專利名稱：位阻醇或酚的水溶性前藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的含脂族或芳族位阻羥基藥物的水溶性前藥。更具體地說，本發(fā)明涉及新的含位阻醇和酚藥物的水溶性膦酰氧基甲基醚，如喜樹堿、丙泊酚、依托泊苷、維生素E和環(huán)孢菌素A。本發(fā)明也涉及用于生產最終藥物的中間體及包含新化合物的藥物組合物。
成功地向患者傳送藥物是治療疾病中起著關鍵作用。但是，許多具有公知性質的臨床藥物應用卻受到其水溶性非常低的限制。低水溶性的結果是，這些藥物必須配制成助溶劑藥物賦形劑中，包括表面活性劑。已表明，這些表面活性劑會導致對人體嚴重的副作用，這限制了這些藥物的臨床安全性，從而也限制了對嚴重的疾病的治療。
例如，喜樹堿是一種從中國喜樹(camptotheca)(Camptothecaaccuminata)的樹皮中分離出的天然產物。業(yè)已表明，在幾種體內動物模型中其具有很強的抗腫瘤活性，包括主要的腫瘤類型，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺，結腸癌和胃癌和惡性黑素瘤。喜樹堿可以抑制細胞酶DNA拓撲異構酶I并會引起導致編程性細胞死亡的級聯事件。拓撲異構酶I是一種基本核酶，其負責組織和調節(jié)DNA的拓撲學特性，從而使細胞可以復制、轉錄和恢復遺傳信息。

圖1--喜樹堿喜樹堿的主要缺點是其在水中的溶解度非常低。對于生物學研究來說，必須將化合物溶解于強有機溶劑(DMSO)或配制成作為在吐溫80鹽水中的懸浮液的藥物，對于人體治療來說，這種藥物制劑是不理想的。近年來，美國已批準了兩類具有適中水溶性的喜樹堿用于治療晚期卵巢癌(Hycamtin)和結腸直腸癌(Camptosar)。
其它類似于喜樹堿存在類似問題的藥物為環(huán)孢菌素A(CsA)、丙泊酚、依托泊苷和維生素E(α-生育酚)。與喜樹堿類似，CsA的結構內也具有空間位阻的醇，在此情形下的仲醇。CsA配制成Cremophor EL/乙醇混合物。 環(huán)孢菌素A丙泊酚作為一種麻醉劑是另一種空間位阻的水溶性很差的酚的實例。 丙泊酚(2，6-二異丙基苯酚)丙泊酚配制成o/w乳液用于體內臨床使用。丙泊酚不僅水溶性差，而且也會引起注射部件的疼痛。這種疼痛必需使用利多卡因來改善。由于其配制為乳液這一事實，因而很難且不可能向制劑中加入其它藥物，并且對制備的物理改變如增加油滴尺寸可能會導致肺栓塞等。丙泊酚的水溶性和化學穩(wěn)定的前藥將可提供如下的優(yōu)點。這種制劑可為一種簡單的水溶液，其可與其它藥物混合。如果前藥本身無痛，則前藥可對患者更為友好，最后，不會存在由于賦形劑造成的毒性問題。其它水溶性差的空間位阻酚為抗癌藥依托泊苷和維生素E(α-生育酚)。
本發(fā)明提供了一種水溶性形式的含醇和酚的藥物如喜樹堿和丙泊酚。就喜樹堿來說，本發(fā)明的化合物為游離酸和其可藥用鹽形式的喜樹堿的膦酰氧基甲基醚。酸和鹽的水溶性可方便制備藥物制劑。與其各個母藥相比，本發(fā)明所有的前藥顯示出優(yōu)異的水溶性。用于開發(fā)本發(fā)明的化合物的方法可用于將許多的其它具有脂族或芳族位阻羥基的水不溶性藥物轉化成水溶性衍生物。
本發(fā)明包含新的組合物主題。本發(fā)明涉及包含由通式I表示的含醇和酚藥物的水溶性膦酰氧基甲基衍生物 上式I為ROH的衍生物，其中，ROH代表一種含醇或酚的藥物，如喜樹堿、丙泊酚、依托泊苷、維生素E和環(huán)孢菌素A。在上式I中，n表示1或2的整數。當n為2時，ROH優(yōu)選為含酚的藥物，如丙泊酚。同樣還包括某些因其水溶性相對較差不可以注射形式使用的藥物。這些藥物包括達那唑、甲基睪酮、雙碘喹啉和阿托喹酮。R1為氫或堿金屬離子，包括鈉、鉀或鋰，或者質子化的胺或質子化的氨基酸或任何其它可藥用的陽離子。在靜脈內給藥或口服給藥后，式I的衍生物可通過水解和/或磷酸酶作用而轉化成其母藥。
因而，本發(fā)明的目的是提供一種顯示出優(yōu)良活性和水溶性的水不溶性藥物的衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供這些水溶性化合物的藥物組合物，其包含一定量的式I的化合物和可藥用載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供在適用于制備藥物制劑的pH值條件下具有優(yōu)良穩(wěn)定性，但在生理條件下很快體內分解成有效用作藥物的藥物衍生物。
圖2說明在狗研究中從丙泊酚前藥或Diprivan給藥起丙泊酚的血濃度隨時間的變化。
圖3說明體外酶轉化喜樹堿前藥成喜樹堿。
圖4說明在大鼠研究中喜樹堿的血漿濃度與喜樹堿前藥和與在有機助溶劑中的喜樹堿間的關系。
在本發(fā)明中，除非另有說明，采用下述定義“膦?；?”是指基團-P(O)(OH)2，“膦酰氧基甲氧基”或“膦酰氧基甲基醚”一般是指基團-OCH2OP(O)(OH)2?！凹谆蚣谆笔侵富鶊F-CH2SCH3。本發(fā)明也包括其中n＝2的化合物，從而“膦?；?氧甲基)醚”一般是指基團-OCH2OCH2OP(O)(OH)2。
“喜樹堿部分”是指包含20個碳的喜樹堿核心結構，其包含2個氮原子和4個氧原子，通過具有絕對構型的如下顯示的結構式表示。 如上所示的該計數體系為在常規(guī)喜樹堿衍生物中采用的體系，并在本申請中采用。例如，標號C20是指標記為“20”的碳原子。
“喜樹堿類似物”是指具有基本喜樹堿核心結構的化合物?？梢岳斫?，喜樹堿類似物包括但不限于下述化合物Topotecan，商購自SmithKline Beecham，Irinotecan(CPT-11)，商購自Pharmacia&Upjohn，9-氨基喜樹堿(9AC)，9-硝基喜樹堿(9NC)，GI 147211C，商購自Glaxo Wellcome，和DX-8951f(最早的六種喜樹堿類似物目前正在進行臨床研究，它們在Claire McDonald由西太平洋癌癥基金指導的綜述中有述(1997年12月)。
此外，其它幾種引入本文中作為參考的非限定性喜樹堿類似物公開于下述文獻中Sawada等，當前藥物設計(CurrentPharmaceutical Design)，Vol.1，No.11 PP 113-132，以及US專利5,646,159、5,559,235、5,401,747、5,364,858、5,342,947、5,244,903、5,180,722、5,122,606、5,122,526、5,106,742、5,053,512、5,049,668、4,981,968和4,894,456。
幾種包含其各自的喜樹堿衍生物的藥物化合物包含多于一個的羥基，例如，10-羥基喜樹堿，topotecan以及列于上述文獻中的幾種?？梢岳斫猓景l(fā)明可應用于多于一個羥基的情形。這一點可通過在進行衍生之前保護其它的羥基來實現。
“膦?；Ｗo基”是指可用于阻斷或保護膦酰基官能團的基團。優(yōu)選這種保護基團為那些可通過不會對分子的其它部分有明顯影響的方法除去的保護基。適宜的膦酰氧基保護基例如包括芐基(用“Bn”表示)、叔丁基和烯丙基。
“可藥用鹽”是指酸性膦酰基團的金屬或胺鹽，其中，陽離子不會顯著影響活性化合物的毒性或生物活性。適宜的金屬鹽包括鋰、鉀、鈉、鈣、鋇、鎂、鋅和鋁鹽。優(yōu)選的鹽為鈉和鉀鹽。適宜的胺鹽例如為氨、氨丁三醇、三乙醇胺、乙二胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、乙醇胺，可列出這些但還有其它鹽。優(yōu)選的胺鹽為賴氨酸、精氨酸、N-甲基葡糖胺和氨丁三醇鹽。
在說明書和權利要求書中，除非對游離酸有具體說明，否則術語-OCH2OP(O)(OH)2包括游離酸和其可藥用鹽。
一方面，本發(fā)明提供了如下所示式I的含醇和酚藥物的衍生物 式I的衍生物可按照反應路線1所示的反應順序制備反應路線1 其中，ROH代表含醇或酚的藥物，如喜樹堿、丙泊酚、依托泊苷、維生素E、環(huán)孢菌素A?？梢岳斫?，上述路線僅僅是幾種不同路線之一。這些不同路線在閱讀了下述詳細公開和實施例后將會非常明顯。
上述反應路線1的一個實例可采用化合物喜樹堿進行說明。可以理解，這些反應路線均適用于本發(fā)明式I所包括的其它化合物，例如如上列出的化合物。因此，本發(fā)明的另一個方面是提供式II的喜樹堿衍生物 其包括游離酸，其中，Z為氫，以及其可藥用鹽，其中，Z為金屬或胺?；蛘?，式II包括二酸，其中，在兩種情形下Z為金屬或胺。
式II化合物的優(yōu)選可藥用鹽為堿性鹽，包括鋰、鈉和鉀鹽；胺鹽，包括三乙胺、三乙醇胺、乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、和N-甲基葡糖胺鹽。
