中藥復(fù)方中主效藥物成分的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種中藥復(fù)方中主效藥物成分的篩選和評(píng)估的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥復(fù)方中主效藥物的篩選及評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分，是基于中 藥復(fù)方進(jìn)行進(jìn)一步組合藥物研發(fā)的基礎(chǔ)。中藥化學(xué)成分極為復(fù)雜，單味藥材本身即是復(fù)雜 的混合物，且以幾味甚至幾十味藥材配伍而成的中藥復(fù)方為中醫(yī)用藥的基本形式。
[0003] 因而，探索中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)不僅是一項(xiàng)十分艱巨的任務(wù)而且是現(xiàn)代醫(yī)療的需 要。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的高通量的方法被應(yīng)用到了中藥復(fù)方的研究當(dāng)中，大 量的藥物化學(xué)成分被識(shí)別出來(lái)，但是如何從海量的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)和評(píng)估中藥復(fù)方中的主效藥 物，并使用數(shù)學(xué)的語(yǔ)言進(jìn)行直觀描述，仍然是當(dāng)前的中藥復(fù)方和更進(jìn)一步的組合藥物的研 究中亟待解決的難題。
[0004] 已有的中藥復(fù)方相關(guān)研究中，多是依賴物理和化學(xué)方法的中藥成分的分離和純化 方法，【申請(qǐng)?zhí)枴?01210016789. 0公開了"一種中藥復(fù)方配伍優(yōu)化的方法"其中做到了使用數(shù) 學(xué)語(yǔ)言描述和優(yōu)化中藥復(fù)方。但是該方法過于依賴實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和人為選擇的藥物靶點(diǎn)，主觀 性過強(qiáng)，可移植性差，而且其結(jié)果沒有給出中藥復(fù)方中的主效藥物成分，無(wú)法為進(jìn)一步的組 合藥物開發(fā)提供支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)狀，發(fā)明人將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合在一起，克服 了現(xiàn)有的對(duì)中藥復(fù)方中藥物成分研究手段的不足，因此本發(fā)明提供了一種基于高通量平臺(tái) 的研究中藥復(fù)方中主效藥物成分的新方法。
[0006] 本發(fā)明所述中藥復(fù)方中主效藥物成分的篩選方法，包括如下步驟：
[0007] 1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及施藥：采集正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液樣本，然后建立疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 模型，根據(jù)中藥復(fù)方藥物中的成分構(gòu)成設(shè)立復(fù)方藥物組和各單方藥物組，分別施以治療劑 量的中藥復(fù)方藥物和各單方藥物，之后分別采集治療前和治療后血液樣本；
[0008] 2)發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)基因：使用基因芯片分別測(cè)量正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；疾病組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、施用 藥物（包括復(fù)方藥物和單方藥物）前的各疾病組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；以及施用藥物（包括復(fù)方藥物 和單方藥物）治療后的各疾病組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因表達(dá)譜圖；
[0009] 然后比較對(duì)照組與疾病組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因表達(dá)譜，找出疾病中異常表達(dá)的基 因；
[0010] 使用Fold change方法比較中藥復(fù)方藥物治療前和治療后的疾病組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基 因表達(dá)譜，找出復(fù)方治療后差異表達(dá)基因；
[0011] 使用Fold change方法比較中藥復(fù)方中各單方藥物治療前和治療后的疾病組實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物的基因表達(dá)譜，找出各單方治療后差異表達(dá)基因；
[0012] 分別將中藥復(fù)方藥物和各單方藥物治療前后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物中差異表達(dá)的基因定義 為它們各自相應(yīng)的治療起效藥物的靶點(diǎn)基因；
