鏈接粘附分子jam-a促進皮膚創(chuàng)面修復的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉基因工程技術及生物藥物技術領域，尤其涉及鏈接粘附分子JAM-A在促 進皮膚創(chuàng)面修復中的新用途，也即一種促進皮膚創(chuàng)面修復的方法，及其鏈接粘附分子JAM-A 在制備皮膚創(chuàng)面修復藥物或試劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 皮膚是人體面積最大的器官，也是機體自我更新速度最快的組織之一，它是機體 免于脫水、損傷、感染的第一道防線，是維持內環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學物質等侵入的 屏障。盡早覆蓋創(chuàng)面，恢復皮膚的屏障功能，十分重要。常規(guī)的治療方法采用自體皮膚或同 種異體、異種皮膚的移植和人工替代物覆蓋等，由于存在著供皮來源有限，同種異體、異種 皮移植有免疫排斥反應或傳染疾病的危險，人工皮膚費用昂貴等問題，常規(guī)方法難以滿足 臨床應用的需要（參加文獻 1 :Meier TO, Guggenheim M, Vetter ST，et al.Microvascular regeneration in meshed skin transplants after severe burns.Burns.2011 ； 37 (6) : 1010-4.)。因此，促進皮膚創(chuàng)傷修復已成為組織修復領域亟待解決的難題之一，研究 皮膚創(chuàng)傷愈合修復具有重要的理論和實際意義。
[0003] 鏈接粘附分子JAM-A(NM_016946)是一個跨膜分子，屬于免疫球蛋白超家族。 JAM-A同源二聚化后可與細胞內的roZ(PSD-95/Discs-large/Z0-l)結構域結合，和細胞迀 移、胞內外信號傳遞、細胞緊密連接及血管生成關系密切（參加文獻2:S evers〇n EA，Lee WY, Capaldo CT, Nusrat A, Parkos CA. Junctional adhesion molecule A interacts with Afadin and PDZ_GEF2to activate Rap1A, regulate betalintegrin levels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell, 2009V〇1. 20, 1916 - 1925.)。此外， JAM-A在細胞迀移，器官發(fā)育及上皮細胞分化等方面也有重要作用（參見文獻3 :Nava P, Capaldo CT, Koch S, et. al. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/0 -catenin signalling. EMB0 Rep. 2011Apr ;12 (4) : 314-20)有研究者通過細胞 劃痕試驗證明，JAM-A可促進上皮細胞迀移（參見文獻4 :PorfirioNava, Christopher T.Capaldo, Stefan Koch, KeliKolegraff, Carl Robert Rankin, AttilaE. Farkas, Mattie E. Fease, LinhengLi, Caroline Addis,CharlesA.Parkos&AsmaNusrat. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/b-catenin signalling EMB0 r印orts (2011) 12, 314 - 320)〇
[0004] 目前尚無文獻報道有關JAM-A基因在創(chuàng)面修復的應用。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供鏈接粘附分子JAM-A的新用途，具體是在制備皮膚創(chuàng)面修 復藥物或試劑中的應用；本發(fā)明的另一目的在于提供一種促進皮膚創(chuàng)面修復的方法；本發(fā) 明的第三目的在于提供一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達的載體（pGC-FU-JAM-A-GFP)及 其應用。
[0006] 本發(fā)明在前期試驗中證實JAM-A上調后成纖維細胞的迀移和增殖能力增加，并且 JAM-A修飾后的間充質干細胞較對照組顯著促進皮膚創(chuàng)面的修復。那么JAM-A能否直接促 進創(chuàng)面愈合？
[0007] 為了解答這些困惑，本發(fā)明進一步地構建了 JAM-A的過表達和干擾的慢病毒以更 加高效穩(wěn)定地調整創(chuàng)面組織中JAM-A的表達，體內檢測JAM-A單獨使用是否能促進創(chuàng)面修 復。
[0008] 本發(fā)明選擇慢病毒進行載體構建的出發(fā)點是慢病毒的感染效率較高且具有較高 的安全性（參見文南犬5:MadryH,CucchiariniM.Clinicalpotentialandchallenges ofusinggeneticallymodifiedcellsforarticularcartilagerepair.CroatMed J. 2011Jun;52 (3):245-61)。慢病毒基因載體是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒載 體，作為一種高效的基因轉染載體應用越來越廣泛，經多次修飾改造其轉導效率和安全性 都得到了保證。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了鏈接粘附分子JAM-A的新用途，具體是在制備皮膚創(chuàng) 面修復藥物或試劑中的應用。
[0010] 所述的藥物或試劑，能夠提高鏈接粘附分子JAM-A的表達量，包括但不限于以下 任一：
[0011] A) JAM-A及其編碼基因；
