海鵬順科學(xué)儀器有限公司）；酶 標(biāo)儀（MultiskanMK3,ThermoScientific);ULTFreezer_860C超低溫冰箱；ABI7500 焚光 定量PCR檢測儀；HC-3018R高速冷凍離心機（中科中佳公司）；MSC1. 8A2型生物安全柜；二 氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（BB16UV/BB5060UV，HERAEUS)。
[0064] 2、試驗方法
[0065] 1)細胞毒性實驗
[0066] 取生長狀態(tài)良好的H印G2. 2. 1. 5細胞，接種于平底96孔板，每孔IOOyL，37°C，5% CO2培養(yǎng)成單層細胞后，加入藥物進行實驗。拉米夫定組、九味牛黃丸組、改方組、改方1組、 改方2組和減方組各組藥物以1/2原浸膏質(zhì)量為起始濃度，依次2倍稀釋加入96孔細胞培 養(yǎng)板，共取8個濃度。拉米夫定由于有文獻報道，其用于IfepG2. 2. 1. 5細胞實驗中濃度為 IXKT6moI?I71，故以16XKT6moI?I71為起始濃度，依次2倍稀釋進行實驗。加藥后24h， 顯微鏡下觀察細胞病變，以細胞病變?yōu)橹笜?biāo)，完全破壞為4,破壞75%為3,破壞50%為2,破 壞25%為1，無病變?yōu)?。計算每濃度藥液平均細胞病變程度和抑制率。計算半數(shù)有毒濃度 (TC5tl)和最大無毒濃度（TC0)。
[0067] 2)體外抗HBV作用
[0068]取培養(yǎng)狀態(tài)良好的HePG2. 2. 1. 5細胞，接種96孔培養(yǎng)板，每孔100yL，37°C，5 % 〇)2條件下進行培養(yǎng)，細胞長成單層后加入藥物進行實驗。陽性藥物拉米夫定，取最大無毒 質(zhì)量濃度8X10_6mol?I71進行實驗。九味牛黃丸組、改方組、改方1組、改方2組和減方組 各組藥物以細胞毒性實驗所確定的最大無毒質(zhì)量濃度TCtl)為起始濃度，依次2倍稀釋加入 96孔細胞培養(yǎng)板，每濃度3孔，共4個質(zhì)量濃度。加藥培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清。用PBS緩 沖液清洗H印G2. 2. 1. 5細胞6遍，最后一遍收集待檢。每孔加入無菌三蒸水100yL，將細胞 反復(fù)-7〇1：，371：凍融5次，每次各1〇1^11，將所有收集的細胞液-7〇1：凍存待檢?！?154法檢 測HBsAg，HBeAg，Taqman探針實時熒光定量PCR檢測HePG2. 2. 1. 5培養(yǎng)上清液中HBV-DNA。
[0069] 3、統(tǒng)計學(xué)處理
[0070] 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差f±s)表示，采用SPSS13. 0軟件包進行統(tǒng)計分析，各組 間兩兩對比，t檢驗。
[0071] 4、結(jié)果
[0072] 1)細胞毒性實驗，結(jié)果見表5。
[0073] 表5各藥物在HePG2. 2. 1. 5細胞培養(yǎng)中的細胞毒性
[0074]

[0079] 注：與對照組比較，*p〈0. 05, #p〈0. 01
[0080] 5、小結(jié)
[0081] 陽性藥物拉米夫定組的三個指標(biāo)HBsAg，HBeAg和HBV-DNA與模型對照組比較差 異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 01，P〈〇. 05)，九味牛黃丸組、改方1組、改方2組和減方組對H印G 2. 2. 15細胞HBsAg分泌均有一定抑制作用，且各組藥物抗病毒效果并不隨著藥物濃度增加 而增強；其中，本發(fā)明組合物組（即改方組）的〇. 025~0. 193g劑量組，九味牛黃丸組的 0. 041~0. 163g劑量組，減方組的0. 185g劑量組，改方1組0. 023g、0. 180g劑量組，改方2 組0. 024g、0. 188g劑量組，對HBsAg分泌與細胞對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。表6第4 列是九味牛黃丸對HBeAg含量的影響，結(jié)果顯示：各組對H印G2. 2. 15細胞HBeAg分泌均有 一定抑制作用，且本發(fā)明組合物組的〇. 049-0. 193g劑量組，減方組的0. 093g劑量組，改方 1組的0. 090g、0. 180g劑量組，改方2組的0. 094-0. 188g劑量組對HBeAg分泌與細胞對照 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05)。表6第5列是九味牛黃丸對HBV-DNA含量的影響， 結(jié)果顯示：各組對H印G2. 2.I. 5細胞HBV-DNA分泌均有一定抑制作用，且本發(fā)明組合物組 (改方組）的0. 049g、0. 097g劑量組，九味牛黃丸組的0. 041~0. 082g劑量組，減方組的 〇. 〇93g劑量組，改方1組的0. 045g劑量組，改方2組的0. 047~0. 094g劑量組，對HBV-DNA 分泌與細胞對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05)。
[0082] 由表6第三列數(shù)據(jù)可得，各組中抗HBsAg作用最強的濃度組及抗HBsAg作用強度 分別為：
[0083] 九味牛黃丸組，0? 082g?mr1，L65±0. 63* ;減方組：0? 185g?mr1，L82±0. 58* ; 改方 1 組：〇? 〇23g.mr^L75±0. 48* ;改方 2 組：0? 188g^mrSL67±0. 58* ;由此，改方組 抗HBsAg作用趨勢最強。
[0084] 由表6第五列數(shù)據(jù)可得，各組中抗乙肝病毒作用最強的濃度組及HBV-DNA
