專利名稱：抗血栓形成化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的抗血栓形成化合物、其制備方法、含有所述化合物作為活性組分的藥物組合物、以及所述化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
絲氨酸蛋白酶是在血凝級聯(lián)中起重要作用的酶。這組蛋白酶的成員有例如凝血酶、胰蛋白酶、Ⅶa因子、Ⅸa因子、Ⅹa因子、Ⅺa因子、Ⅻa因子、和C蛋白。
凝血酶是血凝級聯(lián)中最后的絲氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是將血纖維蛋白原裂解以生成血纖維蛋白單體，血纖維蛋白單體會交聯(lián)以形成不溶性凝膠。此外，凝血酶通過活化該交聯(lián)前期中的Ⅴ和Ⅷ因子來調(diào)節(jié)其自身生成。凝血酶在細胞水平上也具有重要作用，在細胞水平上凝血酶作用于特異性受體，以引起血小板聚集、內(nèi)皮細胞活化以及成纖維細胞增殖。因此凝血酶在止血和血栓形成中起中樞調(diào)節(jié)作用。因為凝血酶抑制劑可能具有廣泛醫(yī)療應(yīng)用，因此人們在該領(lǐng)域作了大量研究。
Ⅹa因子-另一重要絲氨酸蛋白酶催化凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶。
在絲氨酸蛋白酶合成抑制劑、更具體說是凝血酶合成抑制劑的開發(fā)中，芐脒部分是其中一個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。其模擬它的天然底物的堿性氨基酸Arg和Lys的質(zhì)子化側(cè)鏈。人們已經(jīng)對具有芐脒部分的化合物作了廣泛和反復(fù)研究。在這類凝血酶抑制劑當中，一種非常有效的代表性化合物是氨基酸衍生物Na-(2-萘基磺?；?-甘氨?；?4-脒基苯基丙氨酸哌啶(NAPAP)(Stürzebecher,J.等人，Thromb.Res.29,635-642,1983)。然而，NAPAP的特性對于治療應(yīng)用沒有吸引力例如，該化合物具有低的凝血酶特異性，并且溶解性很差。此后制備了NAPAP的衍生物，例如EP0236163中公開的N-烷基取代衍生物，或EP0558961、Proc.Am.Pept.Symp.,13th(60LXAW)；94；pp.643-5(Stiiber,W.等人，Pept:Chem.,Struct.Biol.,)、Proc.Int.Symp.Controlled Release Bioact.Mater.(PCRMEY,10220178)；94；Vol.21st；pp.712-12(Walter,E.等人)、和EP0513543中公開的糖肽衍生物。然而，雖然與NAPAP相比這些衍生物具有改善的藥理特性，但是所有這些由NAPAP衍生的化合物仍然僅具有直接凝血酶抑制劑活性，并且具有有限的血漿半衰期和快的清除速度(因此僅在很短時間內(nèi)表現(xiàn)出其抗凝血酶活性)。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，式(Ⅰ)化合物或其可藥用鹽或其前藥是有效的多用途抗血栓形成劑 其中R1是苯基、萘基、1,2,3,4-四氫萘基、(異)喹啉基、四氫(異)喹啉基、3,4-二氫-1H-異喹啉基、苯并二氫吡喃基、或樟腦基，所述基團可選擇性地被一個或多個選自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；R2和R3獨立地為H或(1-8C)烷基；R4是(1-8C)烷基或(3-8C)環(huán)烷基；或者R3和R4與它們所連的氮原子形成可選擇性地包含另外的雜原子的非芳香(4-8)元環(huán)，該環(huán)可選擇性地被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；Q是鏈長為10-70個原子的間隔基；Z是包含2-6個單糖單元的帶負電荷的低聚糖殘基，其中的負電荷由帶正電荷的抗衡離子抵消。
