一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物和醫(yī)療器械（介入類醫(yī)療器械）領(lǐng)域，特別一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損 傷的凝膠支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國進(jìn)入老齡社會，膝關(guān)節(jié)軟骨損傷病人越來越多。目前對于此類疾病尚無 好的治療方法。目前臨床上常用的軟骨下骨打孔，骨軟骨移植以及自身軟骨細(xì)胞移植只能 部分緩解癥狀，不能達(dá)到重建軟骨缺損的目的，使用此類方法得到的修復(fù)組織主要成分為I 型膠原蛋白，與原有透明軟骨的II型膠原蛋白相比在生物學(xué)特性上相差甚遠(yuǎn)。
[0003] 在軟骨缺損處再生修復(fù)組織，重建軟骨缺損的基本原理為：募集自身或者引入外 源性的干細(xì)胞、較原始細(xì)胞于軟骨缺損處，并在相關(guān)生長因子等作用下分化為軟骨組織。關(guān) 節(jié)腔中有多種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞可以被招募到軟骨缺損處進(jìn)行損傷修復(fù)，如骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液中的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及髕下脂肪墊來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等。體 液以及血液等均有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向迀徙的能力，而軟骨微環(huán)境中的各種因子具有誘 導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化的能力。但是，由于自身體內(nèi)誘導(dǎo)因子作用效能的局 限性以及缺乏細(xì)胞生長的三維空間環(huán)境，因而，不能產(chǎn)生和原有軟骨組織類似的修復(fù)組織。
[0004] 為了解決軟骨再生這一難題，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界在過去幾十年間進(jìn)行了大量的探索和 研宄。如研宄各種生長因子來促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化；研宄基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來獲 得成軟骨能力更強(qiáng)的種子細(xì)胞；研宄新型的組織工程支架在體外構(gòu)建組織工程化軟骨進(jìn)而 植入體內(nèi)等。但是，這些方法都存在各種局限性：生長因子由于免疫原性不能體內(nèi)使用，基 因轉(zhuǎn)染技術(shù)存在安全性和致瘤性問題，組織工程化軟骨植入與原有組織很難整合等。因而， 目前這些方法都沒有很好的解決問題。近年來，在軟骨缺損處植入能募集并誘導(dǎo)自身間充 質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的三維支架是有光明前途的治療方式。植入三維多孔支架尤其是 植入能緩釋藥物的支架材料因能招募更多的間充質(zhì)干細(xì)胞并增強(qiáng)誘導(dǎo)效能，因而治療軟骨 再生帶來了巨大的希望，具有廣泛的社會經(jīng)濟(jì)意義。
[0005] 目前，研宄應(yīng)用較多的支架材料多為PLGA、PGA、膠原蛋白、纖維蛋白等，這些支架 材料特點(diǎn)為能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的I型膠原蛋白，而非II型膠原蛋白，因而不利于間充質(zhì) 干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。而在藥物緩釋支架的研宄領(lǐng)域，用來被緩釋的藥物多為生長因子， 此類藥物價(jià)格昂貴，而且具有免疫原性，體內(nèi)應(yīng)用有帶來動物源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因而，尋找 到合適形式的、能促進(jìn)細(xì)胞分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料以及安全有效、可以體內(nèi)使用 的誘導(dǎo)藥物是解決軟骨再生問題的關(guān)鍵。
[0006] 經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號為CN104072709A的發(fā)明專利申請公開了一種可光聚合醫(yī)用 透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的制備方法。該方法是將透明質(zhì)酸于室溫下溶解在水中攪拌4h，用 HCl調(diào)節(jié)其pH至3.5;將甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)緩慢滴加到反應(yīng)體系中，反應(yīng)溫度T 為60°C，反應(yīng)磁力攪拌12h，用乙醇沉淀即得到可光聚合的透明質(zhì)酸衍生物。將透明質(zhì)酸衍 生物溶解在在磷酸鹽緩沖溶液中，再加入水溶性光引發(fā)劑和抗菌藥物，在紫外光照射下得 到載有藥物的透明質(zhì)酸水凝膠。該方法實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸的改性以及可以反應(yīng)光聚合，成本 低，反應(yīng)過程可控性強(qiáng)，設(shè)備簡單，反應(yīng)過程易于操作，產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架的制備方法，該凝膠支架 可以在紫外點(diǎn)光源下聚合成凝膠狀，并且可以緩釋小分子有機(jī)化合物。
[0009] 為達(dá)到本發(fā)明的目的，具體采用如下的技術(shù)方案：
[0010] 一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架的制備方法，包括如下步驟：
[0011] ⑴透明質(zhì)酸鈉的修飾；
[0012] (2)將緩釋小分子化合物的PLGA納米顆粒溶解在步驟（1)修飾后的透明質(zhì)酸鈉 中，濃度為2-200um/L，再加入光引發(fā)劑，得到緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物 系統(tǒng)，按重量比，光引發(fā)劑的加入量為小分子化合物的1/10-1/8 ;
[0013] (3)將所述緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物系統(tǒng)注入/填充至待修復(fù) 關(guān)節(jié)軟骨損傷處經(jīng)紫外點(diǎn)光源照射，得到修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架。