[0085] 作用強度分別為：九味牛黃丸組，0. 041g?mrU. 79X106±2. 41X106* ;減方組： 0? 024g.mr1，I. 12X107±6. 70X106;改方 1 組：0? 090g.ml'2. 55X107±1. 92X107;改方 2組：0? 094g 73X106±5. 90XIO6* ;由此，對于HBV-DNA，改方I組和減方組作用趨 勢最弱，改方組與九味牛黃丸組作用趨勢最強，且二者效果相當(dāng)。
[0086] 綜上，本發(fā)明增加了甘青青蘭藥材100g、調(diào)整了紅花和獐牙菜的用量，使獐牙 菜與綠絨蒿的比例關(guān)系為2:1時，在抗HBsAg和抗HBV-DNA時效果最佳，其最佳濃度為 0. 097g?mr1和0. 049g?ml'且對腎臟無明顯毒性。
[0087] 以下實施例用于理解本發(fā)明，但不限于此。
[0088] 實施例1
[0089] -種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花200g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜300g，綠絨蒿150g，木香100g。
[0090] 實施例2
[0091] -種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花150g，巴夏嘎100g，渣馴 膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。
[0092] 實施例3
[0093] 一種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花150g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。
[0094] 實施例4
[0095] 一種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花200g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。
[0096] 實施例5
[0097] -種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花200g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜300g，綠絨蒿150g，木香100g。以上藥材，除 渣馴膏外，其余粉碎成細粉，過篩，混勻，用渣馴膏加適量水泛丸，干燥即得。
[0098] 實施例6
[0099] 一種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花150g，巴夏嘎100g，渣馴 膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。以上藥材，除澄馴膏外，其余粉 碎成細粉，過篩，混勻，用渣馴膏加適量水泛丸，干燥即得。
[0100] 實施例7
[0101] 一種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花150g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。以上藥材，除 渣馴膏外，其余粉碎成細粉，過篩，混勻，用渣馴膏加適量水泛丸，干燥即得。
[0102] 實施例8
[0103] 一種治療乙型肝炎的藏藥組合物，由以下藥材組成：紅花200g，巴夏嘎100g，甘青 青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100g。以上藥材，除 渣馴膏外，其余粉碎成細粉，過篩，混勻，用渣馴膏加適量水泛丸，干燥即得。
【主權(quán)項】
1. 一種治療乙肝的藏藥組合物，其特征在于：由以下藥材組成： 紅花150g，巴夏嘎100g，渣馴膏50g，波棱瓜子40g，獐牙菜150g，綠絨蒿150g，木香100go2. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種治療乙肝的藏藥組合物，其特征在于：由以下藥材組成： 紅花150g，巴夏嘎100g，甘青青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨 蒿 150g，木香 100g。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種治療乙肝的藏藥組合物，其特征在于：由以下藥材組成： 紅花200g，巴夏嘎100g，甘青青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜150g，綠絨 蒿 150g，木香 100g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種治療乙肝的藏藥組合物，其特征在于：由以下藥材組成： 紅花200g，巴夏嘎100g，甘青青蘭100g，澄馴膏50g，波棱瓜子40g，猜牙菜300g，綠絨 蒿 150g，木香 100g。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的一種藏藥組合物，其特征在于： 用于制備治療乙型肝炎、清肝熱，治療肝大，治療肝區(qū)疼痛、并減少了腎臟毒性的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種不含木香馬兜鈴和牛黃、可用于治療乙型肝炎的藏藥組合物，在九味牛黃丸的基礎(chǔ)上選擇性去掉了毒性藥材木香馬兜鈴及牛黃，減少了腎臟毒性，同時增加了甘青青蘭的使用，調(diào)整了紅花和獐牙菜的用量，并發(fā)現(xiàn)獐牙菜與綠絨蒿的比例關(guān)系為2:1時效果佳，以使藥方減毒但不降低療效。
【IPC分類】A61K36/80, A61P31/20, A61P1/16
【公開號】CN104887816
【申請?zhí)枴緾N201510373203
【發(fā)明人】李懷平, 王海蘋, 魏永義, 李麗, 李玉雙
【申請人】山東金訶藥物研究開發(fā)有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月30日