本發(fā)明化合物具有抗凝血酶活性，但是本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)可選擇性地被修飾，因此本發(fā)明化合物具有可調(diào)節(jié)的、由非介導(dǎo)的直接抗凝血酶(Ⅱa因子)活性和抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)介導(dǎo)的抗Ⅹa活性組成的混合特性。因此本發(fā)明化合物是雙重抑制劑。本發(fā)明化合物具有長的血漿半衰期，因此與NAPAP或其上述衍生物相比，本發(fā)明化合物具有延長的抗凝血酶活性。此外，本發(fā)明化合物可避免血小板因子4(PF4)的抵消作用。低毒性也是本發(fā)明化合物的優(yōu)點。
EP 0649854中公開了另一種雙重抑制劑。與本發(fā)明化合物不同，除了表現(xiàn)出AT-Ⅲ介導(dǎo)的抗Ⅹa活性之外，在該文獻中公開的結(jié)合糖化合物還表現(xiàn)出間接的、AT-Ⅲ介導(dǎo)的抗凝血酶活性。
本發(fā)明化合物可用于治療和預(yù)防凝血酶介導(dǎo)的以及與凝血酶有關(guān)的疾病。包括其中凝結(jié)級聯(lián)被激活的多種血栓形成和前血栓形成病癥，例如但不限于深度靜脈血栓形成、肺栓塞、血栓靜脈炎、血栓形成或栓塞所致的動脈閉塞、血管成形術(shù)或血栓溶解期間或之后的動脈再閉塞、動脈損傷或侵襲性心臟操作后的再狹窄、手術(shù)后靜脈血栓形成或栓塞、急性或慢性動脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥和癌轉(zhuǎn)移、和神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明化合物還可在體外血循環(huán)、例如透析和手術(shù)所需的體外循環(huán)中用作抗凝血劑。
本發(fā)明化合物的混合特性可通過改變低聚糖殘基Z的性質(zhì)和間隔基Q的長度來調(diào)節(jié)。因此可獲得一定范圍的性質(zhì)。
在本發(fā)明化合物中，具有2-6個糖單元、帶有負電荷的所有低聚糖殘基都是適用的。合適的本發(fā)明化合物是其中Z是硫酸化或磷酸化低聚糖殘基的化合物。低聚糖殘基Z優(yōu)選衍生自本身具有AT-Ⅲ介導(dǎo)的抗Ⅹa活性的低聚糖，例如在EP 0454220和EP 0529715中公開的糖。特別優(yōu)選的低聚糖殘基是五聚糖殘基。Z最優(yōu)選具有式(Ⅱ)所示結(jié)構(gòu) 其中R5獨立地為OSO3-或(1-8C)烷氧基。
其它優(yōu)選的本發(fā)明化合物是其中R1是苯基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基或萘基的式Ⅰ化合物。在優(yōu)選的化合物中，NR3R4代表哌啶基。R2優(yōu)選為H。
對于本發(fā)明化合物的抗血栓形成活性來說，間隔基的化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要性不大或不重要，然而，其不能是完全的剛性結(jié)構(gòu)。高柔順性間隔基比其它基團更合適。
此外，出于合成方面的原因，某些間隔基比其它間隔基更合適。
易于使用的合適的間隔基具有例如式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)-[(CH2)2O]m-[(CH2)n-NR3-C(O)]p-W-(CH2)s-(Ⅲ)其中W是-[1,4-亞苯基-NR3-C(O)]q-(CH2)r-S-或-(CH2)t-S-(CH2)u-[O(CH2)2]v-O-(CH2)w-C(O)-NR3-；且R3獨立地為H或(1-8C)烷基；m=1-12；n=1-8；p=0-4；q=0或1；r=1-8；s=1-8；t=1-8；u=1-8；v=1-12；w=1-8；總的原子數(shù)是10-70；-[(CH2)2O]m-部分是末端，Q通過該部分連接在Z上。優(yōu)選的間隔基如下-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-CH2-；-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-(CH2)2-[O(CH2)2]3-O-CH2-C(O)-NH-(CH2)4-；和-[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH-C(O)-1,4-亞苯基-NH-C(O)-CH2-S-CH2-。
在描述式(Ⅰ)化合物時使用下述定義。
術(shù)語(1-8C)烷基表示具有1-8個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基和辛基。甲基和乙基是優(yōu)選的烷基。