式II的喜樹堿衍生物的最優(yōu)選的實施方案包括下述化合物(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿，(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二鈉鹽，(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二鉀鹽，(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二精氨酸鹽，(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二賴氨酸鹽，(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二N-甲基葡糖胺鹽和(20)-O-膦酰氧基甲基喜樹堿單或二-三乙醇胺鹽。
式II的化合物可直接由喜樹堿(顯示為c-OH)按照反應路線2所示的反應順序制備 式III的化合物(甲基硫甲基醚，MTM醚)可通過用二甲基亞砜/乙酸酐/乙酸處理喜樹堿制備。
在反應路線2所示的第二步中，甲基硫甲基醚被轉化成相應的保護的膦酰氧基甲基醚(式IV的化合物)。這可以通過用N-碘代琥珀酰亞胺和保護的磷酸酯HOP(O)(OR)2處理MTM醚完成。在第三步中，可除去膦?；Ｗo基團以得到式II的化合物。例如，一種適宜的膦酰基保護基為芐基，其可通過催化氫解除去。
用于制備式I化合物的反應路線2的一般方法可更具體地由反應路線3舉例說明方案3
在第一步中，喜樹堿的游離羥基被轉化成甲基硫甲基醚(-OCH2SCH3)基團。該轉化過程是通過與二甲亞砜在乙酸酐和乙酸存在下反應完成的。該方法通常被稱為Pummer反應，由Bristol-MyersSquibb成功地用于紫杉醇的甲基硫甲基化反應(EP專利0604910A1，Bioorg.Med.Chem.Lett.，6，1837，1996)。該反應通常在室溫下進行24-72小時以生產甲基硫甲基醚。
在反應順序的第二步中，甲基硫甲基醚被轉化成相應的保護的膦酰氧基甲基醚。這種公知的轉化方法由Bristol-Myers Squibb成功地用于紫杉醇的膦酰氧基甲基化反應(EP專利0604910A1，Bioorg.Med.Chem.Lett.，6，1837，1996)。因此，式III的化合物可用N-碘代琥珀酰亞胺和保護的磷酸如磷酸二芐酯處理。反應在分子篩存在下，在惰性有機溶劑如四氫呋喃和鹵代烴如二氯甲烷中進行。反應在室溫下進行。相對于甲基硫甲基醚，N-碘代琥珀酰亞胺和保護的磷酸過量使用(3-5當量)。
在反應順序的第三步中，除去膦酰基保護基。解封采用現有技術中公知的常規(guī)方法完成，例如，酸或堿催化的水解、氫解、還原等。例如，可采用催化氫解以除去芐基膦?；Ｗo基。脫保護方法可在標準教科書中有述，例如T.W.Green和P.G.M.Wutz，有機合成中的保護基團，J.Wiley publishers，New York，NY，1991，pp.47-67。
式II化合物的堿性鹽可通過常規(guī)技術形成，包括使式II的游離酸化合物與金屬堿或胺接觸。適宜的金屬堿包括鈉、鉀、鋰、鈣、鋇、鎂、鋅和鋁的氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽；適宜的胺包括三乙胺、氨、賴氨酸、精氨酸、N-甲基葡糖胺、乙醇胺、普魯卡因、苯乍生、二芐胺、氨丁三醇(TRIS)、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、三乙醇胺等。堿鹽可進一步通過色譜法，再經冷凍干燥或結晶法純化。
本發(fā)明的化合物為膦酰氧基甲基醚藥物如喜樹堿、丙泊酚、依托泊苷、生育酚等。與母化合物相比，可藥用鹽形式顯示出改善的水溶性，因而成為更方便的藥物制劑。不受任何理論的限制，據信，本發(fā)明的膦酰氧基甲基醚為母藥物的前藥；膦酰氧基乙基部分會在體內會與磷酸酯酶接觸而分解，結果產生母化合物。如上所示，本發(fā)明的化合物為有效的藥物或治療劑。
例如，本發(fā)明的式II的化合物可以與喜樹堿類似的方式使用。喜樹堿前藥的結構如上所示。因此，在癌癥治療領域中的腫瘤學家將能夠不進行過度的實驗確定一種適宜的治療方案以給藥本發(fā)明的化合物。本發(fā)明化合物的給藥劑量、方式和安排并無特殊限制，將根據所采用的具體化合物改變。因此，式II的化合物可通過任一種適宜的給藥路徑給藥，優(yōu)選非腸道給藥；劑量例如可以為約0.1-約100mg/kg體重，或者約5-500mg/m2。式II的化合物也可口服給藥；口服劑量可為約5-約500mg/kg體重。實際上采用的劑量將根據特定制劑的配方、給藥路徑以具體位置、宿主和所治療腫瘤的類型改變。須考慮改變藥物作用的許多因素來確定劑量，這些因素包括年齡、性別、飲食和患者的身體狀態(tài)。
本發(fā)明式I前藥的另一個實例是丙泊酚。丙泊酚前藥的結構如下所示 丙泊酚前藥在上式中，對于丙泊酚前藥來說，Z與對式II中的定義相同。因而，在麻醉領域的麻醉學家將能夠不進行過度的實驗確定一種適宜的治療方案以給藥本發(fā)明的化合物。本發(fā)明化合物的給藥劑量、方式和安排并無特殊限制，將根據所采用的具體化合物改變。因此，式I的化合物如丙泊酚可通過任一種適宜的給藥路徑給藥，優(yōu)選非腸道給藥；給藥劑量例如可以為約0.5-約10mg/kg，按照通常的麻醉誘導或保持通常的麻醉過程進行?；蛘撸絀的化合物可通過非腸道輸注法給藥，劑量可以為2μg/kg/分鐘-800μg/kg/分鐘，按照用于保持通常麻醉的過程給藥，開始并保持MAC鎮(zhèn)靜或開始并保持ICU鎮(zhèn)靜。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，其含有藥物有效量的式I的化合物和一種或多種可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或輔劑。例如，本發(fā)明的化合物可配制成片劑、丸劑、粉末混合物、膠囊、可注射劑、溶液、栓劑、乳液、分散劑、食品預混物和其它適宜的形式。它們也可以無菌固體組合物的形式生產，例如，經過冷凍干燥，并且，如果需要的話，還可結合有其它的可藥用賦形劑。這種固體組合物可用無菌水、生理鹽水或水與有機溶劑如丙二醇、乙醇等或某些其它的無菌可注射介質在非腸道給藥前復配。
典型的可藥用載體例如為甘露糖醇、脲、葡聚糖、乳糖、非還原糖、馬鈴薯和玉米淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇、乙基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、碳酸鈣、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、苯甲酸芐酯、碳酸鈉、明膠、碳酸鉀、硅酸。藥物制劑也可包含無毒的輔助性物質，如乳化劑、防腐劑、潤濕劑等，例如，單月桂酸脫水山梨醇酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧亞乙基單硬脂酸酯、甘油基三棕櫚酸酯、磺基琥珀酸鈉二辛酯等。
在下述實驗過程中，除非另有說明，所有的溫度均指攝氏溫度(C)。核磁共振(NMR)光譜特性是指化學位移(δ)，以ppm表示，用四甲基硅烷(TMS)作為參考標準。對在質子NMR光譜數據中各種位移所報告的相對面積相應于在分子中特定功能類型的氫原子數。位移的多重性以下述報告寬單峰(bs)，寬雙峰(bd)，寬叁峰(bt)，寬四峰(bq)，單峰(s)，多重峰(m)，雙峰(d)，四重峰(q)，三重峰(t)，雙峰的雙峰(dd)，三峰的雙峰(dt)和四重峰的雙峰(dq)。用于取得NMR光譜的溶劑為丙酮-d6(氘化丙酮)、DMSO-d6(全氘二甲基亞砜)，D2O(氘化水)，CDCl3(氘化氯仿)和其它常規(guī)氘化溶劑。
本文中采用的簡寫為本領域中廣泛采用的常規(guī)簡寫。其中的一些是MS(質譜)；HBMS(高分辨質譜)；Ac(乙?；?；Ph(苯基)；FAB(快速原子轟擊)；min(分鐘)；h或hrs(小時)；NIS(N-碘代琥珀酰亞胺)；DMSO(二甲基亞砜)；THF(四氫呋喃)。
由下述實施例說明本發(fā)明代表性化合物的合成，無論如何，它們并非對本發(fā)明保護范圍的限定。本領域的技術人員能夠采用這些方法，不進行過度的實驗合成出在本發(fā)明范圍內的但未具體描述的化合物。例如，在下述實施例中，采用了特定的鹽，但這些鹽并非是限定性的。這種情形的一個實例就是報導使用磷酸二芐基酯的銀鹽。四烷基銨鹽，如四甲基銨鹽或其它堿金屬鹽可用來代替銀鹽。
