一種組織工程全層皮膚及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程全層皮膚及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 皮膚是覆蓋于體表和內(nèi)臟器官的重要組織，是人體與外界環(huán)境接觸的屏障，不僅 起保護(hù)、分泌、代謝和感覺等作用，而且可參與免疫反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。炎癥、潰 瘍、外傷、燒傷、腫瘤術(shù)后以及先天畸形等原因常會造成皮膚上的創(chuàng)傷，既影響美觀也影響 人們的生活質(zhì)量。對于這些創(chuàng)傷目前常用的治療方法是自體皮膚移植，這種方法不僅會在 供皮區(qū)產(chǎn)生新的創(chuàng)傷，還存在自身正常皮膚來源有限和移植皮膚存活率低等限制。深度大 面積的燒燙傷常會造成大面積的皮膚損傷，極易引發(fā)感染而導(dǎo)致患者死亡，大面積燒傷患 者的皮源缺乏和嚴(yán)重創(chuàng)傷一直是臨床亟待解決的難題。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展， 先后研制出了不同類型的組織工程皮膚替代物，該替代物在臨床上可用于皮膚缺損的移植 治療，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合，減少疤痕形成，尤其在深度大面積的燒燙傷情況下，該移植物 的應(yīng)用能夠覆蓋創(chuàng)面，在一定程度上克服了皮膚供區(qū)不足、免疫排斥、傳播疾病等各種問 題，可減少體液流失，減輕痛苦，避免感染，為皮膚移植治療創(chuàng)傷引起的皮膚缺損及皮膚疾 病提供了新的方向；目前，組織工程皮膚的研究也成為了生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
[0003] 據(jù)研究報(bào)道，組織工程皮膚包括人工表皮、人工真皮及含表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)的 全層皮膚。其中，最受人們推崇的是組織工程全層皮膚，它是由表皮層和真皮層組成的雙層 復(fù)合人工皮膚。理想的組織工程全層皮膚，接近于天然皮膚，能夠同時(shí)修復(fù)受體所缺失的真 皮層和表皮層，既能夠達(dá)到正常皮膚的韌性和強(qiáng)度，又能夠抗感染。
[0004] 目前，已有一些產(chǎn)品開始應(yīng)用于臨床，這些產(chǎn)品主要是含有一層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品。 例如，Dermagraft?(Advanced Tissue Sciences, Inc. U. S. A.)是一種由真皮成纖維細(xì)胞、 細(xì)胞外基質(zhì)和可降解生物材料構(gòu)成的人工真皮替代物，主要用于燒傷創(chuàng)面及糖尿病足潰瘍 的創(chuàng)面修復(fù)。其缺點(diǎn)在于Dermagraft只具有真皮層，不具有表皮層，移植后仍然需要一期 或者二期移植自體斷層皮片。
[0005] 美國的Apligraf?(Organogenesisi, Inc. U. S. A.)人工皮膚是目前最為成熟的既 含有表皮層又含有真皮層的組織工程皮膚，該組織工程皮膚以活細(xì)胞為基礎(chǔ)，以牛膠原纖 維為支架，擴(kuò)增后可形成具有保護(hù)皮膚細(xì)胞的外層和含有的膠原蛋白的內(nèi)層雙分子層的三 維結(jié)構(gòu)，被用于治療糖尿病足潰瘍及下肢靜性潰瘍等慢性傷口。但是Apligraf?人工皮膚 不是真正完整的皮膚，即使移植后也不能形成包含如毛發(fā)、皮脂腺等皮膚附屬器官的全層 皮膚。所以，現(xiàn)有的組織工程全層皮膚依然存在很多不足，需要進(jìn)一步改進(jìn)來適應(yīng)臨床需 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種組織工程全層皮膚及其制備方法，該 組織工程全層皮膚具有真皮層和表皮層，帶有活性細(xì)胞，且表皮層中含有角質(zhì)層，接近于正 常皮膚，并在移植后，能夠產(chǎn)生皮膚附屬器官如毛囊汗腺等，形成完整的功能性皮膚，可以 用于炎癥、潰瘍、燒燙傷等原因造成的皮膚缺損的治療，也可用于制備皮膚模型以用于疾病 研究、藥物測試和篩選或化妝品測試等。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種組織工程全層皮膚，其包括表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞和生物支架材 料；
[0009] 其是將所述真皮細(xì)胞復(fù)合于所述生物支架材料內(nèi)部，在表面接種所述表皮細(xì)胞， 培養(yǎng)制備獲得的。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中的真皮細(xì)胞是按照如下制備方法制備 獲得的，其包括以下步驟：
[0011] 步驟一：采集組織樣品，所述組織樣品用組織消化酶消化12h_20h之后，用機(jī)械法 分開表皮和真皮部分；
[0012] 步驟二：取所述真皮部分剪碎后，用膠原蛋白酶酶解、過濾，收集濾液，得真皮細(xì) 胞；
[0013] 步驟三：取所述真皮細(xì)胞，用任何供細(xì)胞自然生長的培養(yǎng)基培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長達(dá) 到在培養(yǎng)器皿80% -90%覆蓋率時(shí)，進(jìn)行傳代；所述傳代按1:3-6比例傳代。
[0014] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中所用的真皮細(xì)胞的 傳代代數(shù)為1-6代。更為優(yōu)選地，所用的真皮細(xì)胞的傳代代數(shù)為2-4代。