術(shù)語(1-8C)烷氧基表示具有1-8個碳原子的烷氧基，其中的烷基部分具有如上所述的含義。甲氧基是優(yōu)選的烷氧基。
術(shù)語(3-8C)環(huán)烷基表示具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，它們是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基。環(huán)戊基和環(huán)己基是優(yōu)選的環(huán)烷基。
間隔基的長度是指間隔基的原子數(shù)目，所述原子數(shù)目是沿著Z和該分子的肽部分之間的最短鏈計數(shù)的，不包括連接到間隔基上的低聚糖Z的氧原子。
術(shù)語“前藥”是指其中脒基部分的氨基被保護、例如被羥基或(1-6C)烷氧基羰基保護的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物是這樣制得的通過本領(lǐng)域的公知方法用半胱氨酸或賴氨酸將NAPAP(或NAPAP類似物)在甘氨酸位點上衍化，然后將所得化合物(a)偶聯(lián)到低聚糖-間隔基殘基上，或者(b)偶聯(lián)到間隔基上，然后用硫醇衍化，之后再偶聯(lián)到低聚糖殘基上。可使用任意合適的低聚糖，例如文獻中記載的低聚糖(例如EP 0454220和EP 0529715中記載的低聚糖，但是并不限于這些來源)，或市售低聚糖?？赏ㄟ^例如Buijsman,R.等人描述的方法(Abstracts of papers,9thEuropean Carbohydrate Symposium Utrecht 1997,Abstract A150)在適當時刻將低聚糖磷酸化?？衫缡褂迷贓P0649854中描述的方法將間隔基偶聯(lián)到低聚糖上。
上述制備本發(fā)明化合物的方法中的步驟-肽偶聯(lián)可通過用于偶聯(lián)或縮合肽片段的本領(lǐng)域公知方法來進行，例如疊氮化物方法、混合酐方法、活化酯方法，或優(yōu)選地碳化二亞胺方法，尤其是還加入催化和外消旋抑制化合物例如N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基苯并三唑的方法。The Peptides,Analysis,Synthesis,Biology,Vol3,E.Gross和J.Meienhofer,eds(Academic Press,New York,1981)。
在合成期間可用N-保護基將化合物中的胺官能團保護，所述N-保護基表示通常用來在肽化學(xué)中保護α-氨基的基團，例如叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Z)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或鄰苯二甲?；?Phth)。根據(jù)保護基的性質(zhì)，可通過不同方法除去保護基。通常在酸性條件下、在清除劑存在下進行脫保護。上述The Peptides,Analysis,Synthesis,Biology,Vol 3中記載了氨基保護基及其除去方法的綜述。
可以以游離堿形式存在的本發(fā)明化合物可以以可藥用鹽的形式從反應(yīng)混合物中分離出來。所述可藥用鹽可通過用有機酸或無機酸處理式(Ⅰ)游離堿來制得，所述酸有例如HCl、HBr、HI、H2SO4、H3PO4、乙酸、丙酸、乙醇酸、馬來酸、丙二酸、甲磺酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、抗壞血酸等。
本發(fā)明化合物具有手性碳原子，因此可以以純對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體混合物、含有非對映異構(gòu)體的混合物的形式獲得。獲得純對映異構(gòu)體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，例如將用旋光性酸和外消旋混合物獲得的鹽結(jié)晶，或者使用手性柱的色譜法。對于非對映異構(gòu)體，可使用正相或反相柱。
本發(fā)明化合物可腸內(nèi)給藥或非胃腸道給藥。本發(fā)明化合物和組合物的準確劑量和使用方案必然取決于對其施用藥物的具體個體的需要、疾病嚴重程度、或臨床醫(yī)師的需要和判斷。非胃腸道給藥需要的劑量通常比更依賴于吸收的其它給藥方法所需要的劑量低。然而，對于人，日劑量優(yōu)選為0.001-100mg/kg體重、更優(yōu)選為0.01-10mg/kg體重。
