (2)將步驟（1)制得的絲蛋白溶液與質(zhì)量百分濃度為2%的海藻酸溶液在37°C條 件下按體積比4~36:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均 勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0010] (3)將步驟（2)離心后的混合液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風(fēng)風(fēng)速為0. 3米/秒的通風(fēng)櫥中央，放置時(shí)間為24h，形成絲蛋白/ 海藻酸高分子膜；
[0011] (4)將絲蛋白/海藻酸高分子膜浸沒(méi)于濃度為0. 002M的氯化鈣水溶液中，37°C下 孵育2h，然后將所得高分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，重復(fù)三次最后將高分子膜在 300ml液氮溶液中冷凍lOmin ;
[0012] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時(shí)間18h，制得絲蛋白/海藻酸復(fù)合材料，即所述真皮組織仿 生多孔支架。
[0013] 步驟⑴中所述Na2C03水溶液濃度為0. 01~1M ;所述溴化鋰溶液的濃度為1~ 20M〇
[0014] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0015] (1)本發(fā)明絲蛋白分子能夠發(fā)生物理交聯(lián)，避免了在構(gòu)建仿生真皮組織的過(guò)程中 引入有毒的化學(xué)交聯(lián)劑，提高材料的生物相容性，絲蛋白分子結(jié)構(gòu)中約含有85%的甘氨酸、 丙氨酸和絲氨酸的重復(fù)嵌段，這些重復(fù)嵌段之間會(huì)形成氫鍵而使絲蛋白分子內(nèi)部或絲蛋白 分子之間產(chǎn)生疏水結(jié)構(gòu)，這種疏水結(jié)構(gòu)使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，而避免使用化學(xué)交聯(lián) 劑。
[0016] (2)本發(fā)明通過(guò)水蒸氣蒸發(fā)使絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)的方法，能夠促進(jìn)絲蛋白 基支架材料對(duì)真皮組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的仿生性能，降低了所制備的絲蛋白/海藻酸多孔 支架的硬度，有利于仿生真皮組織抑制瘢痕形成和促進(jìn)真皮組織再生的功能，這是由于水 蒸氣蒸發(fā)過(guò)程能夠促進(jìn)絲蛋白分子自組裝形成Silk I結(jié)構(gòu)并抑制Silk II結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，而 在甲醇水溶液中絲蛋白分子發(fā)生自組裝主要形成Silk II結(jié)構(gòu)，即0-sheet結(jié)構(gòu)。當(dāng)絲蛋 白分子的物理交聯(lián)形式主要為Silk I時(shí)，絲蛋白基支架材料在孔結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能方面優(yōu)于 以Silk II結(jié)構(gòu)為主的相應(yīng)材料，使其在力學(xué)性質(zhì)方面與真皮組織更加接近。
[0017] (3)本發(fā)明海藻酸分子的引入能夠提高真皮成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞在絲蛋 白/海藻酸多孔支架中的黏附和增殖活性；對(duì)絲蛋白自組裝過(guò)程具有調(diào)控作用；糖胺聚糖 通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等發(fā)生相互作用，提高這些蛋白質(zhì)信號(hào)分子的 生物利用度，從而提高細(xì)胞的生物活性；海藻酸的分子結(jié)構(gòu)與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中的糖胺聚 糖結(jié)構(gòu)類(lèi)似，能夠發(fā)揮與糖胺聚糖類(lèi)似的生物學(xué)作用，因而，在絲蛋白支架中引入海藻酸能 夠促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性和增殖活性。
[0018] (4)本發(fā)明采用鈣離子對(duì)絲蛋白/海藻酸多孔支架進(jìn)行交聯(lián)處理，此化學(xué)交聯(lián)法 能夠?qū)⒑Ｔ逅岱肿庸潭ㄓ诮z蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中，形成互穿網(wǎng)絡(luò)，從而阻礙酶在支架網(wǎng)絡(luò)中的 擴(kuò)散和活性，減慢絲蛋白/海藻酸的生物降解速度。
[0019] (5)本發(fā)明采用真空冷凍干燥處理獲得絲蛋白/海藻酸多孔支架，能夠材料在干 態(tài)下保持其多孔結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性。
[0020] (6)本發(fā)明通過(guò)水蒸氣蒸發(fā)法使多孔支架中的絲蛋白分子發(fā)生物理交聯(lián)，改善了 絲蛋白基多孔支架材料的微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了材料的多孔性能；并且，通過(guò)此制備方法，絲蛋白 基支架材料的硬度降低，接近正常皮膚的彈性；本發(fā)明所涉及的多孔支架為完全互穿網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu)，離子交聯(lián)的海藻酸網(wǎng)絡(luò)能夠提高材料的生物相容性，促進(jìn)真皮組織所含細(xì)胞對(duì)支架 的黏附性和在支架中的增殖活性；海藻酸是細(xì)胞外基質(zhì)所含糖胺聚糖的擬似物，糖胺聚糖 有利于提尚細(xì)胞的活性。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得真皮組織仿生多孔支架的掃描電鏡圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明對(duì)比例1所得純絲蛋白膜的掃描電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，具體制備步驟為：
[0026] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 02M Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水 潤(rùn)洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于10ml的10M溴化鋰溶液中，37°C條件下 溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3 天后，得絲蛋白溶液，調(diào)節(jié)溶液質(zhì)量百分濃度為5% ;
[0027] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質(zhì)量百分濃度為2%的海藻酸溶液在37°C條 件下按體積比10:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均勾，然 后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0028] (3)將步驟⑵離心后的混合液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風(fēng)風(fēng)速為0. 3米/秒的通風(fēng)櫥中央，放置時(shí)間為24h，形成絲蛋白/ 海藻酸高分子膜；
[0029] (4)將絲蛋白/海藻酸高分子膜浸沒(méi)于濃度為0. 002M的氯化鈣水溶液中，37°C下 孵育2h，然后將所得高分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，重復(fù)三次最后將高分子膜在 300ml液氮溶液中冷凍lOmin;
[0030] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時(shí)間18h，制得絲蛋白/海藻酸復(fù)合材料，即所述真皮組織仿 生多孔支架。其中，絲蛋白的質(zhì)量百分含量為72 %，海藻酸的質(zhì)量百分含量為28 %。
[0031] 通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察實(shí)施例1所述的真皮組織仿生多孔支架的微觀結(jié)構(gòu)，如 圖1所示。由圖1可以看出，由水蒸氣蒸發(fā)處理所得的真皮組織仿生多孔支架，其內(nèi)部微觀 結(jié)構(gòu)為聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] -種真皮組織仿生多孔支架的制備方法，具體制備步驟為：
[0034] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 05M Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水