實施例I.合成O-磺酰氧基甲基丙泊酚 Ia.合成O-甲基硫甲基丙泊酚 在15分鐘內，向保持在氬氣氛下，攪拌中的氫化鈉(150mg，6.2mmol)在無水HMPA(10mL)中的懸浮液中滴加丙泊酚(1.1mL，97％，5.7mmol)。然后，將反應混合物在室溫下再攪拌30分鐘。向混合物中滴加氯甲基甲基硫化物(550μl，95％，6.2mmol)，再在室溫下攪拌。20小時后，使反應混合物在攪拌下于水(10mL)與苯(20mL)間分配。分離出水層，用苯(10mL)萃取。合并苯餾分，用水(2×3mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，減壓蒸發(fā)。將形成的油狀殘余物進行柱色譜處理(硅膠，己烷，然后4∶1己烷/氯仿)，得到1.15g(85％收率)的標題化合物，為無色油。EIMS[M+]，m/z238。1H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.24(d，J＝6.9Hz，12H)，2.37(s，3H)，3.37(hept，J＝6.9Hz，2H)，4.86(s，2H)，7.12(s，20 3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)15.40，23.98，26.68，78.12，124.04，125.05，141.74，152.20。 在5℃及5分鐘內，向保持在氬氣氛下，攪拌中的O-甲基硫甲基丙泊酚(3.00g，12.5mmol)的無水二氯甲烷(30mL)溶液中加入1M的SO2Cl2的無水二氯甲烷(12.2mL，12.2mmol)溶液。將反應混合物在相同的溫度下攪拌10分鐘，然后在室溫下攪拌3小時。減壓蒸出溶劑。將褐色的殘余物油用快速柱色譜純化(硅膠，1∶20己烷/乙酸乙酯)，得到2.36g(83％收率)的標題化合物，為一種黃色油。CIMS(NH3)[M+]，m/z 226，[MH+NH3]+，m/z 244。1H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.22(d，J＝6.9Hz，12H)，3.35(hept，J＝6.9Hz，2H)，5.76(s，2H)，7.15(m，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)23.93，26.84，83.34，124.34，125.95，141.34，150.93。Ic.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(反應路線-1) 將O-氯甲基丙泊酚(2.20g，9.7mmol)、磷酸二芐基酯銀鹽(3.85g，10.0mmol)和無水甲苯(50mL)的混合物在氬氛氣下回流45分鐘。將混合物冷卻至室溫，過濾。在真空蒸出溶劑后，將油狀殘余物通過硅膠快速柱色譜純化(9∶1己烷/乙酸乙酯，然后1∶1己烷/乙酸乙酯)，得到4.43g(98％收率)的標題化合物，為一種黃色油。CIMS(NH3)[MH]+，m/z469，[MH+NH3]+，m/z486。1H NMR(300MHz，CDCl3，δ1.17(d，J＝6.8Hz，12H)，3.33(hept，J＝6.9Hz，2H)，5.00(d，J＝7.8Hz，2H)，5.01(d，J＝7.8Hz，2H)，5.42(d，J＝.9.9Hz，2H)，7.12(m，3H)，7.32 10(m，10H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)23.79，26.57，69.15，69.23，94.14，94.20，124.07，125.62，127.70，128.44，135.42，135.51，141.50，151.07。Ic.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(另一種反應路線-1) 在0-5℃及5分鐘內，向氬氣氛下，攪拌中的O-甲基硫甲基丙泊酚(1.45g，6.08mmol)的無水二氯甲烷(15mL)溶液中加入1M的SO2Cl2的無水二氯甲烷(6.5mL，6.5mmol)溶液。將反應混合物在5℃下攪拌10分鐘，然后在室溫下攪拌3小時。減壓蒸出溶劑。將殘余物油溶解于甲苯(ACS-級，20mL)；加入磷酸二芐基酯銀鹽(3.50g，9.1mmol)，將形成的混合物回流45分鐘。將棕色的反應混合物冷卻至室溫，過濾。在真空蒸出溶劑后，將油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(9∶1己烷/乙酸乙酯，然后1∶1-己烷/乙酸乙酯)，得到2.41g(85％收率)的標題化合物，為一種黃色油。該產物與確認的實例具有相同的Rf(TLC)和1H NMR光譜(300MHz，CDCl3)。Ic.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(另一種反應路線-2) 在5分鐘內，在氬氣氛下，向攪拌中的氫化鈉(41mg，60％礦物油中的分散液，1.02mmol)在無水二甲氧基乙烷(1.5mL)中滴加丙泊酚(200μl，97％，1.04mmol)，將形成的混合物再攪拌15分鐘。在15分鐘內，向形成的均勻溶液滴加攪拌中的氯碘代甲烷(4.0mL，53mmol)的無水二甲氧基乙烷(4mL)溶液。將反應混合物攪拌2小時，過濾，蒸出溶劑和過量的氯碘代甲烷。將殘余物油溶解于溶解于甲苯(HPLC-級，10mL)中。向該溶液中中入磷酸二芐基酯銀鹽(400mg，1.04mmol)，將形成的混合物回流10分鐘。在將反應混合物冷卻至室溫后，過濾，真空蒸出溶劑。將油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(9∶1己烷/乙酸乙酯和然后1∶1己烷/乙酸乙酯)，得到205mg(42％收率)的標題化合物，為一種黃色油。該產物與確認的實例具有相同的Rf(TLC)和1H NMR光譜(300MHz，CDCl3)。
對于上述反應Ic(另一種反應路線-2)來說，可以理解，可使用其它的試劑，這取決于所需的化合物。例如，當需要其中n＝2的式I化合物時，可用諸如X-CH2-O-CH2-Cl(其中X為優(yōu)良的離去基團)代替氯碘代甲烷。Ic.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(另一種反應路線-3) 在氬氣氛下，向攪拌中的O-甲基硫甲基丙泊酚(91mg，0.38mmol)的無水二氯甲烷(2mL)溶液中滴加粉末狀的、活化的4A分子篩(100mg)，然后加入磷酸二芐基酯鹽(127mg，0.45mmol)和N-碘代琥珀酰亞胺(102mg，95％，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，過濾，用二氯甲烷(30mL)稀釋。將形成的溶液用硫代硫酸鈉(2mL，1M溶液)、飽和碳酸氫鈉溶液(3mL)、鹽水(5mL)洗滌，用硫酸鈉與硫酸鎂的混合物干燥，過濾，真空濃縮。將油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(1∶1己烷/乙酸乙酯)，得到120mg(67％收率)的標題化合物，為一種黃色油。該產物與確認的實例具有相同的Rf(TLC)和1H NMR光譜(300MHz，CDCl3)。Ic.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(另一種反應路線-4) 向丙泊酚(38mg，97％，0.21mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入四丁基溴化銨(10mg，0.03mmol)和氫氧化鈉(40mg，1mmol)的水(0.2mL)溶液。將非均相混合物攪拌15分鐘。然后，加入磷酸二芐基氯代甲基酯(104mg，0.32mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，將反應混合物劇烈攪拌8小時。再將混合物用二氯甲烷(10mL)稀釋，用水(2mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾，真空蒸發(fā)。將油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(己烷，20∶1己烷/乙酸乙酯，和10∶1己烷/乙酸乙酯)，得到44mg(45％收率)的標題化合物，為一種黃色油。該產物與確認的實例具有相同的Rf(TLC)和1H NMR光譜(300MHz，CDCl3)。
