提物對(duì)尿蛋白和UALB的改善作用較為 明顯，而對(duì)血糖雖有相應(yīng)的緩解趨勢(shì)，只是這種療效與本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的劑量并沒(méi)有相關(guān)性。而 對(duì)于血脂紊亂的調(diào)節(jié)，突實(shí)醇提物在300、600mg/kg濃度下，能夠?qū)C和TG表現(xiàn)出一定的 降低作用。實(shí)驗(yàn)證明，芡實(shí)醇提物可以調(diào)節(jié)DN引起的BUN水平上升。
[0049] 而且，從病理切片可觀察到模型組大鼠腎臟出現(xiàn)不同程度的損傷，而給藥組均可 見(jiàn)近曲小管變性和間質(zhì)充血有所減輕，腎小球體積膨脹也有所減輕等緩解癥狀，因而認(rèn)為 一定濃度（300~600mg/kg)的芡實(shí)醇提物具有保護(hù)腎臟，延緩DN病理進(jìn)程的作用。
[0050] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芡實(shí)醇提物具有降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白和尿微量白蛋白 的作用。因此芡實(shí)醇提物可以作為一種具有降尿蛋白功效的藥物用于治療糖尿病腎病。
[0051] 為了更詳細(xì)地了解芡實(shí)醇提物中的有效成分，發(fā)明人還對(duì)本發(fā)明的芡實(shí)醇提物進(jìn) 行了UPLC-MS化合物鑒定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的芡實(shí)醇提物中的酚類物質(zhì)至少包含沒(méi)食子酸、沒(méi) 食子酸乙酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、5, 7, 3'，4'，5' -五羥基二氫黃酮以及5, 7, 4' -三羥基 二氫黃酮；三萜類物質(zhì)至少包括異落葉松樹酯醇-9-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷。而且，上述芡 實(shí)醇提物中的酚類物質(zhì)與三萜類的質(zhì)量比在1 :1~2 :1之間。
[0052] 基于上述研宄結(jié)果，在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種降尿蛋白藥物， 該藥物由有效量的芡實(shí)醇提物及輔料組成。此處的"有效量"包括治療有效量和預(yù)防有效 量。"治療有效量"是指在必要的劑量和特定的持續(xù)時(shí)間下實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果的有效量。 藥劑的治療有效量可以根據(jù)多種因素而改變，例如個(gè)體的病狀、年齡、性別、和體重，以及藥 劑在個(gè)體體內(nèi)引起期望的反應(yīng)的能力。治療有效量也是治療有益效果超過(guò)藥劑的任何毒性 或有害效果的量。"預(yù)防有效量"指在必要的劑量和時(shí)間期限內(nèi)，有效實(shí)現(xiàn)所希望的預(yù)防結(jié) 果，如預(yù)防或抑制尿蛋白升高的量?？梢愿鶕?jù)上述對(duì)治療有效量的描述確定預(yù)防有效量。對(duì) 于任何具體受試者，可以根據(jù)個(gè)體需要和施用人的職業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)節(jié)特定劑量。輔料可 以根據(jù)不同劑型或給藥途徑的不同而選擇合適的現(xiàn)有的輔料即可。
[0053] 在本發(fā)明一種更優(yōu)選的實(shí)施例中，以KM小鼠體重計(jì)，芡實(shí)醇提物的給藥劑量在 18~22g/kg以下是安全的，而有效劑量是以SD大鼠計(jì)為75~600mg/kg。在具體病例中， 可根據(jù)動(dòng)物與人的重量及給藥劑量之間的換算關(guān)系，得出病人實(shí)際可以給予的有效劑量范 圍。
[0054] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述藥物中的芡實(shí)醇提物從芡實(shí)單味藥中經(jīng)乙醇 提取并經(jīng)大孔樹脂分離得到。更優(yōu)選地，該藥物既為芡實(shí)乙醇提取后經(jīng)AB-8、D101、DM-301 或HPD-100中的任意一種大孔樹脂分離得到。最優(yōu)選地，是在用上述任一種大孔樹脂吸附 后，再用體積含量為20%~80%的乙醇進(jìn)行洗脫，即可得到本發(fā)明的芡實(shí)醇提物。本發(fā)明 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由芡實(shí)醇提物單味藥所形成的凍干粉具有更穩(wěn)定的藥效，能夠顯著減低 尿蛋白和尿微量白蛋白的作用。因而，來(lái)源于芡實(shí)的醇提物具有治療糖尿病腎病的作用。
