心臟或血管組織型球體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種心臟及血管組織型球體以及其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]以獲得了 2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)、生理學(xué)獎(jiǎng)的京都大學(xué)山中教授的iPS細(xì)胞(reprograming)技術(shù)為開(kāi)端，近年來(lái)的組織干細(xì)胞等的發(fā)現(xiàn)、向臨床應(yīng)用的開(kāi)發(fā)、研究非常醒目。以源自干細(xì)胞的細(xì)胞的臨床應(yīng)用為目標(biāo)的、分化效率或安全性、純化的研究等正在世界范圍進(jìn)行，另一方面，由細(xì)胞構(gòu)建組織等并移植的技術(shù)的開(kāi)發(fā)也是當(dāng)務(wù)之急。
[0003]作為通過(guò)這些技術(shù)得到的細(xì)胞在臨床的利用方法有通過(guò)將細(xì)胞直接注入臟器、或利用靜脈或動(dòng)脈注射的方法而進(jìn)行，認(rèn)為存在生長(zhǎng)效率變差等問(wèn)題(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。另一方面，從1993年開(kāi)始由Vacanti等提倡組織工程(Tissue Engineering:TE)的概念，提倡利用骨膠原或聚乳酸等的生物體溶解性的支架并構(gòu)建組織的技術(shù)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。由于該方法使用外來(lái)異物作為支架，因此，還有要解決相對(duì)于生物體溶解性原料的過(guò)敏、感染癥等問(wèn)題的課題。因此，提出了不使用支架而僅用細(xì)胞制備組織的技術(shù)。
[0004]作為僅用細(xì)胞制備功能性的組織的技術(shù)，近年來(lái)，使用溫度感應(yīng)性片材的方法形成僅用細(xì)胞構(gòu)建的片材，臨床應(yīng)用于以心肌、角膜、食道等作為對(duì)象的再生醫(yī)療(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。但是，僅用細(xì)胞構(gòu)建組織(例如心肌、血管、軟骨、瓣膜等)，使其具有形態(tài)學(xué)的特征或力學(xué)作用方式的技術(shù)沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，可以說(shuō)再生醫(yī)療還在開(kāi)發(fā)途中。
[0005]另一方面，作為更接近于生物體的組織形成方法之一，已知有通過(guò)作為本來(lái)黏著細(xì)胞類(lèi)自然具有的性質(zhì)即凝集反應(yīng)所形成的3維細(xì)胞形成現(xiàn)象。該現(xiàn)象為在培養(yǎng)黏著細(xì)胞類(lèi)時(shí)在培養(yǎng)皿等涂敷黏著抑制物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞彼此凝集且形成球狀的細(xì)胞凝集體(稱(chēng)為球體)的現(xiàn)象。作為目前所報(bào)道的球體的特征，與利用培養(yǎng)皿或燒瓶目前進(jìn)行的2維培養(yǎng)進(jìn)行比較，如下所述在3維的組織構(gòu)建上具有有利的方面。
[0006]1.可以進(jìn)行3維地培養(yǎng)，因此，細(xì)胞外基質(zhì)可以在更接近于生物體的環(huán)境下產(chǎn)生。
[0007]2.可以通過(guò)調(diào)節(jié)接種的細(xì)胞數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)球體的大小。
[0008]3.可以用微吸量管等進(jìn)行操作。
[0009]4.可以使球體彼此融合。
[0010]球體可以作為在癌研究或創(chuàng)藥研究、組織工程等中主要對(duì)單一的細(xì)胞進(jìn)行分析的工具被使用(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。
[0011]為了可以進(jìn)行理想的臨床應(yīng)用的臟器再生，有必要僅用細(xì)胞制備具有高功能(以與生物體相同的方式起作用)的組織。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0013]非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0014]非專(zhuān)利文獻(xiàn)l:Feng Wang, Jianjun Guan, Cellular card1myoplasty andcardiac tissue engineering for myocardial therapy,Advanced Drug DeliveryReviews 62(2010)784-797
[0015]非專(zhuān)利文南犬 2: Joseph P，Robert Langerj Tissue engineering: the design andfabricat1n of living replacement devices for surgical reconstruct1n andtransplantat1n, Molecular medicine 354，32—34，1999
[0016]非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Jun Fujitaj Yuji Itabashij Tomohisa Sekij Myocardialcell sheet therapy and cardiac funct1n.Am J Phys1l Heart Circ Phys1l303:H1169-H1182，2012.