[0013] 3)計(jì)算影響力值：使用Biogrid數(shù)據(jù)庫(kù)下載的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)分別尋找中藥 復(fù)方和各單方藥物的治療起效的藥物靶點(diǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物直接相互作用的蛋白質(zhì)；其中藥 物靶蛋白、靶蛋白直接相互作用的蛋白質(zhì)、以及它們之間的相互作用關(guān)系就構(gòu)成了治療起 效藥物靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（示例性如圖1);
[0014] 然后按照如下公式（I)分別計(jì)算中藥復(fù)方藥物的靶點(diǎn)基因表達(dá)的蛋白在起效藥 物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的影響力值：
[0016]公式（I)
[0017] Socrei :起效藥物革巴點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中某一個(gè)蛋白質(zhì)i的影響力，蛋白質(zhì)i 為需要計(jì)算影響力的任意靶蛋白；
[0018] Di :起效藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中和蛋白質(zhì)i直接相互作用的蛋白質(zhì)數(shù)； [0019]Spij:起效藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)i和網(wǎng)絡(luò)中另外一個(gè)蛋白質(zhì)j的 最短距離，蛋白質(zhì)j為起效藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中任意蛋白質(zhì)；
[0020] n為起效藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中所有的蛋白質(zhì)總數(shù)；
[0021] 4)計(jì)算藥效比值及確定主藥效成分：通過如下公式（II)計(jì)算復(fù)方藥物中各單方 藥物相對(duì)于復(fù)方藥物的藥效比值：
[0023]公式（II)
[0024] AFi :復(fù)方藥物組分i相對(duì)與復(fù)方的藥效比值；
[0025] Sj :復(fù)方藥物組分i的一個(gè)靶基因CTGj的治療影響力；
[0026] Sk :復(fù)方的一個(gè)靶基因CTGk的治療影響力；
[0027] Iii:復(fù)方藥物組分i所有的靶基因數(shù)目；
[0028] nF :復(fù)方所有的靶基因數(shù)目；
[0029] 然后根據(jù)各單方藥物的藥效比值確定出復(fù)方藥物中的主要藥效成分。
[0030] 本發(fā)明所述中藥復(fù)方中主效藥物成分的篩選方法中，作為實(shí)施方式之一，所述步 驟1)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括但不限于FVB/NJ小鼠、SCID小鼠或BALB/c小鼠。
[0031] 作為實(shí)施方式之一，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疾病模型的來(lái)源可以是市售、也可以由本領(lǐng) 域技術(shù)人員結(jié)合本領(lǐng)域常識(shí)，以及所要研究的中藥復(fù)方的情況制定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模 型，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型的方法可以依據(jù)本領(lǐng)域常用的方法，例如包括但不限于注射表 達(dá)PML-RAR的細(xì)胞。
[0032] 本發(fā)明方法中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的施藥劑量和施藥期限，同樣可以由本領(lǐng)域技術(shù)人結(jié)合 本領(lǐng)域常識(shí)和相應(yīng)中藥復(fù)方及各單方藥物的用藥常識(shí)進(jìn)行確定，本發(fā)明優(yōu)選根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重和藥物特性確定施用藥物劑量，根據(jù)疾病特性確定施藥和采樣周期。
[0033] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，本發(fā)明所述方法中步驟2)中的基因芯片可以為本領(lǐng) 域常用的各種芯片，既可以從市場(chǎng)購(gòu)買，也可以按照現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)記載進(jìn)行制備，所述芯 片包括但不限于基因表達(dá)譜芯片，具體的芯片示例包括但不限于Affiymerix公司的芯片、 Illumina公司的芯片或Agilent公司的基因芯片。
[0034] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述方法中步驟2)中的對(duì)比基因圖譜所采用的方法 可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，本發(fā)明優(yōu)選采用：標(biāo)準(zhǔn)Fold Change法或基于標(biāo)準(zhǔn)Fold Change方法改良的能夠指示基因差異表達(dá)方向的比較方法；
[0035] 本發(fā)明方法中步驟2)中的治療起效藥物的靶點(diǎn)基因包括但不限于疾病中高表 達(dá)，復(fù)方治療后表達(dá)量降低，或者在疾病中低表達(dá)，復(fù)方治療后表達(dá)量升高的基因；本領(lǐng)域 技術(shù)人員也可以根據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)并結(jié)合具體中藥復(fù)方的實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行確定。
