N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種負(fù)載新城疫弱毒活疫苗的N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/N，O-羧甲基殼聚糖納米粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(NewcastleDisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle DiseaseVirus, NDV)引起的一種高度接觸性傳染病，NDV對黏膜有特殊的親嗜性，特別是對呼吸道和消化道黏膜，黏膜成為抗NDV感染的第一道防線。因此，提高黏膜免疫系統(tǒng)的防御能力，可有效阻止NDV的吸附和侵入。目前，ND的預(yù)防接種常用的疫苗是傳統(tǒng)的弱毒活疫苗和滅活疫苗，但二者在實(shí)際應(yīng)用中均具有一定的局限性，如何提高疫苗的免疫效果是疫苗免疫研宄中迫切需要攻克的課題，疫苗劑型和遞送方式的改造是提高疫苗免疫效果的方法之一。目前，正在發(fā)展的納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)是解決上述問題的最有希望的途徑之一。由于殼聚糖分子間存在強(qiáng)烈的氫鍵作用，具有高結(jié)晶度，使得殼聚糖化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，只能溶于稀酸，幾乎不溶于水和有機(jī)溶劑，這種特性使殼聚糖既難以形成納米粒子，也不利于在堿性腸道環(huán)境中的吸收，在很大程度上限制了其廣泛應(yīng)用。因此，在制備理想的殼聚糖納米載藥粒子設(shè)計(jì)中，如何解決殼聚糖的水溶性成為了能否將其更大程度的用作納米載藥粒子基質(zhì)物質(zhì)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是要解決由于殼聚糖的溶解性差、取代度低，導(dǎo)致殼聚糖納米粒對疫苗抗原的包封率和載藥量低，在黏膜表面吸附能力差的問題，提供一種N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒的制備方法。
[0004]本發(fā)明N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0005]一、N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖(N-2-HFCC)的制備；
[0006]二、N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)的制備:
[0007]a、取0.5?2.0mg/mLN-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖溶液5mL，向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力攪拌3min混合均勻，得溶液A ;
[0008]b、將溶液A在室溫、無菌條件下，以900?1400r/min磁力攪拌10?50min后，向其中勻速滴加0.5?3.0mg/mL N, O-羧甲基殼聚糖溶液1.25?7.5mL，得溶液B ；
[0009]C、將溶液B于4°C、12000r/min離心20min，沉淀經(jīng)去離子水洗三次，真空冷凍干燥24h，即得負(fù)載新城疫弱毒活疫苗的N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/N，O-羧甲基殼聚糖納米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。
[0010]步驟二 a中新城疫L-系病毒液的病毒含量為107 5EID5Q。
[0011]本發(fā)明是利用環(huán)氧氯丙烷與N，N-二甲基乙胺發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，得到環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化,安(Epoxy propyl two methyl ethyl ammonium chloride，EEA)，在把EEA接枝到殼聚糖(CS)的氨基上，形成N-2-輕丙基二甲基乙基氯化錢殼聚糖(N-2-hydroxypropylmethyl ethyl ammonium chloride chitosan，N-2-HFCC);之后，再將 N-2-HFCC 與羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)聚合形成N_2_輕丙基二甲基乙基氯化錢殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。該發(fā)明采取新城疫病毒(L系)作為模型藥物。
[0012]與殼聚糖納米粒子相比，本發(fā)明制備的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs粒徑容易控制，NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs 粒徑在 120_500nm 之間，NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPsZeta電位在60_30mV之間，最大包封率可達(dá)96.6%。
[0013]本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是將自制環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨成功接枝到殼聚糖上得到N-2-HFCC，使殼聚糖具有較好的水溶性。殼聚糖分子間與分子內(nèi)含有大量氫鍵，由于環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨的引入，使殼聚糖分子間與分子內(nèi)的氫鍵被破壞，且水分子更容易接近這種松散的無定形狀態(tài)的大分子，改性后的殼聚糖衍生物中含有的親水基團(tuán)環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨，可以與水分子再次形成氫鍵，因而溶解度增加，成功的提高了殼聚糖的水溶性。并將所得材料N-2-HFCC制備成載新城疫納米粒NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs，本方法制備的納米粒生物安全性高，抑菌效果好，包封率高，并且降低了殼聚糖的分子量，使得藥物更好地與小腸壁細(xì)胞結(jié)合，更容易被肌體吸收。