對于上述反應Ic(另一種反應路線-4)來說，可以理解，下述試劑 一般可用下式表示 其中，X代表離去基團，R3和R4分別為氫原子、有機基團或無機基團，Y為磷酸酯保護基。離去基團的實例包括氯、溴、碘、甲苯磺酸根，或者任一種其它適宜的離去基團。磷酸酯保護基的實例包括暫時阻斷磷酸酯基團的反應性并允許用親核置換反應進行選擇性置換。這種阻斷基團的實例包括但不限于芐基、烯丙基、叔丁基和異丙基、乙基和β-氰基乙基。Ic.合成O-磺酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(另一種反應路線-5) 在5分鐘內，在氬氣氛下，向攪拌中的氫化鈉(36mg，60％礦物油分散液，0.91mmol)的無水二甲氧基乙烷(2mL)懸浮液中滴加丙泊酚(172μl，97％，0.90mmol)。將形成的混合物在室溫下攪拌20分鐘。然后，向混合物中加入甲醛雙(二芐基膦?；?縮乙醛(500mg，0.88mmol)的無水二甲氧基乙烷(3mL)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌20小時，然后在70℃下攪拌2.5小時。然后，將混合物過濾，真空蒸出溶劑。將油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(己烷，10∶1己烷/乙酸乙酯，然后1∶1己烷/乙酸乙酯)，得到29mg(7％收率)的標題化合物，為一種黃色油。該產物與確認的實例具有相同的Rf(TLC)和1HNMR光譜(300MHz，CDCl3)。Id.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚 向O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(115mg，0.245mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入鈀/炭(10％，20mg)。將該混合物在氫氣氛(1atm)下攪拌1.5小時。通過硅藻土過濾除去催化劑，將濾液經減壓蒸發(fā)，得到70.5mg(100％收率)的標題化合物，為一種無色油，在室溫下放置不穩(wěn)定。FABMS-(GLY)[M-H]-，m/z 287。1H NMR(300MHz，丙酮-d6，δ)1.19(d，J＝6.8Hz，12H)，3.46(sext，J＝6.8Hz，2H)，5.45(d，J＝9.7Hz，2H)，7.15(m，3H)。13CNMR(75MHz，丙酮-d6，δ)24.2178，27.1496，94.63，94.65，124.08，126.30，142.46，152.32。Ie.合成O-膦酰氧基甲基丙泊酚二鈉鹽 向O-膦酰氧基甲基丙泊酚二芐基酯(1.05g，2.24mmol)的四氫呋喃(100mL)溶液中加入水和鈀/炭(10％，300mg)。將此混合物在氫氣(1atm)下攪拌1小時。經硅藻土過濾除去催化劑，將濾液用碳酸鈉的水合物(263mg，3mL水中，2.12mmol)處理。減壓蒸出THF，將殘余的水溶液用乙醚(3×3mL)萃取。將水層蒸發(fā)至干(氬氣流或旋轉蒸發(fā)器)，將形成的固體在真空下過夜干燥，用乙醚(4×4mL)、己烷(2×4mL)洗滌，再在真空中干燥，得到655mg(93％收率)的標題化合物，為一種白色粉末。FABMS-(GLY)(M-2Na+H]-，m/z 287。1H NMR(300MHz，D2O，δ)1.22(d，J＝7.0Hz，12H)，3.46(hept，J＝6.9Hz，2H)，5.27(d，J＝7.5Hz，2H)，7.28(m，3H)。II.合成O-膦酰氧基甲基-α-生育酚 IIa.合成O-膦酰氧基甲基-α-生育酚二芐基酯 向磷酸二芐基氯代甲基酯(323mg，0.98mmol)、α-生育酚(409mg，97％，0.92mmol)和四丁基溴化銨(301mg，0.92mmol)的苯(5mL)溶液中加入氫氧化鈉的水溶液(150mg，在0.2mL水中，3.7mmol)。在氬氣氛下，將形成的反應混合物在室溫下劇烈攪拌2小時。然后將混合物用苯(10mL)稀釋，再用水(3×3mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸發(fā)。將褐色的油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(10∶1己烷/乙酸乙酯)，得到336mg(51％收率)的標題化合物，為一種黃色油。FABMS+(NBA)[M]+，m/z 720。1H NMR(500MHz，CDCl3，δ)0.85(m，12H)，1.21(s，3H)，1.27(m，24H)，1.75(m，2H)，2.06(s，3H)，2.11(s，3H)，2.14(s，3H)，2.54(t，J＝6.8Hz，2H)，4.97(m，4H)，5.20(d，J＝9.3Hz，2H)，7.31(m，10H)。IIb.合成O-磺酰氧基甲基-α-生育酚 向O-膦酰氧基甲基-α-生育酚二芐基酯(88mg，0.12mmol)的四氫呋喃(10mL)溶液中加入加入鈀/炭(10％，15mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌10分鐘(反應在5分鐘后完成，根據TLC判斷)。經硅藻土過濾除去催化劑，將濾液在減壓下蒸發(fā)，然后在真空下干燥。獲得標題化合物70mg(100％收率)，為一種褐色油，其在室溫下不穩(wěn)定。FABMS+(NBA)[M]+，m/z 540，[M+Na]+，m/z 563；(NBA+Li)[M+Li]+，m/z 547。IIc.合成O-膦酰氧基甲基-α-生育酚 向O-膦酰氧基甲基-α-生育酚二芐基酯(100mg，0.14mmol)的四氫呋喃(10mL)溶液中加入鈀/炭(10％，18mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌5分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑，將濾液在室溫及減壓下蒸發(fā)，將形成的殘余物溶解于乙醚(2mL)中。然后，醚溶液用氫氧化鈉的水溶液(11.2mg，在100mL水中，0.28mmol)處理，將形成的混合物在室溫下攪拌10分鐘。除去醚相，將水相用乙醚(3×3mL)洗滌，然后在真空下干燥20小時，得到73mg(89％收率)的標題化合物，為一種灰色的固體。FABMS+(TG/G)[MH]+，m/z585，[M+Na]+，m/z 607。
喜樹堿的水溶性衍生物的合成過程也如以下詳細描述III.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿 IIIa.合成20-O-甲基硫甲基喜樹堿 向喜樹堿(5.0g，14.3mmol)在二甲亞砜(250mL)中的懸浮液中加入乙酸酐(125mL)和乙酸(35mL)。將多相混合物在室溫下劇烈攪拌24小時，再倒入冰(800mL)中，再攪拌30分鐘，然后用二氯甲烷(4×100ml)萃取。將合并后的二氯甲烷萃取液用水(2×100mL)洗滌，再用硫酸鎂干燥。減壓除去二氯甲烷，得到一種褐色的固體。將該固體溶解于少量的二氯甲烷中。將溶解過濾，并用10倍過量的己烷稀釋，然后在冰箱中過夜。濾除沉淀出的固體，用己烷洗滌幾次，干燥，得到5.38g(92％收率)的標題化合物，為一種淺褐色粉末。αD20-123.6°(c0.55，CHCl3)。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 409。1H NMR(400MHZ，CDCl3，δ)0.93(t，J＝7.2Hz，3H)，2.11(sext，J＝7.6Hz，1H)，2.29(sext，J＝7.6Hz，1H)，2.30(s，3H)，4.58(s，2H)，5.33(s，2H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.62(d，J＝17.3Hz，1H)，7.48-(s，1H)，7.69(t，J＝7.1Hz，1H)，7.86(t，J＝7.1Hz，1H)，7.96(d，J＝8.1Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz；1H)，8.42(s，1H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)7.76，14.89，33.90，49.92，66.68，71.02，76.57，97.51，122.63，128.02，128.09，128.30，129.71，130.64，131.11，145.14，146.10，148.88，152.27，157.43，169.34，169.73。IIIb.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二芐基酯 向攪拌良好的20-O-甲基硫甲基喜樹堿(1.00g，2.44mmol)和粉末狀的活化的4分子篩(5g)在四氫呋喃(20mL)中的懸浮液中加入N-碘代琥珀酰亞胺(2.00g，95％，8.44mmol)和磷酸二芐基酯(2.20g，7.83mmol)在二氯甲烷(12mL)中的懸浮液。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌30分鐘，過濾，用乙酸乙酯(300mL)稀釋。將溶液用硫代硫酸鈉水溶液(10％，2×15mL)、水(2×20mL)、鹽水(50mL)洗滌，用硫酸鎂干燥。將混合物過濾，減壓蒸出溶劑。