[0055] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，芡實(shí)醇提物中含有酚類和三萜類物質(zhì)，且酚類和三萜類物質(zhì)在 芡實(shí)醇提物中的質(zhì)量百分含量之和大于50 %，更優(yōu)選大于60 %。具有上述成分和含量的芡 實(shí)醇提物具有降低尿蛋白和尿微量白蛋白的功效，即在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)；而且，由于 上述成分為降低尿蛋白和尿微量白蛋白的有效成分，因而上述成分的含量越高，降低尿蛋 白和尿微量白蛋白的效果越好，是本發(fā)明更優(yōu)選的保護(hù)范圍。
[0056] 在本發(fā)明另一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述藥物中的酚類物質(zhì)至少包含沒(méi)食子酸、沒(méi) 食子酸乙酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、5, 7, 3'，4'，5' -五羥基二氫黃酮以及5, 7, 4' -三羥基 二氫黃酮；三萜類物質(zhì)至少包括異落葉松樹酯醇-9-0-0-D-吡喃葡萄糖苷；更優(yōu)選地，上 述芡實(shí)醇提物中酚類和三萜類物質(zhì)的質(zhì)量比為1 :1~2 :1。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，至少含有 上述酚類物質(zhì)和三萜類物質(zhì)的成分及相應(yīng)質(zhì)量比的芡實(shí)醇提物具有顯著降低尿蛋白和尿 微量白蛋白的作用。
[0057] 上述芡實(shí)醇提物，制備成一種降蛋白藥物，進(jìn)一步需要藥學(xué)上可接受的載體、賦形 劑或佐劑等輔料。而且，該藥物可以制成不同的劑型以適應(yīng)多樣化的給藥途徑，具體可適用 的給藥途徑包括口服給藥和胃腸道給藥。而藥物的劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓 劑、溶液劑和懸浮劑。
[0058] 本發(fā)明可按照制藥工業(yè)中已知的方法將本發(fā)明的含有芡實(shí)醇提物的藥物制成片 劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓劑以及溶液劑和懸浮劑，其中優(yōu)選的是適合于胃腸道給藥的膠 囊劑和片劑。在制備適于口服給藥的膠囊劑、片劑、丸劑和粉末劑時(shí)，可以使用蔗糖、乳糖、 半乳糖、玉米淀粉、明膠、微晶纖維素、羧甲基纖維素等作為載體或賦形劑。
[0059] 另外，也可以使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成分將本發(fā)明的藥物制成適于口 服給藥的溶液劑和懸浮劑。為了制備適于胃腸道外途經(jīng)給藥的溶液劑和懸浮劑，可以使 用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉或葡萄糖溶液，或者低深度（例如I-IOOmm)磷酸緩沖液 (PBS)作為載體或稀釋劑?？梢栽谶@些胃腸道外給藥的制劑中加入一種或多種其他輔助成 分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉等作為防腐劑。在這些劑型 的制劑中還可以含有其他的增溶劑、崩解劑、著色劑、分散劑或表面活性劑。
[0060] 在本發(fā)明另一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種保健品，該保健品包含有效量的 芡實(shí)醇提物。此處的保健品是指具有特定功能，特定人群使用保健品。因此，此處的有效量 是指該保健品有效降低糖尿病腎病病人尿蛋白的量。由于芡實(shí)醇提物為純天然產(chǎn)物，具有 良好的降低尿蛋白和尿微量白蛋白的作用，因而制作成保健品，同樣能夠起到緩解糖尿病 腎病的效果。
[0061] 上述保健品同樣可以根據(jù)給藥途徑的不同，制備成不同的劑型。在本發(fā)明中，上述 保健品的劑型包括但不僅限于片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓劑、溶液劑或懸浮劑。
[0062] 同樣，該保健品中的芡實(shí)醇提物也是從芡實(shí)單味藥中提取得到，同樣含有酚類和 三萜類物質(zhì)，且酚類和三萜類物質(zhì)的質(zhì)量之和占芡實(shí)醇提物總質(zhì)量的百分比大于50 %，更 優(yōu)選，占60%。上述兩類物質(zhì)為降低尿蛋白和尿微量白蛋白的有效成分，因而其含量越高， 效果越好。
[0063] 類似地，該保健品中的酚類物質(zhì)包含沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、表兒茶素沒(méi)食子酸 酯、5, 7, 3'，4'，5' -五羥基二氫黃酮以及5, 7, 4' -三羥基二氫黃酮；三萜類物質(zhì)包括異落 葉松樹酯醇-9-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷；優(yōu)選地，芡實(shí)醇提物中酚類和三萜類物質(zhì)的質(zhì)量比 為 1 :1 ~2 :1〇