[0012] B)含有JAM-A編碼基因的重組載體；
[0013] C)含有JAM-A編碼基因的重組病毒；
[0014] D)含有JAM-A編碼基因的重組病毒載體。
[0015] 所述的鏈接粘附分子JAM-A(NM_016946)，其cDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，提高鏈接粘附分子JAM-A表達量的藥物或試劑是 指重組載體 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0017] 所述的皮膚創(chuàng)面修復，其中的"創(chuàng)面"是正常皮膚（組織）在外界致傷因子如外科 手術、外力、熱、電流、化學物質、低溫以及機體內在因素如局部血液供應障礙等作用下所導 致的損害；常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受 損；也稱為傷口或者創(chuàng)傷。創(chuàng)面修復也稱為傷口修復、創(chuàng)面愈合等，是指皮膚（組織）通過 再生（Regeneration)、修復（Repair)、重建（Reconstruction)，不同程度地恢復其功能。
[0018] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種促進皮膚創(chuàng)面修復的方法。
[0019] 本發(fā)明的一種促進皮膚創(chuàng)面修復的方法，是采用提高鏈接粘附分子JAM-A表達量 的藥物或試劑修飾創(chuàng)面皮膚。
[0020] 所述的修飾，較優(yōu)的，是用皮下注射的方式將提高鏈接粘附分子JAM-A表達量的 藥物或試劑注入創(chuàng)面皮膚組織；
[0021] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，是用皮下注射的方式將重組載體 pGC-FU-JAM-A-GFP移植到創(chuàng)周皮膚組織。
[0022] 本發(fā)明的一種促進皮膚創(chuàng)面修復的方法，該方法包括：構建一種JAM-A高表達的 重組載體，包括但不限于pGC-FU-JAM-A-GFP，通過皮下注射的方式移植到皮膚創(chuàng)面四周。
[0023] 本發(fā)明的pGC-FU-JAM-A-GFP主要感染創(chuàng)面皮膚中的成纖維細胞和毛囊的結締組 織鞘的細胞。
[0024] 本發(fā)明的第三方面，提供一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達的載體，并提供該載 體在制備皮膚創(chuàng)面修復藥物或試劑中的應用。
[0025] 本發(fā)明的一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達的載體，可以是一種含有JAM-A編碼 基因的重組載體、一種含有JAM-A編碼基因的重組病毒、一種含有JAM-A編碼基因的重組病 毒載體等。
[0026] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述的鏈接粘附分子JAM-A基因表達的載體為 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0027]本發(fā)明提供了 一種重組載體pGC-FU-JAM-A-GFP，并檢測了該載體促創(chuàng)面修復的能 力及生物安全性等。本發(fā)明還進一步提供采用PGC-FU-JAM-A-GFP促進創(chuàng)面修復的方法，以 及pGC-FU-JAM-A-GFP在創(chuàng)面修復中的應用。
[0028] 本發(fā)明基于前期JAM-A可促進細胞迀移，調節(jié)上皮細胞重排等實驗依據(jù)，構建含 目的基因JAM-A慢病毒過表達載體，將其定向定量注射至創(chuàng)周，以便用啟動表達外源性的 JAM-A，獲得JAM-A高表達創(chuàng)面組小鼠，稱之為JAM-A° v-mice。將5 X 105的pGC-FU-JAM-A -GFP慢病毒顆粒采用創(chuàng)周四點皮內注射的方式移植到全層皮膚缺損的小鼠，注射時間為創(chuàng) 傷后24小時。注射后觀察并統(tǒng)計創(chuàng)面恢復情況。
[0029] 本發(fā)明提供一種JAM-A基因感染創(chuàng)周皮膚的方法，具體內容是根據(jù)JAM-A的基 因結構，設計一對引物，以人表皮細胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴增，制備JAM-A cDNA， 再構建重組人peGFP-Nl-JAM-A真核表達載體，為提高轉染效率，構建慢病毒過表達質粒 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0030] 本發(fā)明提供了一種鏈接粘附分子JAM-A過表達質粒的構建方法，包括以下步驟 (即 pGC-FU-JAM-A-GFP 的構建方法）：
[0031] A、設計并合成引物P1和P2,擴增JAM-A cDNA :
[0032] PI ：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC(SEQ ID NO:2)
[0033] P2：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG(SEQ IDNO:3)
[0034] 以人表皮細胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴增，制備JAM-A cDNA，序列如下：atcg cgatggggacaaaggcgcaagtcgagaggaaactgttgtgcctcttcatattggcgatcctgttgtgctccctggca ttgggcagtgttacagtgcactcttctgaacctgaagtcagaattcctgagaataatcctgtgaa