用本發(fā)明化合物制備的藥物也可在急性抗凝血治療中用作佐藥。在這種情況下，將該藥物與用于治療這種病癥的其它化合物一起給藥。
與可藥用輔料、例如在標準參考書-Gennaro等人的Remington′sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company,1990，尤其參見第8部分藥物制劑及其制備)中記載的藥物輔料混合的本發(fā)明化合物可壓制成固體劑量單位，例如丸劑、片劑，或可加工成膠囊或栓劑。利用可藥用液體，本發(fā)明化合物還可以以溶液劑、懸浮劑、乳劑的形式使用，例如用作注射劑、或噴霧劑如鼻內(nèi)噴霧劑。
為了制備劑量單位例如片劑，可考慮使用常規(guī)添加劑例如填充劑、著色劑、聚合粘合劑等。通?？墒褂貌挥绊懟钚曰衔锕δ艿乃锌伤幱锰砑觿??？膳c本發(fā)明組合物一起給藥的合適載體包括以適當量使用的乳糖、淀粉、纖維素衍生物等、或它們的混合物。
通過下述實施例進一步舉例說明本發(fā)明。實施例所用縮寫DMAP=N,N-二甲基氨基吡啶TEA=三乙胺Z=芐氧基羰基Ac=乙?；鵐MTr=一甲氧基三苯甲游基Bn=芐基DCHA=二環(huán)己基銨EDCI=1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽HOBt=1-羥基苯并三唑DiPEA=二異丙基乙胺Pyr=吡啶基TEG=四甘醇HEG=六甘醇APA=脒基苯基丙氨酸Cys=半胱氨酸化合物編號是指在結(jié)構(gòu)式圖表中的化合物。4-O-(4-O-(2,3,4,6-四-)-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙?；?α/β-D-吡喃葡萄糖基三氯亞氨逐乙酸酯(4)在攪拌下，向麥芽三糖(1)(2.0g,4.0mmol)的吡啶(100mL)溶液中加入乙酸酐(6.2mL,65mmol)和催化量的DMAP(0.79g,6.5mmol)。5小時后，將該反應(yīng)混合物倒入碳酸氫鈉水溶液(1M,250mL)中，用乙酸乙酯(200mL)萃取3次。合并有機層，用硫酸鎂干燥并真空濃縮。通過柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯，1/1-0/1,v/v)將產(chǎn)物純化，獲得了(2)，為白色泡沫狀物(產(chǎn)率為91％,3.5g)。通過用0.1M乙酸肼的二甲基甲酰胺溶液(34mL,3.4mmol)將2(3.0g,3.1mmol)處理1小時，來實現(xiàn)端基異構(gòu)脫乙?；?。將該反應(yīng)混合物真空濃縮，然后用乙酸乙酯(50mL)稀釋，用碳酸氫鈉溶液(1M,3×25mL)洗滌，干燥(硫酸鎂)并濃縮。通過硅膠柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯，3/2-1/0,v/v)將產(chǎn)物純化，獲得了(3)(產(chǎn)率為92％,2.7g)。將化合物3(2.7g,3.1mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，加入三氯乙腈(1.7mL)和催化量的碳酸銫(0.2g,0.62mmol)。1小時后，將該反應(yīng)混合物過濾，將濾液減壓濃縮。通過柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯/TEA,50/49/1-0/99/1,v/v/v)將粗產(chǎn)物4純化，獲得了純4，為白色泡沫狀物(1.9g,91％)。N-芐氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(2,3,4,6-四-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖(6)在氬氣流下、在活化分子篩4(250mg)存在下，將供體4(0.69g,0.76mmol)和受體5(0.31g,0.76mmol)在二氯甲烷(1.5mL)中的溶液攪拌1小時。將該溶液冷卻至-20℃，向該反應(yīng)混合物中滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(15μL)在二氯甲烷(0.6mL)中的溶液。