[0036] 本發(fā)明所述方法中，采用公式（I)計(jì)算影響力值，是因?yàn)楸绢I(lǐng)域通常認(rèn)為某個(gè)蛋 白質(zhì)在生物網(wǎng)絡(luò)中能夠影響的蛋白質(zhì)越多，這個(gè)蛋白質(zhì)越重要。而傳統(tǒng)方法一般使用與某 個(gè)蛋白直接相互作用的蛋白質(zhì)數(shù)目也就是degree衡量其重要性。但是這種方法無(wú)法衡量 單個(gè)蛋白質(zhì)在整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)中的影響力，在實(shí)際的生物過程中，蛋白質(zhì)不但能影響直接相 互作用的蛋白質(zhì)，而且能夠通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，影響間接相互作用的蛋白質(zhì)，所 以本發(fā)明中將所有間接相互作用的蛋白質(zhì)及其直接影響力（degree值）都納入計(jì)算，并使 用兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的最短距離衡量影響力的減弱程度，從而使結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。
[0037] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，本發(fā)明所述方法步驟3)中的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù) 據(jù)可以是本領(lǐng)域常用的各種蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)驗(yàn)證實(shí)的蛋白質(zhì)相互作用 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)；
[0038] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，本發(fā)明所述方法驟3)中的治療起效藥物靶點(diǎn)基因蛋 白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)為以藥物靶蛋白為核心的一級(jí)展開網(wǎng)絡(luò)（即僅包括藥物靶蛋白和與靶 蛋白直接相互作用的蛋白）。
[0039] 本發(fā)明方法中采用公式（II)進(jìn)行計(jì)算藥效比值，是基于中藥復(fù)方是多種藥物的 組合，不同的藥物影響的CTGs不同，治療效果也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的差異。由于藥物的治療是通 過CTGs起作用，那么藥物的治療效果就可以通過其作用的所有CTGs的影響力之和來(lái)衡量。 通過比較各單方組分藥物CTGs和中藥復(fù)方的CTGs，可以計(jì)算該單方組分藥物相對(duì)復(fù)方藥 物的藥效比值（取值范圍0~1)，相對(duì)來(lái)說(shuō)、值越高，治療效果越好。通常所有藥物組分中 藥效比值最高的藥物組分，其值大于0.5;由于中藥復(fù)方的作用并不是所有藥物的效應(yīng)的 簡(jiǎn)單相加，中藥的組合存在"君，臣，佐，使"的調(diào)和以及協(xié)作關(guān)系，所以一個(gè)復(fù)方所有藥物組 分的藥效比值之和并不一定是1，可能大于1也可能小于1，這種表現(xiàn)與中藥的傳統(tǒng)理論是 一致的。因此根據(jù)各單方藥物組分的藥效比值確定復(fù)方的主效藥物也是非?？茖W(xué)合理的。
[0040] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，可以用于本發(fā)明方法篩選復(fù)方中主藥效成分的中藥復(fù) 方包括但不限于復(fù)方黃黛，還可以包括本領(lǐng)域各種的包含兩種或兩種以上單方藥物的中藥 復(fù)方。
[0041] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述篩選復(fù)方中主藥效成分的方法包括：
[0042] (a)購(gòu)買或者根據(jù)文獻(xiàn)使用成熟技術(shù)方法建立疾病小鼠模型；
[0043] (b)使用對(duì)癥中藥復(fù)方治療疾病小鼠；
[0044] (C)使用購(gòu)買的常見標(biāo)準(zhǔn)基因芯片檢測(cè)正常小鼠，疾病小鼠和中藥復(fù)方治療后小 鼠的基因表達(dá)譜；
[0045] (d)分別單獨(dú)使用復(fù)方中各單方藥物治療疾病小鼠；
[0046] (e)使用基因芯片檢測(cè)各單方藥物治療后的小鼠基因表達(dá)譜；
[0047] (f)對(duì)正常組小鼠和疾病組小鼠的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，尋找疾病中差異表達(dá)的 基因；
[0048] (g)使用標(biāo)準(zhǔn)的Foldchange方法對(duì)疾病組小鼠和復(fù)方治療組小鼠的基因表達(dá)譜 進(jìn)行比較，尋找復(fù)方治療后差異表達(dá)的基因；
[0049] (h)定義在疾病中高表達(dá)，復(fù)方治療后表達(dá)量降低，或者在疾病中低表達(dá)， 復(fù)方治療后表達(dá)量升高的基因?yàn)橹兴帍?fù)方治療起效藥物靶點(diǎn)基因CurativeTarget Genes(CTGs)；
[0050] (i)使用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)尋找