將褐色的油狀殘余物用硅膠快速柱色譜純化(98∶2乙酸乙酯/甲醇)，并在真空下過夜干燥，得到1.19g(76％收率)的標題化合物，為一種黃色泡沫物。α20D-43.1°(c0.55，CHCl3)。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 639。1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)0.91(t，J＝7.4Hz，3H)，2.09(sext，J＝7.4Hz，1H)，2.26(sext，J＝7.4Hz，1H)，5.06(m，4H)，5.28(m，3H)，5.35(d，J＝17.0Hz，1H)，5.48(2xd，J＝10.5Hz，1H)，5.64(d，J＝17.3Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.67(t，J＝7.0Hz，1H)，7.80(t，J＝7.1Hz，1H)，7.94(d，J＝8.0Hz，1H)，8.13(d，＝8.5Hz，1H)，8.35(S，1H)。13C NMR(100MHz，CDCl3，δ)7.73，29.53，32.49，49.86，66.74，69.37，69.44，78.48，88.99，89.04，98.09，121.55，127.65，127.70，127.90，128.01，128.25，128.35，128.36，129.62，130.48，130.97，135.45，135.55，145.47，145.82，148.76，152.15，157.18，168.67。IIIc.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿 向20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二芐基酯(500mg，0.78mmol)在四氫呋喃(100mL)和水(5mL)中的溶液中加入鈀/炭(10％，500mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌35分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑。然后，硅藻土用四氫呋喃(300mL)洗滌，合并后的濾液在減壓下蒸發(fā)。將形成的綠色固體用乙醚(2×20mL)、己烷(50mL)洗滌，真空干燥，然后溶解于熱甲醇(60mL)中。將溶液過濾，減壓濃縮至約10mL體積。在室溫下放置1小時后，將溶液放置在冰箱中過夜。濾出過夜形成的結晶沉淀，真空干燥，得到155mg的標題化合物，為一種黃色固體。將濾液濃縮至約1mL體積，并在冰箱中保持1小時，得到另一部分28mg的產物?？偸章?83mg(51％)。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 459，[M+Na]+，m/z 481。1H NMR(400MEz，D2O，δ)0.95(t，J＝7.5Hz，3H)，2.25(m，2H)，4.98(d，J＝5.0Hz，2H)，5.14(2xd，J＝9.3Hz，1H)，5.22(2xd，J＝8.9Hz，1H)，5.48(d，J＝17.0Hz，1H)，5.60(d，J＝16.9Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.56(t，J＝7.7Hz，1H)，7.77(t，J＝7.2Hz，1H)，7.86(d，J＝8.2Hz，1H)，8.01(d，＝8.5Hz，1H)，8.44(s，1H)。
產物的化學結構與純度也通過其二鈉鹽的1H NMR光譜確認，所述二鈉鹽是由酸與D2O中的兩摩爾當量的碳酸氫鈉形成的。IIIc.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(另一種方式) 向20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二芐基酯(500mg，0.78mmol)在四氫呋喃(100mL)和水(5mL)中的溶液中加入鈀/炭(10％，500mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌30分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑。然后，硅藻土用四氫呋喃(2×100mL)洗滌，合并后的濾液用碳酸鈉水合物(97mg，2mL水中，0.78mmol)的水溶液處理。減壓蒸出THF，將多相的含水殘余物用水(10mL)稀釋，再用乙酸乙酯(2×3mL)萃取。將形成的黃色均勻溶液用鹽酸(10％)酸化至pH值為1。將形成的沉淀過濾，在真空下干燥過夜，得到145mg(41％收率)的標題化合物，為一種黃色固體。IIId.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二鈉鹽 向20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(5mg，10.9μmol)在氧化氘(0.5mL)中的懸浮液中加入碳酸氫鈉(50μl，0.44M溶液，22μmol)的氧化氘溶液。將多相混合物進行超聲處理幾分鐘，得到標題產物的黃色均勻溶液。1H NMR(400MHz，D2O，10mm后，96％內酯，4％羧酸鹽，δ)1.05(t，J＝7.2Hz，3H)，2.27(m，2H)，4.57(d，J＝18.8Hz，1H)，4.70(d，J＝18.9Hz，1H)，5.06(dd，J＝8.3，J＝5.4Hz，1H)，5.18(dd，J＝7.6，J＝5.5Hz，1H)，5.45(d，J＝16.7Hz，1H)，5.59(d，J＝16.8Hz，1H)，7.34(t，J＝7.1Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.60(m，2H)，7.81(d，J＝8.3Hz，1H)，8.17(s，1H)。IIId.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二鈉鹽(另一種方式) 向20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二芐基酯(78mg，0.122mmol)在四氫呋喃(10mL)和水(3mL)中的溶液中加入鈀/炭(10％，80mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌30分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑。然后，濾液用碳酸鈉水合物(20mg，0.5mL水中，0.238mmol)的水溶液處理。濾出黃色的沉淀，用二氯甲烷洗滌，真空干燥，得到35mg(57％收率)的標題化合物(淺褐色固體)，為其內酯形式(82％)和其羧酸鹽形式(18％)的混合物(通過1H NMR)。IIId.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二鈉鹽(另一種方式) 向20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿二芐基酯(500mg，0.78mmol)在四氫呋喃(10mL)和水(5mL)的溶液中加入鈀/炭(10％，500mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌30分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑。然后，硅藻土用四氫呋喃(50mL)洗滌，合并后的濾液用碳酸鈉水合物(90mg，2mL水中，0.72mmol)的水溶液處理。減壓蒸出四氫呋喃，將殘余物溶解于水(15mL)中。多相混合物用乙酸乙酯(2×15mL)和乙醚(20mL)萃取，將形成的均勻水溶液在氬氣氛及室溫下蒸發(fā)至干。將殘余物在真空下過夜干燥，得到290mg(80％收率)的標題化合物(橙色固體)，為其內酯形式(60％)和其羧酸鹽形式(40％)的混合物，并有少量的副產物(通過1H NMR)。IIIe.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿一鈉鹽