[0017]非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Vladimir Mironov,Richard P.Visconti,VladimirKasyanov, Organ printing:Tissue spheroids as building blocks, B1materials30(2009)2164-2174

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明所要解決的課題
[0019]本發(fā)明的目的在于，提供一種僅用細(xì)胞構(gòu)建心臟組織、血管等的方法。
[0020]用于解決課題的技術(shù)方案
[0021]本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果，通過(guò)使用心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的混合物，另外，通過(guò)使用平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的混合物，分別在制備近似于生物體內(nèi)的功能的心臟組織及血管組織型球體方面取得成功，直至完成本發(fā)明。
[0022]SP，本發(fā)明如下所述。
[0023](I)心臟組織型球體，其由心肌細(xì)胞和選自血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中的至少I(mǎi)種細(xì)胞的混合物形成。
[0024](2)如(I)所述的心臟組織型球體，其由心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物形成。
[0025](3)如⑵所述的心臟組織型球體，其中，心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比為:相對(duì)于心肌細(xì)胞100，血管內(nèi)皮細(xì)胞為10?60，成纖維細(xì)胞為10?60。
[0026](4)心臟組織型球體，其是由心肌細(xì)胞形成的球體和由選自血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中的至少I(mǎi)種細(xì)胞形成的球體融合而成的。
[0027](5)如(4)所述的心臟組織型球體，其是由心肌細(xì)胞形成的球體、由血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的球體和由成纖維細(xì)胞形成的球體融合而成的。
[0028](6)如(5)所述的心臟組織型球體，其中，源自心肌細(xì)胞的球體、源自血管內(nèi)皮細(xì)胞的球體和源自成纖維細(xì)胞的球體的存在比為:相對(duì)于源自心肌細(xì)胞的球體100，源自血管內(nèi)皮細(xì)胞的球體為10?60，源自成纖維細(xì)胞的球體為10?60。
[0029](7)心臟組織型立體結(jié)構(gòu)體的制造方法，其包括:對(duì)所述(I)?(6)中任一項(xiàng)所述的心臟組織型球體進(jìn)行配合或疊層。其特征在于，將的心臟組織型球體配合或疊層。
[0030](8)如(7)所述的方法，其中，球體的疊層使用支撐體而進(jìn)行，所述支撐體具有基板和與該基板大致垂直地配置的絲狀體或針狀體。
[0031](9)人工心臟組織，其由所述(I)?(6)中任一項(xiàng)所述的心臟組織型球體、或按照
(7)或(8)所述的方法制造的立體結(jié)構(gòu)體構(gòu)成。
[0032](10)血管組織型球體，其由平滑肌細(xì)胞和選自血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中的至少I(mǎi)種細(xì)胞的混合物形成。
[0033](11)如(10)所述的血管組織型球體，其由平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物形成。
[0034](12)如(11)所述的血管組織型球體，其中，平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比為:相對(duì)于平滑肌細(xì)胞100，血管內(nèi)皮細(xì)胞為10?60，成纖維細(xì)胞為10?300。
[0035](13)血管組織型球體，其是由平滑肌細(xì)胞形成的球體與選自血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中的至少I(mǎi)種細(xì)胞形成的球體融合而成的。
[0036](14)如(13)所述的心臟組織型球體，其是由平滑肌細(xì)胞形成的球體與由血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的球體和由成纖維細(xì)胞形成的球體融合而成的。
[0037](15)如(14)所述的血管組織型球體，其中，源自平滑肌細(xì)胞的球體、源自血管內(nèi)皮細(xì)胞的球體和源自成纖維細(xì)胞的球體的存在比為:相對(duì)于源自平滑肌細(xì)胞的球體100，源自血管內(nèi)皮細(xì)胞的球體為10?60，源自成纖維細(xì)胞的球體為10?300。
[0038](16)血管組織型立體結(jié)構(gòu)體的制造方法，其包括:對(duì)所述(10)?(15)中任一項(xiàng)所述的血管組織型球體進(jìn)行配合或疊層。
[0039](17)如(16)所述的方法，其中，球體的疊層使用支撐體而進(jìn)行，所述支撐體具有基板和與該基板大致垂直地配置的絲狀體或針狀體。
[0040](18)人工血管組織，其由通過(guò)所述(10)?(15)中任一項(xiàng)所述的血管組織型球體、或按照所述(16)或(17)所述的方法制造的立體結(jié)構(gòu)體構(gòu)成。
[0041]根據(jù)本發(fā)明，提供一種心臟及血管組織型球體以及其制造方法。另外，通過(guò)對(duì)所述球體進(jìn)行配合或疊層，可以制造心臟組織型或血管組織型立體結(jié)構(gòu)體。通過(guò)本發(fā)明的方法制造的組織發(fā)揮類(lèi)似于生物體內(nèi)的功能，可以作為人工心臟組織或人工血管組織使用。因此，本發(fā)明在可以用于再生醫(yī)療方面是非常有用的。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1是表示心肌細(xì)胞單獨(dú)球體的大小(單位μπι)的圖。
[0043]圖2是表示由血管平滑肌、血管內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞制備的各球體的直徑(ym)和細(xì)胞數(shù)(cells/spheroid)之間的關(guān)系(形成第I天)的圖。
[0044]圖3是表示研究了心肌球體的搏動(dòng)率和培養(yǎng)液之間的關(guān)系而得到的結(jié)果的圖。
[0045]圖4是表示研究了心肌球體的搏動(dòng)率和培養(yǎng)液之間的關(guān)系而得到的結(jié)果的圖。
[0046]圖5是表示各細(xì)胞的混合比率中球體的形成的圖。
[0047]圖6是表示具有3維的血管網(wǎng)的球體的圖。
[0048]圖7是表示具有3維的血管網(wǎng)的球體的圖。
[0049]圖8是表示分析了心臟組織型球體的搏動(dòng)的結(jié)果的圖。
[0050]圖9是表示形成血管網(wǎng)并搏動(dòng)的血管球體的圖。
[0051]圖10是將分別單獨(dú)使用3種細(xì)胞而形成的球體發(fā)生了融合時(shí)的圖。
[0052]圖11是制備血管補(bǔ)丁組織的圖。
[0053]圖12是表示對(duì)血管補(bǔ)丁組織向心臟的移植試驗(yàn)的圖。
[0054]圖13是制備血