養(yǎng)品。特別地，食品補充劑和功能性食品可以對疾?。ɡ?對慢性疾?。┚哂猩碜饔茫ǚ雷o(hù)或治療）。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的組合物可例如在每g干重中包括至少105個菌落形成單位（cfu)，優(yōu) 選至少10 6cfu的本發(fā)明的菌株（動物雙歧桿菌動物亞種CNCM 1-4602)。
[0025] 在本發(fā)明的組合物中，細(xì)菌菌株尤其是動物雙歧桿菌動物亞種CNCM 1-4602可以 以完整細(xì)菌（可以是活的或死的）的形式使用?；蛘撸淇梢砸约?xì)菌裂解物的形式或以細(xì) 菌部分的形式使用。可以選擇適合于這一用途的細(xì)菌部分，例如，通過測試其緩解對本申請 所述的共培養(yǎng)模型的VIP水平的作用的性質(zhì)。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞以活的、有活性的細(xì)胞的形 式存在。
[0026] 當(dāng)細(xì)菌是活細(xì)菌的形式時，組合物典型地可以在每g干重的組合物中包括105至 1013cfu，優(yōu)選至少106cfu，更優(yōu)選至少107cfu，還更優(yōu)選至少10scfu，和最優(yōu)選至少109cfu。 在液體組合物的情況下，這通常對應(yīng)于1〇4至10 12cfu/ml，優(yōu)選至少105cfu/ml，更優(yōu)選至少 106cfu/ml，還更優(yōu)選至少107cfu/ml和最優(yōu)選至少109cfu/ml。
[0027] 本發(fā)明的菌株或組合物特別適用于預(yù)防和/或減輕胃腸不適或胃腸疾病。其可以 施用于患有腸道不適或腸道疾病的受試者。因此，有利地用于預(yù)防或解決腸道不適或腸道 疾病。此類不適或疾病包括例如與氣體相關(guān)的不適或疾病、胃氣脹、腹脹、腹痛、便秘，以及 在一些嚴(yán)重的方面，腸易激綜合征（IBS)和炎性腸疾?。↖BD)。
[0028] 根據(jù)一個具體的方面，菌株CNCM 1-4602或根據(jù)本發(fā)明的組合物用于增加受試者 中腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽（VIP)水平。更具體地，這種VIP水平的增加用于改善腸道 運動性、改善腸道蠕動和/或降低腸滲透性，尤其是在患有選自如下疾病的受試者中：腸 道運動性和/或滲透性疾病、腸易激綜合征（IBS)如IBS-C、IBS-D和IBS-PI、炎性腸疾病 (IBD)、便秘和腸道感染，或者是在選自老人、嬰幼兒和肥胖者的受試者（其腸道功能總體 上得到了改善）中。IBS(或痙攣性結(jié)腸）是特征為慢性腹痛、不適、鼓脹和在缺少任何可 檢測的器官原因的情況下改變排便習(xí)慣的功能性腸疾病。腹瀉或便秘可能占主導(dǎo)地位，因 此IBS分別被分為IBS-D或IBS-C，或可能兩者交替。IBS可以開始于感染后（此時被稱為 IBS-PI (指感染后）），應(yīng)激性生活事件后或沒有任何其它醫(yī)學(xué)指標(biāo)的成熟開始后。
[0029] 因此，本發(fā)明的組合物可用于治療和/或預(yù)防選自腸道運動性疾病、腸道滲透性 疾病、IBS (包括IBS-D、IBS-C和IBS-PI)、IBD、便秘和腸道感染的疾病，尤其是在老人或肥 胖者或嬰幼兒中。
【具體實施方式】
[0030] 可以在下列非限制性實施例中找到本發(fā)明的詳細(xì)說明或優(yōu)點。
[0031] 實施例1:在ENS原代培養(yǎng)物和T84細(xì)胞的共培養(yǎng)模型中乳酸菌對神經(jīng)元VIP生 產(chǎn)的作用
[0032] 研究了與107種益生菌菌株相互作用后原代腸神經(jīng)元對VIP生產(chǎn)的不同響應(yīng)，其 中益生菌菌株包括乳酸菌，尤其是雙歧桿菌。
[0033] 細(xì)菌菌株和生長條件
[0034]乳酸桿菌生長于Man、Rogosa和Sharpe(MRS)培養(yǎng)基（Biokar Diagnostics,Beauvais，法國）中，于37°C需氧條件下培養(yǎng)24小時。