[0015] 在本發(fā)明中，真皮細(xì)胞的來源不受本發(fā)明的限制，也可以為可向真皮細(xì)胞分化的 干細(xì)胞，例如，胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞（如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干 細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或幾種）。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中的表皮細(xì)胞是按照如下制備方法制備 獲得的，其包括以下步驟：
[0017] 步驟1 :采集組織樣品，所述組織樣品用組織消化酶消化12h_20h之后，用機(jī)械法 分開表皮和真皮部分；
[0018] 步驟2 :取所述表皮部分剪碎后，用胰蛋白酶酶解、過濾，收集濾液，得表皮細(xì)胞；
[0019] 步驟3:取所表皮細(xì)胞，用加入了 Rock蛋白激酶抑制劑的任何供細(xì)胞自然生長 的培養(yǎng)基培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到在培養(yǎng)器皿80% -90 %覆蓋率時(shí)，進(jìn)行傳代；所述傳代按 1:1-6比例傳代；
[0020] 所述Rock蛋白激酶抑制劑的添加量為其終濃度達(dá)2-10 y mol/L。
[0021] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中所用的表皮細(xì)胞的 傳代代數(shù)為1-6代。更為優(yōu)選地，所用的表皮細(xì)胞的傳代代數(shù)為2-4代。
[0022] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中表皮細(xì)胞的制 備方法中所用的Rock蛋白激酶抑制劑為Y-27632。
[0023] 在本發(fā)明中，表皮細(xì)胞的來源不受本發(fā)明的限制，也可以來源于可向表皮細(xì)胞分 化的干細(xì)胞，例如，胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞（如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、皮 膚干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或幾種）。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中的生物支架材料為機(jī)體可接受的生物 可降解材料，包括膠原蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物、透明質(zhì)酸、多糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥 基乙酸、聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物中的一種或兩者以上混合物。
[0025] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中的生物支架材料所 用的生物可降解材料中膠原蛋白為鼠源膠原蛋白或牛源膠原蛋白。
[0026] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中的生物支架材 料所用的生物可降解材料中的多糖為殼聚糖。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種組織工程全層皮膚的制備方法，其包括如下步驟：
[0028] 基底層的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，調(diào)節(jié)pH值至 pH7. 0-pH7. 4后，置于支撐膜上，固化，得基底層；
[0029] 真皮層的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，調(diào)節(jié)pH值至 pH7. 0-pH7. 4后，加入真皮細(xì)胞，置于所述基底層之上，固化之后，加入真皮培養(yǎng)基，培養(yǎng) 2-4天，得真皮層；
[0030] 組織工程全層皮膚的形成和成熟：取表皮細(xì)胞平鋪于所述真皮層，孵育0. 5h_2h， 加入表皮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天；之后進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)2-3天，即得。
[0031] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中真皮細(xì)胞的制備方法包括以下步驟：
[0032] 步驟一：采集組織樣品，所述組織樣品用組織消化酶消化12h_20h之后，用機(jī)械法 分開表皮和真皮部分；
[0033] 步驟二：取所述真皮部分剪碎后，用膠原蛋白酶酶解、過濾，收集濾液，得真皮細(xì) 胞；
[0034] 步驟三：取所述真皮細(xì)胞，用任何供細(xì)胞自然生長的培養(yǎng)基培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長達(dá) 到在培養(yǎng)器皿80% -90%覆蓋率時(shí)，進(jìn)行傳代；所述傳代按1:1-6比例傳代。
[0035] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組織工程全層皮膚中所用的真皮細(xì)胞的 傳代代數(shù)為1-6代。更為優(yōu)選地，所用的真皮細(xì)胞的傳代代數(shù)為2-4代。
[0036] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，真皮細(xì)胞的制備方法 中，步驟二中的膠原蛋白酶酶解的溫度為36 °C -37. 5 °C，優(yōu)選為37 °C。其中的膠原蛋白酶酶 解的時(shí)間為20min-40min。
[0037] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中表皮細(xì)胞的制備方法包括以下步驟：
[0038] 步驟1 :采集組織樣品，所述組織樣品用組織消化酶消化12h_20h之后，用機(jī)械法 分開表皮和真皮部分；