向連續(xù)進行超聲處理的20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(5mg，10mmol)在氧化氘(0.5mL)中的懸浮液中滴加碳酸氫鈉(21μl，0.44M溶液，9.2mmol)的氧化氘溶液直至完全均勻。獲得標題化合物的黃色均勻溶液。1H NMR(400MHz，D2O，δ)1.00(t，J＝7.2Hz，3H)，2.23(m，2H)，4.40(d，J＝18.8Hz，1H)，4.50(d，J＝18.8Hz，1H)，5.10(dd，J＝9.7，J＝5.9Hz，1H)，5.26(dd，J＝9.0，J＝6.1Hz，1H)，5.39(d，J＝16.7Hz，1H)，5.50(d，J＝16.7Hz，1H)，7.20(t，J＝7.3Hz，1H)，7.28(s，1H)，7.46(m，2H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，8.02(s，1H)。IIIf.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿賴氨酸鹽 向連續(xù)進行超聲處理的20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(5mg，10mmol)在氧化氘(0.5mL)中的懸浮液中滴加L-賴氨酸(25μl，0.43M溶液，10.7mmol)的氧化氘溶液直至完全均勻。獲得標題化合物的黃色均勻溶液。1HNMR(400MHz，D2O，94％內酯，6％羧酸鹽，δ)1.02(t，J＝7.2Hz，1H)，1.49(m，2H)，1.73(m，2H)，1.88(m，2H)，2.25(m，2H)，3.03(t，J＝7.5Hz，2H)，3-76(t，J＝6.0Hz，1H)，4.43(d，J＝19.0Hz，1H)，4.52(d，J＝18.9Hz，1H)，5.11(dd，J＝9.7，J＝5.8Hz，1H)，5.27(dd，J＝9.2，J＝5.8Hz，1H)，5.41(d，J＝16.7Hz，1H)，5.53(d，J＝16.7Hz，1H)，7.23(t，J＝7.4Hz，1H)，7.30(s，1H)，7.49(m，2H)，7.68(d，J＝8.4Hz，1H)，7.04(s，1H)。IIIg.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿精氨酸鹽 向連續(xù)進行超聲處理的20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(5mg，10mmol)在氧化氘(0.5mL)中的懸浮液中滴加L-精氨酸(27μl，0.40M溶液，10.8mmol)的氧化氘溶液直至完全均勻。獲得標題化合物的黃色均勻溶液。1H NMR(400MHz，D2O，δ)1.02(t，J＝7.1Hz，1H)，1.66(m，2)，1.89(m，2H)，2.25(m，2H)，3.20(t，J＝6.8Hz，2H)，3.77(t，J＝6.0Hz，1H)，4.40(d，J＝19.0Hz，1H)，4.49(d，J＝10 18.8Hz，.1H)，5.12(dd，J＝9.7，J＝6.0Hz，1H)，5.29(dd，J＝8.8，J＝6.1Hz，1H)，5.40(d，J＝16.7Hz，1H)，5.51(d，J＝16，7Hz，1H)，7.20(t，J＝7.3Hz，1H)，7.29(s，1H)，7.47(m，2H)，7.66(d，J＝8.3Hz，1H)，8.03(s，1H)。IIIh.合成20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿N-葡糖胺鹽 向連續(xù)進行超聲處理的20-O-膦酰氧基甲基喜樹堿(5mg，10.9mmol)在氧化氘(0.5mL)中的懸浮液中滴加(D)-N-甲基葡糖胺(21μl，0.51M溶液，10.7mmol)的氧化氘溶液直至完全均勻。獲得標題化合物的黃色均勻溶液。1H NMR(400MHz，D2O，δ)1.02(t，J＝7.3Hz，3H)，2.25(m，2H)，2.78(s，3H)，3.20(m，2H)，3.65(m，2H)，3.80(m，3H)，4.11(m，1H)，4.44(d，J＝18.9Hz，1H)，4.53(d，J＝19.0Hz，1H)，5.12(dd，J＝9.8，J＝5.9Hz，1H)，5.27(dd，J＝9.2，J＝5.9Hz，1H)，5.41(d，J＝16.7Hz，1H)，5.53(d，J＝16.7Hz，1H)，7.23(t，J＝7.4Hz，1H)，7.49(m，2H)，7.69(d，J＝8.4Hz，1H)，8.05(s，1H)。Iv.合成4′-O-膦酰氧基甲基依托泊苷 Iva.合成4′-O-膦酰氧基甲基依托泊苷二芐基酯 向磷酸二芐基氯代甲基酯(670mg，2.0mmol)、依托泊苷(300mg，0.51mmol)和四丁基溴化銨(164.4mg，0.51mmol)的四氫呋喃(0.5mL)溶液中加入粉末碳酸鉀(352.4mmg，2.55mmol)。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌35分鐘。然后，將混合物直接用硅膠快速柱色譜進行純化(30∶1二氯甲烷/甲醇)，得到272mg(61％收率)的標題化合物，為一種白色固體(超過95％保留反式立體化學)。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 879。1H NMR(400MHz，CDCl3，δ)1.41(d，J＝5.0Hz，3H)，2.79(brs，1H)，2.86(m，1H)，2.97(br s，1H)，3.30(dd，J＝14.2，J＝5.3Hz，1H)，3.35(m，2H)，3.45(t，J＝8.5，J＝8.0Hz，1H)，3.59(m，1H)，3.66(s，6H)，3.74(m，1H)，4.19(m，1H)，4.20(t，J＝8.5，J＝8.0Hz，1H)，4.42(dd，J＝10.3，J＝9.1Hz，1H)，4.60(d，J＝5.2Hz，1H)，4.64(d，J＝7.6Hz，1H)，4.76(q，J＝5.0Hz，1H)，4.92(d，J＝3.4Hz，1H)，5.03(dd，J＝7.3，J＝4.3Hz，4H)，5.54(dd，J＝11.7，J＝5.1Hz，1H)，5.59(dd，J＝11.3，J＝5.1Hz，1H)，5.99(d，J＝3.5Hz，2H)，6.26(s，2H)，6.51(s，1H)，6.84(s，1H)，7.33(m，10H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)20.21，37.49，41.00，43.78，56.07，66.32，67.87，67.97，69.06，69.14，73.01，73.29，74.47，79.70，92.55，92.62，99.70，101.57，101.72，107.89，109.13，110.55，127.82，127.97，128.15，128.35，128.43，132.40，133.08，135.68，135.78，136.49，147.14，148.73，152.18，174.90。IVb.合成4′-O-膦酰氧基甲基依托泊苷 向4’-O-膦酰氧基甲基依托泊苷二芐基酯(20.5mmg，0.023mmol)的四氫呋喃(2mL)溶液中加入鈀/炭(10％，5mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌10分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑，減壓蒸出四氫呋喃。將形成的殘余物在真空下干燥，得到16mg(100％收率)的標題化合物，為一種白色固體。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 699。1H NMR(400MHz，CDCl3/DMSO-d6，δ)1.29(d，J＝5.0Hz，3H)，2.78(m，1H)，3.21(m，2H)，3.29(t，J＝8.6，J＝7.8Hz，1H)，3.37(dd，J＝14.0，J＝5.3Hz，1H)，3.52(m，2H)，3.62(s，6H)，4.09(m，1H)，4.17(t，J＝8.1Hz，1H)，4.38(dd，J＝8.8，J＝8.7Hz，1H)，4.44(d，J＝7.6Hz，1H)，4.48(d，J＝5.3Hz，1H)，4.66(q，J＝5.0Hz，1H)，4.88(d，J＝3.3Hz，1H)，5.05(brs，7H)，5.40(dd，J＝10.7，J＝7.8Hz，1H)，5.43(dd，J＝10.4，J＝7.5Hz，1H)，5.89(dd，J＝8.8Hz，1H)，6.18(s，2H)，6.41(s，1H)，6.78(s，1H)。IVc.合成4′-O-膦酰氧基甲基依托泊苷二鈉鹽 向4′-O-膦酰氧基甲基依托泊苷二芐基酯(200mg，0.227mmol)的四氫呋喃(10mL)溶液中加入鈀/炭(10％，45 mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌25分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑，將濾液進行減壓蒸發(fā)，將殘余物進行真空干燥。