[0035] 雙歧桿菌培養(yǎng)于確定的培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基由補充有葡萄糖（Sigma，法國）、酵母 提取物（Becton Dickinson，美國）和氯化血紅素（Calbiochem，法國）的胰蛋白胨（Becton Dickinson，美國）組成，并于37°C在厭氧條件下生長24小時。動物雙歧桿菌乳酸菌亞種培 養(yǎng)于補充有半胱氨酸（Sigma，法國）的MRS培養(yǎng)基（Biokar Diagnostics)中，并于37°C在 厭氧條件下生長24小時。
[0036] 獲得ENS原代培養(yǎng)物和T84細(xì)胞的共培養(yǎng)模型
[0037] 共培養(yǎng)模型，其改編自Moriez等人（Biochem.Biophys.Res. Commun.，382 (3) : 577-82, 2009)開發(fā)的模型，其具有與腸上皮細(xì)胞T84細(xì)胞培養(yǎng)的腸神經(jīng) 元細(xì)胞，用于細(xì)菌的篩選。
[0038]如前所述（Chevalier 等人，J. Physiol.，586(7) : 1963-75, 2008)，獲得大鼠 ENS 的 原代培養(yǎng)物。
[0039] 184細(xì)胞系培養(yǎng)于補充有10%熱滅活的？83和5011]/1111青霉素和50 1^/1111鏈 霉素的DMEM-F12(1 :1，GIBC0)中。以2X105個細(xì)胞/插入物的密度將細(xì)胞接種于12孔 TranswelP過濾器（Corning，NY，美國）并培養(yǎng)，以獲得匯合。建立共培養(yǎng)前24小時，T84 細(xì)胞的培養(yǎng)基被原代ENS培養(yǎng)基替代。
[0040] 上皮細(xì)胞達(dá)到匯合后1天，將Transwell#過濾器轉(zhuǎn)移至底部接種有腸神經(jīng)細(xì)胞的 12孔板中。上皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)于上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中。
[0041] 將細(xì)菌培養(yǎng)物在PBS中洗滌，并再懸浮于Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) :Nutrient Mixture F-12 (Ham's) (1:1)培養(yǎng)基中，其包含 1%的 N-2 補充劑 (Life Technologies, Cergy-Pontoise，法國）。細(xì)菌的每種菌株至少一式三份進(jìn)行測試以 進(jìn)行方差分析。以40個細(xì)菌/上皮細(xì)胞的M0I將菌株添加到過濾器隔室中。對照不加入細(xì) 菌。共孵育8小時后，移除含有上皮細(xì)胞和細(xì)菌的過濾器隔室并將原代ENS培養(yǎng)物在恒溫 箱（95%空氣，5%C0 2)中于37°C保持22小時。在對照孔中，進(jìn)行VIP測量時，用40mM KC1 刺激神經(jīng)元細(xì)胞。
[0042] VIP 測量
[0043] 然后，從12孔板中收集ENS細(xì)胞并用于制備蛋白提取物，以定量血管活性腸肽 (VIP)。為了確定細(xì)胞內(nèi)VIP，用含有蛋白酶抑制劑混合物（Roche Diagnostics, Meylan，法 國）的RIPA裂解緩沖液（Millipore，Billerica，MA，美國）提取細(xì)胞內(nèi)蛋白。用購買的酶 免疫分析（EIA)試劑盒（Peninsula laboratories, Bachem，SA)定量 VIP〇
[0044] ENS模型的統(tǒng)計方法
[0045] 根據(jù)下式，用陰性對照（T84)將所有的菌株VIP標(biāo)記值歸一化：(VIP^ _VIPTS4) / VIP T84〇
[0046] 根據(jù)其所估計的歸一化值將菌株排序，其中所估計的歸一化值來自具有作為固定 影響的菌株的混合模型。模型給出了與每種菌株所估計的歸一化值相關(guān)的P值。如果P值 小于5% (〈0.05)，則菌株作用是顯著的。
[0047] 結(jié)果
[0048] 結(jié)果示于下述表1中。
[0049]表1
[0050]
[0051]