[0014] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述修飾后的透明質(zhì)酸鈉可選用現(xiàn)有技術(shù)中的所有產(chǎn) 品，為了達(dá)到和光引發(fā)劑及納米顆粒的最佳結(jié)合，優(yōu)選采用通過如下方法制備得到的修飾 后的透明質(zhì)酸鈉，具體包括以下步驟：
[0015] (I) l_5g透明質(zhì)酸鈉溶解在50?IOOml的蒸餾水中，低溫條件（4?20°C )下放 置10?12h ;
[0016] (2)在步驟⑴所得溶液中加入1?3ml的甲基丙酸烯酐，在pH為8?9,溫度為 0?5°C的條件下反應(yīng)15?30h ;
[0017] (3)將步驟（2)所得的產(chǎn)物依次進(jìn)行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗凈，溶解 在去離子水中，去離子水透析24-72h，得修飾后的透明質(zhì)酸鈉。
[0018] 作為透明質(zhì)酸鈉修飾的最佳實(shí)施方式，包括以下步驟：
[0019] (l)2g透明質(zhì)酸鈉溶解在IOOml的蒸餾水中，低溫條件（4?20°C )下放置12h ;
[0020] ⑵在步驟⑴所得溶液中加入1.6ml的甲基丙酸烯酐，在pH為8?9,溫度為 4°C的條件下反應(yīng)24h ;
[0021] (3)將步驟（2)所得的產(chǎn)物依次進(jìn)行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗凈，溶解 在去離子水中，去離子水透析48h后，得修飾后的透明質(zhì)酸鈉。
[0022] 所述緩釋小分子化合物選自Kartogenin、雙磷酸鹽、Licofelone或雷尼酸鎖中的 一種或幾種，優(yōu)選為Kartogenin。
[0023] 當(dāng)緩釋小分子化合物選用Kartogenin時(shí)，優(yōu)選地，Kartogenin的PLGA納米顆粒溶 解在步驟（1)修飾后的透明質(zhì)酸鈉中，濃度為10um/L，本發(fā)明提供的凝膠支架持續(xù)緩釋軟 骨誘導(dǎo)藥物KGN達(dá)60天之久，并且濃度維持在最優(yōu)濃度IOuM ;支架可塑性強(qiáng)，可以根據(jù)軟 骨缺損的形狀隨意塑形；整個過程中未引入有害物質(zhì)，可以體內(nèi)使用；支架生物相容性好。
[0024] Kartogenin可選用市售產(chǎn)品，也可以采用如下方法進(jìn)行制備。具體的，Kartogenin 的制備流程如下所示：
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 透明質(zhì)酸鈉的修飾； (2) 將緩釋小分子化合物的PLGA納米顆粒溶解在步驟（1)修飾后的透明質(zhì)酸鈉中，濃 度為2-60um/L，再加入光引發(fā)劑，得到緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物系統(tǒng)，按 重量比，光引發(fā)劑的加入量為小分子化合物的1/10-1/8 ; (3) 將所述緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物系統(tǒng)注入/填充至待修復(fù)關(guān)節(jié) 軟骨損傷處經(jīng)紫外點(diǎn)光源照射，得到修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)具體包括以下步驟： (1) 1?5g透明質(zhì)酸鈉溶解在50?IOOml的蒸餾水中，低溫條件下放置10?12h ; (2) 在步驟⑴所得溶液中加入1?3ml的甲基丙酸烯酐，在pH為8?9,溫度為0? 5°C的條件下反應(yīng)15?30h ; (3) 將步驟（2)所得的產(chǎn)物依次進(jìn)行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗凈，溶解在去 離子水中，去離子水透析24-72h，得修飾后的透明質(zhì)酸鈉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述緩釋小分子化合物選自 Kartogenin、雙磷酸鹽、Licofelone或雷尼酸鎖中的一種或幾種，優(yōu)選為Kartogenin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述緩釋小分子化合物的PLGA納米 顆粒的制備方法包括以下步驟： (1) 將PLGA溶解在二氯甲烷中，濃度約為2-20mg/ml，得混合溶液1 ;將緩釋小分子化 合物溶解在丙酮中，濃度約為2-20mg/ml，得混合溶液2 ;將混合溶液2加入到混合溶液1 中，得混合溶液3 ; (2) 將混合溶液3通過注射泵添加到0. 05?0. 5% (V/V)殼聚糖溶液，在冰浴下使用 高速均質(zhì)器大于IOOOOrpm形成水包油乳液； (3) 將水包油乳液加入到100?300ml 0. 1?0. 5 % (V/V)的殼聚糖溶液中，100? 300rpm攪拌蒸發(fā)有機(jī)相； (4) 將步驟（3)所得產(chǎn)物通過離心得到緩釋小分子化合物的PLGA納米顆粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中將混合溶液3通過注射泵 添加到殼聚糖溶液的速度為l_3ml/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖的Mn為550-552kDa ;脫 乙酰度為92-98%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述光引發(fā)劑選用Irgacure 2595。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中紫外光強(qiáng)為5-20 μ W/cm2， 對應(yīng)的光照時(shí)間為30s-lmin。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物和醫(yī)療器械領(lǐng)域，特別涉及一種修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架的制備方法，具體包括如下步驟：(1)透明質(zhì)酸鈉的修飾；(2)將緩釋小分子化合物的PLGA納米顆粒溶解在步驟(1)修飾后的透明質(zhì)酸鈉中，再加入光引發(fā)劑，得到緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物系統(tǒng)；(3)將所述緩釋小分子化合物-透明質(zhì)酸鈉凝膠復(fù)合物系統(tǒng)注入/填充至待修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷處經(jīng)紫外點(diǎn)光源照射，得到修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的凝膠支架。本發(fā)明提供的凝膠支架支架可塑性強(qiáng)，可以根據(jù)軟骨缺損的形狀隨意塑形；整個過程中未引入有害物質(zhì)，可以體內(nèi)使用。
【IPC分類】A61L27-54, A61L27-52, A61L27-20, A61L27-18
【公開號】CN104587531
【申請?zhí)枴緾N201410828328
【發(fā)明人】顧臻, 史冬泉
【申請人】南京臻泉醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月25日