將形成的白色固體溶解于碳酸氫鈉的水溶液中(2.9mL，0.136M，0.394mmol)。將形成的多相混合物與活性炭混合，攪拌幾分鐘，然后通過40μm的過濾單元過濾。將均勻的無色濾液進行冷凍干燥，得到140mg(96％收率)的標題化合物，為一種白色固體(超過95％保留反式立體化學)。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 743，[M-Na+2H]+，m/z 721，[M-2Na+3H]+，m/z 699。1H NMR(400MHz，D2O，δ)1.37(d，J＝5.1Hz，3H)，3.10(m，1H)，3.37(dd，J＝8.9，J＝8.0Hz，1H)，3.48(m，2H)，3.65(m，3H)，3.75(s，6H)，4.29(dd，J＝10.4，J＝4.5Hz，1H)，4.41(t，J＝8.3，J＝8.0Hz，1H)，4.49(dd，J＝10.5，J＝8.9Hz，1H)，4.68(d，J＝5.7Hz，1H)，4.74(d，J＝7.8Hz，1H)，4.91(q，J＝5.0Hz，1H)，5.13(d，J＝3.0Hz，1H)，5.26(2xd，J＝5.3，J＝3.3Hz，1H)，5.28(2xd，J＝5.3，J＝3.3Hz，1H)，5.98(d，J＝10.5Hz，2H)，6.40(s，2H)，6.58(s，1H)，7.00(s，1H)。13C NMR(125MHz，D23O，δ)22.13，40.74，43.56，46.11，59.12，68.70，70.41，72.40，75.46，75.95，76.95，82.46，94.87，102.88，103.66，104.62，111.14，112.82，113.23，130.73，135.45，135.74，140.22，149.56，151.43，154.94，166.36，181.61。31P NMR(200MHz，D2O，δ)s(2.19)。V.合成膦酰氧基甲基化試劑Va.合成磷酸二芐基氯代甲基酯 在20分鐘內，分幾次向回流中的氯碘代甲烷(25g，97％，0.14mol)的甲苯(HPLC-級，30mL)溶液中加入磷酸二芐基酯銀鹽(7.0g，0.018mol)。繼續(xù)回流1小時。在將反應混合物冷卻至室溫后，過濾，減壓蒸出溶劑。將油狀殘余物進行硅膠快速柱色譜純化(7∶3己烷/乙酸乙酯)，得到3.63g(62％收率)的標題化合物，為一種黃色油。FABMS+(NBA)[MH]+，m/z 327。1H NMR(300MHZ，CDCl3，δ)5.10(d，J＝8.0Hz，4H)，5.63(d，J＝15.7Hz，2H)，7.36(s，10H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)69.68，69.75，73.33，73.42，127.93，128.51，128.63，135.07。Vb.合成磷酸二芐基(對甲苯砜甲基)酯 在氬氣氛下，向攪拌中的對甲苯磺酸銀(600mg，2.15mmol)的無水乙腈(3mL)溶液中加入磷酸二芐基氯代甲基酯(150mmg，0.46mmol)。在將反應混合物于室溫下攪拌21小時后，除去溶劑，將殘余物用乙醚(3×3mL)萃取。合并后的萃取液過濾，蒸發(fā)，真空下干燥，得到210mg(99％收率)的標題化合物，為一種白色固體。EIMS[MHJ+，m/z 463.1H NMR(300MHz，CDCl3，δ)2.37(s，3H)，4.91(2xd，J＝7.9Hz，4H)，5.6 1(d，J＝14.2Hz，2H)，7.29(m，12H)，7.78(d，J＝8.4Hz，2H)。
對于上述反應Vb來說，也可以上述Ic解釋，試劑
可通常由下式表示 其中，所有的符號均與以上的定義相同。Vc.合成甲醛雙(二芐氧基膦?；?縮乙醛 向二碘代甲烷(4mL，50mmol)的無水甲苯(15mL)溶液中加入磷酸二芐基酯銀鹽(3.0g，7.8mmol)。將形成的混合物在氬氣氛下回流15分鐘。然后，將混合物冷卻至室溫，過濾。再在真空下蒸出溶劑。將油狀殘余物進行硅膠快速柱色譜純化(1∶1己烷/乙酸乙酯和然后乙酸乙酯)，得到一種淡黃色油，將其再結晶，得到1.97g(90％收率)的標題化合物，為一種白色固體，mp 39～42℃。CIMS(NH3)[MH]+，m/z 569。1H NMR(300MHz，CDCl3，δ)5.03(d，J＝7.9Hz，8H)，5.49(t，J＝14.3Hz，2H)，7.30(m，20H)。13C NMR(75MHz，CDCl3，δ)69.54，69.61，86.48，127.88，128.48，128.55，135.10，135.20。VI-合成O-膦酰氧基甲基環(huán)孢菌素A VIa.合成O-甲基硫甲基環(huán)孢菌素A 向環(huán)孢菌素A的二甲亞砜(250mL)懸浮液中加入乙酸酐(125mL)和乙酸(35mL)。將多相混合物在室溫下劇烈攪拌24小時，倒入冰(800mL)中，再攪拌30分鐘，再用二氯甲烷萃取(4×100mL)。合并后的二氯甲烷萃取液用水(2×100mL)洗滌，用硫酸鎂干燥。減壓除去二氯甲烷，得到一種產物。將該產物進一步經硅膠色譜純化。VIb.合成O-膦酰氧基甲基環(huán)孢菌素A二芐基酯
向攪拌良好的O-甲基硫甲基環(huán)孢菌素A和粉末狀的活化4分子篩(5g)在四氫呋喃(20mL)中的懸浮液中加入N-碘代琥珀酰亞胺(2.00g，95％，8.44mmol)和磷酸二芐基酯(2.20g，7.83mmol)在二氯甲烷(12mL)中的懸浮液。將形成的混合物在室溫下劇烈攪拌30分鐘，過濾，用乙酸乙酯(300mL)稀釋。將溶液用硫代硫酸鈉水溶液(10％，2×15mL)、水(2×20mL)、鹽水(50mL)洗滌，用硫酸鎂干燥。將混合物過濾，減壓蒸出溶劑。將殘余物用硅膠快速柱色譜純化。VIc.合成O-膦酰氧基甲基環(huán)孢菌素A 向O-膦酰氧基甲基環(huán)孢菌素A二芐基酯在四氫呋喃(100mL)和水(5mL)中的溶液中加入鈀/炭(10％，500mg)。將混合物在氫氣(1atm)下攪拌35分鐘。經硅藻土過濾除去催化劑。然后，硅藻土用四氫呋喃(300mL)洗滌，合并后的濾液進行減壓蒸發(fā)。將形成的固體用乙醚(2×20mL)、己烷(50mL)洗滌，真空干燥，然后溶解于熱甲醇(60mL)中。將溶液過渡，減壓濃縮至約10mL體積。在室溫下放置1小時后，將溶液放置于冰箱中過夜。濾出過夜形成的結晶沉淀，真空干燥，得到標題化合物，為一種固體。將濾液濃縮至約1mL體積，并在冰箱中保持1小時，得到另一部分產物。生物學評價本發(fā)明的化合物為新的藥劑；對式I的代表性化合物在體外和體內轉化研究結果進行了評價。在所有這些研究中，前藥均被轉化成藥物活性的母化合物。(1) 丙泊酚前藥在水中的溶解性評價丙泊酚前藥的水溶性大約為500mg/mL，基于飽和水溶液的HPLC分析。(2) 丙泊酚前藥向丙泊酚的體外轉化丙泊酚前藥向丙泊酚的體外轉化采用在pH值為10.4的培養(yǎng)基的甘氨酸緩沖液中的堿性磷酸酶進行。制備25mL的100μg/mL丙泊酚前藥在甘氨酸緩沖液中的溶液。將1mL用作0時間點保存，其余的24mL放置在37℃的水浴中。向24mL的丙泊酚前藥溶液中加入960μL的0.1mg/mL堿性磷酸酶的甘氨酸緩沖溶液，混合，再返回水浴中。在下述時間取出1.5mL的樣品5、10、20、30、40、60、90、120、180、240、300和360分鐘。立即向每一樣品中加入10μL的冰醋酸停止酶反應。通過HPLC對樣品進行分析，以確定丙泊酚前藥與丙泊酚的濃度。體外轉化的結果示于圖1中。這些結果表明，丙泊酚前藥是一種堿性磷酸酶的酶作用物。(3)在大鼠中進行的總毒性評價制備一種用于體內注射的丙泊酚前藥，其在0.9％氯化鈉注射液，USP中的濃度為68mg/mL。該濃度相當于36mg/mL的丙泊酚。在給藥前用0.22μm的尼龍膜對丙泊酚前藥溶液進行過濾。用兩支體重為820和650g的雄性Harlen Sprague-Dawley大鼠進行丙泊酚前藥的評價。使820g的大鼠經尾靜脈接受200μL的丙泊酚前藥體內制劑(相當于9mg/kg丙泊酚)。在大約12分鐘后，從尾靜脈取血樣(采用肝素化的注射器)。而650g的大鼠在接受丙泊酚前藥制劑前先接受一定劑量的溫和鎮(zhèn)靜劑Metaphane。給650g的大鼠在尾靜脈處注射125μL的丙泊酚前藥制劑，并在大約6分鐘后從尾靜脈取血樣(采用肝素化的注射器)。將來自兩支大鼠的血樣用HPLC進行丙泊酚分析。
結果，在兩支大鼠的丙泊酚前藥注射結果是類似的。兩支大鼠均在幾分鐘后不穩(wěn)定，但，并未失去其正常的反射?；谀恳曈^察，大鼠完全從丙泊酚前藥注射中恢復。經HPLC分析證實來自兩支大鼠取得的血樣均存在丙泊酚。由于丙泊酚前藥的作用，大鼠并未顯示出不適的跡象。(4)狗的藥物動力學評價對涉及Diprivan或丙泊酚前藥的藥動學研究在狗體中進行，并在兩次研究之間具有充分的洗出時間。通過熒光檢測由HPLC測量血濃度，并同時用兩個鉛腦電圖描記術(EEG)來檢測大腦的活性。在給狗服藥前，將狗遮眼，將棉花放置在狗耳內，將狗腿捆綁住以減少活動和其它外部刺激，從而使丙泊酚對狗的腦波活性的作用最有效地檢測出來。