[0064] 下面將結(jié)合具體的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的芡實(shí)醇提物的藥效。
[0065] 實(shí)驗(yàn)一芡實(shí)提取物體外抗氧化能力的篩選
[0066] I. 1芡實(shí)提取物的制備
[0067] 稱取芡實(shí)果仁粗粉1公斤，用16000毫升體積濃度為80%的含水乙醇分兩次回流， 每次3小時(shí)?；亓饕哼M(jìn)行過(guò)濾，并對(duì)濾液進(jìn)行合并，減壓回收乙醇并濃縮成浸膏，經(jīng)大孔樹 脂吸附后，再用體積含量為20%~80%的乙醇洗脫，得到芡實(shí)醇提物。
[0068] 按已知方法福林酚法測(cè)定酚類物質(zhì)含量、香草醛-冰乙酸-高氯酸法測(cè)定萜類物 質(zhì)含量，結(jié)果表明，所得產(chǎn)物中酚類和三萜類物質(zhì)的含量之和為53 %。上述純化步驟所用的 大孔樹脂包括AB-8、DlOl、DM-301或HPD-100中的任意一種。
[0069] 用醇提后所剩藥渣，以10倍量水加熱提取，適當(dāng)濃縮后加3倍體積量的乙醇進(jìn)行 醇沉，得到沉淀粉末和水提物上清。
[0070] 1. 2從芡實(shí)醇提物、水提物上清和沉淀粉末中篩選抗氧化能力（總還原能力、對(duì) DPPH、02_和OH-的清除能力）較強(qiáng)的組分。
[0071] I. 2. 1總還原能力的測(cè)定
[0072] 分別量取Iml不同濃度的芡實(shí)醇提物、水提物上清和沉淀三種樣品溶液，分別加 入質(zhì)量濃度為1 %的K3Fe(CN)f^PpH= 6. 6的磷酸緩沖液各2. 5ml，于水浴鍋中50°C加熱 25min后取出，待樣品冷卻至室溫后加入質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液lml，3500r/min 離心IOmin后，取上清2ml并加入質(zhì)量濃度0. 1 %的FeCl3溶液0. 5ml和2ml蒸餾水，搖勻 后再靜置5min，于700nm下測(cè)定吸光度值，同時(shí)以維生素C(VC)作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0073] 其中，總還原能力的測(cè)定公式為：總還原能力=A樣品吸光度-A空白對(duì)照吸光度。 具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0074] 從圖1可以看出，芡實(shí)醇提物具有明顯還原能力，具有明顯的抗氧化作用，雖不如 對(duì)照品VC的還原能力強(qiáng)。在0. 6mg/ml濃度下吸光度值已接近1. 0。而水提物上清部分的 還原能力則較弱；水提物沉淀部分沒(méi)有顯示出還原能力。
[0075] 1. 2. 2清除DPPH能力的測(cè)定
[0076] 分別量取2ml不同濃度的芡實(shí)醇提物、水提物上清和沉淀三種樣品溶液，分別加 入2ml濃度為0.lmmol/L的DPPH溶液，搖勻后靜置30min，于517nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)樣。 以相同體積的無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，重復(fù)上述操作，測(cè)定吸光度A空；再取2ml樣品溶液 和2ml無(wú)水乙醇，混勻后測(cè)定溶劑的吸光度A0,同時(shí)以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0077] 其中，對(duì)DPPH的清除能力的測(cè)定公式為：對(duì)DPPH的清除能力=[1_(A樣-AO)/A 空]XlOO%。具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0078] 從圖2可以看出，芡實(shí)醇提物在濃度為0? 2mg/ml時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力已 與VC對(duì)照品相似，均在90%以上；水提物上清在濃度為0. 6mg/ml時(shí)的DPPH清除能力也達(dá) 到VC水平；而水提物沉淀所得結(jié)果顯示，其沒(méi)有明顯的清除DPPH能力。
[0079] 1. 2. 3清除超氧陰離子能力的測(cè)定
[0080] 量取4. 5ml濃度為0. 05mmol/LpH= 8. 2的Tris-HCl緩沖液，于25°C水浴鍋中 加熱15min，后加入Iml不同濃度的芡實(shí)醇提物、水提物上清和沉淀三種樣品溶液，再分別 加入已經(jīng)提前預(yù)熱的濃度為3mmol/l的鄰苯三酷溶液0. 5ml，于25°C加熱IOmin后，滴加 8mol/LHCl約Iml使反應(yīng)終止，于325nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)樣；同時(shí)以蒸餾水作為空白測(cè) 定反