【附圖說明】
[0014]圖1為殼聚糖和環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖的傅立葉轉(zhuǎn)換紅外譜圖。
[0015]圖2為環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖的核磁譜圖。
[0016]圖3為殼聚糖和環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖的XRD譜圖。
[0017]圖4為應(yīng)用牛津杯發(fā)對環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖所做的抑菌實(shí)驗(yàn)圖。
[0018]圖5為環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖取代度測定。
[0019]圖6為實(shí)施例1制備的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的體外釋放曲線圖。
[0020]圖7為實(shí)施例1制備的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的透射電鏡圖。
[0021]圖8 為實(shí)施例1 制備的 NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs 的 Zeta 電位圖。
[0022]圖9為實(shí)施例1制備的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的粒徑分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0024]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0025]一、N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖(N-2-HFCC)的制備；
[0026]二、N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖新城疫病毒納米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)的制備:
[0027]a、取0.5?2.0mg/mLN-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖溶液5mL，向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力攪拌3min混合均勻，得溶液A ;
[0028]b、將溶液A在室溫、無菌條件下，以900?1400r/min磁力攪拌10?50min后，向其中勻速滴加0.5?3.0mg/mLN, O-羧甲基殼聚糖溶液1.25?7.5mL，得溶液B ；
[0029]C、將溶液B于4°C、12000r/min離心20min，沉淀經(jīng)去離子水洗三次，真空冷凍干燥24h，即得負(fù)載新城疫弱毒活疫苗的N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖/N，O-羧甲基殼聚糖納米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。
[0030]本發(fā)明在殼聚糖的-NH2上引入環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨，獲得N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖，N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖與殼聚糖僅在酸性pH條件下具有水溶性相比，N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖在更寬pH范圍內(nèi)具有了良好的水溶性；同時(shí)，使得N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖納米粒對疫苗抗原的包封率和載藥量大大提高；此外，N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖能更好的附著在機(jī)體呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道等黏膜表面，具有更好的促吸收作用，誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的殼聚糖溶解性差、取代度低、包封率和載藥量低、黏膜表面吸附能力差的問題，進(jìn)一步拓寬了殼聚糖的應(yīng)用范圍。
[0031]本實(shí)施方式以N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖(N-2-HFCC)為載體，新城疫病毒La Sota株為模型藥物，采用聚電解質(zhì)復(fù)合法制備NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選具有外形圓整、表面光滑、粒徑大小適宜、粒徑分布小、包封率高、穩(wěn)定性好和適宜釋放速率的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs制備工藝條件，所制備的疫苗能提高免疫雞的體液免疫和細(xì)胞免疫水平，使這些免疫雞群具有更強(qiáng)的抗病毒能力，在受到強(qiáng)毒攻擊時(shí)，表現(xiàn)出更佳的免疫保護(hù)效果。本實(shí)驗(yàn)簡便易操作，制備過程中所需溶劑均為常用試劑，容易獲得，成本低，后續(xù)處理也較為簡單。
[0032]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖的制備方法如下:
[0033]一、環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨(EEA)的合成:
[0034]向4?15°C裝有電動攪拌器、滴液漏斗和冷凝回流裝置的干燥三口燒瓶中加入環(huán)氧氯丙烷，不斷攪拌并滴加N，N- 二甲基乙胺，Ih內(nèi)加完，同時(shí)加熱至10?35°C，恒溫反應(yīng)4?14h后，停止反應(yīng)，產(chǎn)品用冰丙酮洗滌，抽濾，將抽濾后的產(chǎn)品置于表面皿中，放真空干燥器中干燥6?24h，得到環(huán)氧丙基二甲基乙基氯化銨；其中環(huán)氧氯丙烷與N，