氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物質(zhì)的新的制藥用途，具體涉及氧化鐵納米顆粒在制備改善藥物耐藥性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，分子靶向治療是治療肺癌的新途徑。厄洛替尼(英文:Erlotinib )是目前晚期非小細胞肺癌的一線革El向治療藥物，顯著地延長了患者的生存期。厄洛替尼在不同的患者有不同的治療效果，其關(guān)鍵的分子標(biāo)志物是表皮生長因子受體(EGFR)。在一項被稱為IPASS (EGFR抑制劑泛亞洲研究)的研究中，EGFR小分子抑制劑在晚期EGFR突變陽性肺腺癌患者的一線治療中明顯優(yōu)于標(biāo)準的化療，而EGFR突變陰性患者使用抑制劑的療效就差得多，這提示EGFR突變是一個治療的分子標(biāo)志物。然而盡管有EGFR激活突變的肺癌患者對酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)更好，但幾乎所有的患者都會發(fā)生耐藥，引起腫瘤復(fù)發(fā)。研究表明=EGFR基因中的新突變以及EGFR下游的信號分子以及其他信號通路仍處于激活狀態(tài)是耐藥產(chǎn)生的原因。對于厄洛替尼耐藥的肺癌患者并無很好的治療方法，目前主要是采用聯(lián)合用藥對抗這種耐藥性。因此，研究逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥的解決方法和機制，對于小細胞肺癌的治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于尋找到一種改善厄洛替尼耐藥性的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)與厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制腫瘤的生長，從而了解到該物質(zhì)新的醫(yī)藥用途，從而解決厄洛替尼小細胞肺癌治療時產(chǎn)生耐藥的問題。
本發(fā)明的發(fā)明人團隊經(jīng)過大量研究證實:氧化鐵納米顆?？赡芡ㄟ^ERBB2，ERBB3，ERBB4下游的信號通路，從而增強肺癌細胞對于厄洛替尼的敏感性。因此，本發(fā)明提出:氧化鐵納米顆粒可以用于制備改善厄洛替尼耐藥性的藥物。
[0004]氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性的藥物時，氧化鐵納米顆粒與厄洛替尼的質(zhì)量配比一般為:1~40:1，氧化鐵納米顆粒每日用量不大于10mg/kg。
[0005]氧化鐵納米顆粒具備超順磁性，生物安全度高，廣泛應(yīng)用于人體磁共振成像的研究。而本發(fā)明人團隊發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的肺癌細胞H358和耐藥細胞株A549中同時用氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼處理，可以顯著增強抗腫瘤細胞增殖的作用。在裸鼠實驗中，用耐藥細胞株A549皮下成瘤構(gòu)建移植瘤模型，氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用也可以顯著抑制腫瘤的生長，提示氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼有協(xié)同作用，可以促進肺癌細胞對厄洛替尼的敏感性。本發(fā)明為厄洛替尼抵抗的肺癌患者的臨床治療提供了強有力的技術(shù)支持和分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【附圖說明】
[0006] 圖1:不同濃度的氧化鐵納米顆粒對肺癌A549細胞的增殖抑制作用；
圖2:氧化鐵納米顆粒與厄洛替尼聯(lián)用對人非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用；圖3:氧化鐵納米顆粒與厄洛替尼聯(lián)用對人非小細胞肺癌H358細胞的增殖抑制作用；圖4:裸鼠的皮下移植瘤抑制率實驗中剝除后的瘤體對照圖；其中A為NC組，B為厄洛替尼組，C為氧化鐵納米顆粒組，D為氧化鐵納米顆粒+厄洛替尼組；
圖5:裸鼠的皮下移植瘤抑制率實驗中體內(nèi)成瘤生長曲線圖；
圖6:A549和H358 EGFR磷酸化抗體芯片表達結(jié)果圖；
圖7:A549EGFR磷酸化抗體芯片表達水平柱狀圖；
圖8:H358EGFR磷酸化抗體芯片表達水平柱狀圖。
【具體實施方式】
[0007]
實施例1:氧化鐵納米顆粒的制作
將葡聚糖、氯化亞鐵、氯化鐵按質(zhì)量比39.6:1:2.7的比例混合，60°C混合反應(yīng)I h，反應(yīng)過程中緩慢滴加等體積的氨水。反應(yīng)產(chǎn)物12 000 r/ min離心15 min,取上清，用0.22um濾膜過濾。繼續(xù)12 000 r/ min，去除上清，用150 mmol/L NaCl溶液洗滌后重懸。
[0008]生成物的檢測:生成物氧化鐵納米顆粒的直徑在1nm以下。在酸性條件時，納米顆粒的zeta電位為正電性；在中性和堿性條件下，納米顆粒的zeta電位為負電性。
[0009]實施例2:氧化鐵納米顆粒對人非小細胞肺癌A549增殖抑制實驗
第一天每孔加入10ul 5000個小細胞肺癌A549細胞，加培基至體積200ul，第二天待細胞貼壁后，分別給予不同濃度(2mM、200uM、20uM、2uM、200nM、20nM、2nM、0.2nM、0.02nM、
0.002nM)氧化鐵納米顆粒處理。在處理后2天，每孔加入20微升CCK-8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5-4小時，在450nm測定吸光度。