[0052] KC1，用作陽性對照，平均增加15. 7%的VIP水平。
[0053] 9個菌株能顯著地增加VIP水平，從0.18%至62. 5%。表1給出了其中7個所得 到的結(jié)果。在9個菌株中，動物雙歧桿菌動物亞種CNCM 1-4602示出了最高水平的VIP增 加。其與不存在任何菌株的水平相比，具有62. 5%的增加。
[0054] 在另一方面，觀察到15個菌株顯著地（P〈0. 05)降低了 VIP水平。表1中示出了 這15個菌株中的10個的結(jié)果。
[0055] 所測試的其它菌株對VIP沒有顯著（P>0. 05)的作用，其包括例如長雙歧桿菌NCC 2705(CNCM 1-2618)、鼠李糖乳桿菌 GG(ATCC 53103)、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis) UCC 3564、長雙歧桿菌Bb536、動物雙歧桿菌乳酸菌亞種Bi-07 (ATCC SD 5220)、約氏乳桿菌Lai (CNCM 1-1225)、植物乳桿菌299v(DSM 9843)和羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)SD 2112(ATCC 55730)〇
【主權(quán)項】
1. 一種動物雙歧桿菌動物亞種菌株，其于2012年3月6日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，法國國家微生物保藏中心），保藏號為 1-4602。2. -種組合物，其包含權(quán)利要求1所述的菌株和至少一種其它的選自短雙歧桿菌CNCM 1-4321、短雙歧桿菌CNCM 1-2219、動物雙歧桿菌乳酸菌亞種CNCM 1-2494、植物乳桿菌CNCM 1-4318、兩歧雙歧桿菌CNCM 1-4319和鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4316的菌株。3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其是乳制品，優(yōu)選是發(fā)酵乳制品。4. 如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其每g干重包括至少10 5Cfu的，優(yōu)選至少IO6Cfu 的動物雙歧桿菌動物亞種CNCM 1-4602。5. 如權(quán)利要求1所述的菌株或權(quán)利要求2至4中任一項所述的組合物，其用于預(yù)防和 /或減輕胃腸不適或胃腸疾病。6. 如權(quán)利要求1所述的菌株或權(quán)利要求2至4中任一項所述的組合物，其用于增加受 試者的腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽（VIP)水平。7. 如權(quán)利要求1所述的菌株或權(quán)利要求2至4中任一項所述的組合物，其用于改善胃 腸運動性、改善腸道蠕動和/或降低腸道滲透性。8. 如權(quán)利要求5所述的菌株或組合物，其中所述菌株或組合物被施與患有選自腸道運 動性疾病、腸道滲透性疾病、腸易激綜合征（IBS)、炎性腸疾?。↖BD)、便秘和腸道感染的疾 病的受試者。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的動物雙歧桿菌動物亞種菌株，其尤其能夠改善腸神經(jīng)系統(tǒng)的功能，以及包括所述新的菌株的組合物。CNCM I-460220120306
【IPC分類】A23C9/12, C12R1/01, A61K35/74
【公開號】CN105025907
【申請?zhí)枴緾N201380065461
【發(fā)明人】索菲·勒格蘭-拉斯波, 詹弗蘭科·格龍波內(nèi), 桑德蘭·卡普羅尼耶, 塔瑪拉·什莫克維納, 瑪麗-克里斯蒂娜·德吉弗里, 比里亞納·萊西奇, 米歇爾·伊諾恩利斯特
【申請人】熱爾韋·達(dá)諾尼公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2013年12月10日
【公告號】CA2893822A1, EP2934557A1, US20150320807, WO2014096901A1, WO2014097050A1, WO2014097050A9