采用重13kg的長耳短腿小獵犬進行丙泊酚血濃度隨時間變化的評價。在注射之前取得大約8mL的血用作標準曲線制備和0時血液水平。經頭側靜脈注射，使狗接受一定量的Diprivan或丙泊酚前藥制劑，相當于7mg/kg的丙泊酚。
在注射后1、3、5、10、15、20和30分鐘后，經頭側(與制劑注射位置不同的靜脈)、頸靜脈或隱靜脈(肝素化注射器)取得2mL血樣。還在60、90、120、180、240、300、360、480和1440分鐘后取血樣。在從狗身上取得血樣后立即對血樣提取以除去丙泊酚。在接受Diprivan或丙泊酚前藥制劑前使狗禁食大約20小時。在取樣120分鐘后，允許狗飲水。在獲得血樣480分鐘后，給狗進食。狗的常規(guī)飲食為Hills’Science Diet Maintenance。使狗每天以亮/暗12小時的循環(huán)接受光線。
通過熒光檢測由HPLC測量丙泊酚在血樣中的濃度。結果如表2所示。所采用的血液提取法和HPLC法均基于Plummer的工作報告(1987)，只有很少的修改。樣品制備和實驗過程如下
向1mL的血樣中加入10μL的百里酚內標物(20μg/mL)和1mL的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.2)，在每次加入后進行渦流混合。然后加入5mL的環(huán)己烷，使樣品在75rpm下混合20-30分鐘。通過在約2000rpm下進行1分鐘的離心，分離出有機層。將大約4.5mL的有機層轉移至包含50μL稀四甲基氫氧化銨(TMAH)溶液(大約為1.8％(v/v))的試管中。在氮氣流下將溶劑蒸發(fā)至干，并用200μL的流動相A進行復配。將樣品在15,000rmp下再離心30秒以除去任何顆粒，將上清液注入HPLC中。標準曲線樣品制備將1mL的初始血液的等分試樣中摻加含量為5、1、0.5、0.1和0.01mg/mL的丙泊酚。這些標準均與樣品一樣進行相同的處理。
HPLC系統(tǒng)由下述Shimadzu部件組成LC-10AT泵、SCL-10A系統(tǒng)控制器、RF353熒光檢測器和SIL-10A自動進樣器。HPLC的參數如下275nm下激發(fā)和在320nm下發(fā)射；流速為1mL/分鐘；注射體積為3-30μL，取決于丙泊酚濃度。HPLC柱為Zorbax RX-C18，15cm×4.6mm內徑，5μm粒徑。流動相A為60∶40(v/v)乙腈∶25mM磷酸鹽、15mM TAAP緩沖液pH7.1.流動相B為80∶10∶10(v/v/v)乙腈∶水∶THF。流動相B用于在采用流動相A洗脫百里酚和丙泊酚后對柱子進行清洗(分別為4.2和7.4分鐘)。
根據目視觀察和EEG圖形，狗顯示出對注射的兩種制劑有麻醉跡象。狗從兩種制劑的麻醉中恢復時間為20-30分鐘。注射丙泊酚前藥導致的丙泊酚血濃度值與注射Diprivan所產生的血濃度值近似。(5)喜樹堿前藥在水中溶解性的評價根據目視觀察和HPLC分析，喜樹堿前藥的水溶性大于50mg/mL。(6)喜樹堿前藥(p-cpt)酶性研究將16μg/mLp-cpt用酸性磷酸酶(0.02單位/mL p-cpt溶液)進行分裂。介質為0.09M的檸檬酸鹽緩沖液，pH4.8，溫度為37℃。p-cpt至喜樹堿的轉化通過HPLC進行檢測。
HPLC參數MP24％磷酸鉀緩沖液，pH4，76％乙腈柱Zorbax RX-C18，15cm×4.6mm內徑，粒徑5μm檢測370nm UV流速1mL/分鐘酸性磷酸酶來自牛前列腺(sigma)。結果如圖3所示。結果表明，喜樹堿前藥是一種磷酸酶的酶作用物。(7)采用大鼠進行的喜樹堿前藥的藥物動力學研究采用喜樹堿前藥和喜樹堿制劑對雄性Sprague-Dawley大鼠給藥以進行藥物動力學研究。被研究的喜樹堿前藥的兩種制劑分別由將前藥溶解于15mM磷酸鹽(pH4.0)得到和將喜樹堿溶解于有機助溶劑中得到。以下是藥物動力學實驗的概述制備一定體積的喜樹堿前藥制劑或喜樹堿制劑，其濃度應使劑量相當于1mg喜樹堿/kg給藥于大鼠。在大鼠的左頸靜脈中采用留置套管給藥于大鼠。經位于大鼠右頸靜脈中的留置套管取得血樣。兩個套管在使用前均用肝素化鹽水沖洗，并在肝素化鹽水存在下進行研究。
在向頸靜脈插入套管之前，用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，并在研究過程中保持用戊巴比妥麻醉。在研究過程中，將大鼠放置在37℃的加熱墊上并切開氣管。在給藥前取大約150μL的血樣，在向大鼠給藥制劑后的1、3、5、10、15、20、45、60和90分鐘后取血樣。
將血樣放置在微量離心管中，并在大約15000rpm下離心20秒。將來自每種血樣的50μL血漿等分液轉移至第二個微量離心管中。向血漿中加入150μL冰冷的乙腈并渦旋振動5秒。然后加入450μL冰冷的磷酸鈉(0.1M，pH7.2)，將微量離心管的內容物渦旋振動5秒鐘，然后在約15000rpm下離心20秒，將上清液轉移至設置在4℃的HPLC自動進樣器中進行分析(50μL注射量)。
HPLC系統(tǒng)由下述Shimadzu部件組成LC-10AT泵、SCL-10A系統(tǒng)控制器、RF353熒光檢測器和SIL-10A自動進樣器(設置在4℃)和CTO-10A柱烘箱(溫度設置在30℃)。HPLC的參數如下370nm下激發(fā)和在435nm下發(fā)射；流速為2mL/分鐘。HPLC柱為Hypersil ODS，15cm×4.5mm內徑，5μm粒徑。流動相為75％25nM的磷酸鈉，pH6.5/25％乙腈(v/v)，還含有25mM的四丁基磷酸二氫銨作為離子-減少劑。
從附圖(圖4)可以看出，前藥提供的喜樹堿血漿濃度與直接注射喜樹堿在有機助溶劑中的溶液所獲得的血漿濃度相當。該附圖提供了接受了前藥的五只大鼠和接受了喜樹堿的六只大鼠的平均值和標準偏差。
權利要求
1.一種下式的化合物和其可藥用鹽 其中，R-O-為排除紫杉醇的含醇或含酚的藥物化合物的殘基，，R1為氫或堿金屬離子或質子化胺或質子化氨基酸，R2為氫或堿金屬離子或質子化胺或質子化氨基酸，和n為1或2的整數。
2.根據權利要求1的化合物，其中，所述的含醇或含酚的化合物選自喜樹堿、喜樹堿類似物、丙泊酚、依托泊苷、維生素E和環(huán)孢菌素A。
3.根據權利要求1的化合物，其中，R1和R2的堿金屬離子彼此獨立地選自鈉、鉀和鋰。
4.一種選自下述的化合物和其可藥用鹽 其中，Z選自氫、堿金屬離子和胺。
5.根據權利要求4的化合物，其中，每一個Z獨立地選自鈉、氨丁三醇、三乙醇胺、三乙胺、精氨酸、賴氨酸、乙醇胺和N-甲基葡糖胺。
6.一種式III的化合物和其可藥用鹽 其中，R-O-為排除紫杉醇的含醇或含酚的藥物化合物的殘基。
7.根據權利要求6的化合物，其中，所述的化合物選自
8.一種式IV的化合物和其可藥用鹽 其中，R-O-為排除紫杉醇的含醇或含酚的藥物化合物的殘基，Y為膦?；Ｗo基，和n為整數1或2。
9.根據權利要求8的化合物，其中，所述的化合物選自 其中，Y為膦酰基保護基。
10.根據權利要求8的化合物，其中，所述的膦酰基保護基選自芐基、叔丁基、烯丙基和其它可接受的磷酸保護基。
11.一種藥物組合物，其包含有效量的權利要求1的化合物和可藥用載體。
12.一種制備權利要求4的化合物的方法，包括從下述化合物之一中除去膦?；Ｗo基 其中，Y為膦?；Ｗo基；和回收產物。
13.一種制備權利要求6的化合物的方法，包括使式R-O-H的化合物和其可藥用鹽與二甲亞砜在乙酸酐和乙酸存在下反應，以及回收產物，其中，R-O-為排除紫杉醇的含醇或含酚的藥物化合物的殘基。
14.一種制備權利要求7的化合物的方法，包括使式III的化合物和其可藥用鹽 其中，R-O-為排除紫杉醇的含醇或含酚的藥物化合物的殘基，與N-碘代琥珀酰亞胺和式HOP(O)(OY)的保護的磷酸反應，其中，Y為膦?；Ｗo基，和回收產物。
15.根據權利要求14的方法，其中，膦?；Ｗo基選自芐基、叔丁基和烯丙基。
16.一種治療方法，包括向需要治療的患者給藥有效量的權利要求11的組合物。
17.根據權利要求16的方法，其中，所述的化合物口服給藥。
18.根據權利要求16的方法，其中，所述的化合物非腸道給藥。
19.式I、III和IV的化合物作為藥物的用途。
20.根據權利要求19的用途，其中，藥物產生麻醉作用。
21.根據權利要求19的用途，其中，藥物具有抗腫瘤活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂族或芳族含位阻羥基藥物的水溶性前藥。
文檔編號A61K31/675GK1357000SQ99811440
公開日2002年7月3日 申請日期1999年8月6日 優(yōu)先權日1998年8月7日
發(fā)明者V·J·斯特拉, J·J·奇格蒙特, I·G·喬治, M·S·薩法迪 申請人:堪薩斯州立大學