[0010]如圖1所示，不同濃度的氧化鐵納米顆粒處理肺癌A549細胞，結(jié)果顯示2mM和200uM的氧化鐵納米顆粒對肺癌A549細胞有明顯的抑制作用。
[0011]實施例3:氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼聯(lián)合用藥對人非小細胞肺癌A549、H358細胞增殖實驗
第一天每孔加入10ul 5000個細胞非小細胞肺癌A549、H358細胞，加培基至體積200ul，第二天待細胞貼壁后，給予不同濃度的厄洛替尼(5uM、10uM、20uM、40uM)和200uM氧化鐵納米顆粒處理。在處理后的相應(yīng)的天數(shù)，每孔加入20微升CCK-8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5-4小時，在450nm測定吸光度。
[0012]如圖2和圖3所示，氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼聯(lián)合用藥對人非小細胞肺癌A549、H358細胞增殖抑制實驗。結(jié)果顯示氧化鐵納米顆?？梢悦黠@增強厄洛替尼的抑制肺癌細胞A549 (見圖2)和H358 (見圖3)增殖的作用。
實施例4:裸鼠的皮下移植瘤抑制率實驗
BALB/C裸鼠，雌性，20-25克，SPF級；A549細胞濃度至17/毫升；將16總數(shù)的A549細胞注射至BALB/C裸鼠皮下，等大約一個月后裸鼠皮下成瘤。
[0013]將成瘤后小鼠分成4組，分別為生理鹽水注射組(NC組)、厄洛替尼2.5mg/kg)注射組，氧化鐵納米顆粒(10mg/kg)注射組，厄洛替尼2.5mg/kg) +氧化鐵(10mg/kg)納米顆粒注射組。注射方式為腹腔注射荷瘤小鼠，每兩天給藥一次。分別于不同的時間點測量皮下瘤的大小。最后一次測量大小后，引頸法處死小鼠，稱體重，剝?nèi)×鰤K。
[0014]圖4為剝除后的瘤體；圖5體內(nèi)成瘤生長曲線。如圖4和圖5所示，氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼聯(lián)合用藥對人非小細胞肺癌A549裸鼠模型的腫瘤抑制作用。結(jié)果顯示氧化鐵納米顆?？梢悦黠@增強厄洛替尼的抑制裸鼠成瘤。
[0015]實施例5:氧化鐵納米顆粒引起EGFR下游的信號分子變化的細胞實驗
在50ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)A549和H358細胞，待細胞長滿培養(yǎng)瓶的80%時，將細胞用空白對照、厄洛替尼(20uM )、200uM氧化鐵納米顆粒、厄洛替尼(20uM )+200uM氧化鐵納米顆粒分四組進行分別處理。處理48小時后，用RayB1tech公司人類表皮生長因子受體磷酸化抗體芯片試劑盒做EGFR下游的信號分子表達水平變化。結(jié)果如圖6-8所示:圖6為A549細胞和H358細胞的EGFR磷酸化抗體芯片表達結(jié)果圖，圖7為A549細胞EGFR磷酸化抗體芯片表達水平柱狀圖，圖8為H358細胞EGFR磷酸化抗體芯片表達水平柱狀圖。
【主權(quán)項】
1.氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性藥物的應(yīng)用，所述氧化鐵納米顆粒與厄洛替尼的質(zhì)量配比為1~40:1，氧化鐵納米顆粒每日劑量不大于10mg/kg。2.如權(quán)利要求1所述的氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性藥物的應(yīng)用，所述氧化鐵納米顆粒直徑不大于10nm。3.如權(quán)利要求2所述的氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性藥物的應(yīng)用，所述氧化鐵納米顆粒的制備方法為:將葡聚糖、氯化亞鐵、氯化鐵按質(zhì)量比39.6:1:2.7的比例混合，60°C混合反應(yīng)I h，反應(yīng)過程中緩慢滴加等體積的氨水；反應(yīng)產(chǎn)物12000 r/ min離心15 min，取上清，用0.22um濾膜過濾；繼續(xù)12000 r/ min離心，去除上清，用150 mmol/L NaCl溶液洗滌后重懸，得到所述氧化鐵納米顆粒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性藥物的應(yīng)用，氧化鐵納米顆粒用于制備改善厄洛替尼耐藥性的藥物時，氧化鐵納米顆粒與厄洛替尼的質(zhì)量配比一般為：1~40：1，氧化鐵納米顆粒每日用量不大于10mg/kg。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的肺癌細胞H358和耐藥細胞株A549中同時用氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼處理，結(jié)果顯示可以顯著增強抗腫瘤細胞增殖的作用。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)氧化鐵納米顆粒和厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用可以顯著抑制腫瘤的生長，提示氧化鐵納米顆?？赡芡ㄟ^ERBB2，ERBB3，ERBB4下游的信號通路，從而增強肺癌細胞對于厄洛替尼的敏感性。本發(fā)明為厄洛替尼抵抗的肺癌患者的臨床治療提供了解決方案。
【IPC分類】A61K9/16, A61K31/517, A61P35/00, A61K33/26
【公開號】CN105055447
【申請?zhí)枴緾N201510344993
【發(fā)明人】唐敬群, 張美麗, 喻風(fēng)雷, 向娟娟, 李桂源, 李征
【申請人】中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年6月23日