10分鐘后，TLC分析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)表明存在一個產(chǎn)物。將碳酸氫鈉固體(0.3g)加到該反應(yīng)混合物中，攪拌10分鐘，然后過濾。將濾液用二氯甲烷(50mL)稀釋，然后用碳酸氫鈉水溶液(1M,2×25ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)，并真空濃縮。通過硅膠色譜法(0-4％甲醇的乙酸乙酯溶液)將殘余物純化，獲得了純6(0.57g，產(chǎn)率為56％)。N-芐氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖(7)用叔丁鉀(43mg,10mg/mmol Ac)的甲醇(15mL)溶液處理化合物6(0.57g,0.43mmol)。1小時后，TLC分析(乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水，5/7/4/1.6,v/v/v/v)表明6完全轉(zhuǎn)化成了7。用Dowex50WX4-H+樹脂將該反應(yīng)混合物中和。通過過濾除去樹脂，將濾液減壓濃縮，獲得了7(0.37g，產(chǎn)率為95％)，無需進一步純化直接使用。N-芐氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基-2,3,4,6-四(磷酸二芐酯))-α-D-吡喃葡萄糖基-2,3,6-三(磷酸二芐酯))-β-D-吡喃葡萄糖2,3,6-三(磷酸二芐酯)(9)將1H-四唑(54mg,0.77mmol)的乙腈(1mL)溶液加到7(86mg,95μmol)和8(450mg,1.4mmol)在乙腈/二噁烷(2/1,v/v,2ml)內(nèi)的混合物中。在20℃攪拌1小時后，用冰浴將該反應(yīng)混合物冷卻，加入叔丁基過氧化氫(0.75mL)。繼續(xù)攪拌45分鐘，TLC分析表明存在一個主要產(chǎn)物。通過硅膠柱色譜法(100/0-95/5，二氯甲烷/甲醇，v/v)純化，獲得了純9(311mg，產(chǎn)率為92％)。1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基2,3,4,6-四磷酸酯)-α-D-吡喃葡萄糖基2,3,6-三磷酸酯)-β-D-吡喃葡萄糖2,3,6-三磷酸酯)(10)將化合物9(311mg,87μmol)溶于含有少量乙酸的叔丁醇/水(6/1,v/v,20mL)中。在連續(xù)氫氣流下、在10％Pd/C(100mg)存在下，將該溶液攪拌。3小時后，通過過濾除去Pd/C催化劑，將濾液真空濃縮。進行Dowex50WX4-Na+離子交換，獲得了10(179mg，產(chǎn)率為98％)。N-2-萘磺?；?S-4-一甲氧基三苯甲游基-(L)-半胱氨酸(12)在攪拌下，向市售S-4-一甲氧基三苯甲游基-(L)-半胱氨酸(11)(0.34g,1mmol)、二噁烷(5mL)和10％碳酸鈉水溶液(5mL)的混合物中加入2-萘磺酰氯(0.25g,1.1mmol)。攪拌1小時后，加入5％檸檬酸水溶液(50mL)將該反應(yīng)混合物酸化，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。合并有機層，干燥(硫酸鎂)并減壓濃縮。通過硅膠色譜法(甲醇/二氯甲烷/三乙胺，0/99/1-4/95/1,v/v/v)將該粗產(chǎn)物純化，獲得了12(產(chǎn)率為76％,0.44g)。N-2-萘磺?；?S-2-吡啶亞磺?；?(L)-半胱氨酸(14)將三氟乙酸和三異丙基甲硅烷在二氯甲烷中的溶液(1/1/18,v/v/v)加到化合物12(0.44g,0.76mmol)中。攪拌20分鐘后，將該混合物倒入水中，并用二氯甲烷(2×50mL)萃取。合并有機層，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。通過與甲苯共蒸發(fā)除去該粗混合物中的微量三氟乙酸。將所得游離硫醇13再溶于異丙醇(2.5mL)，并滴加到AldrithiolTM(1.7g,7.6mmol)在異丙醇/2N乙酸水溶液(1/1,v/v,20ml)中的溶液內(nèi)。1小時后，TLC分析表明已經(jīng)反應(yīng)完全，將該混合物減壓濃縮。通過與甲苯共蒸發(fā)除去該殘余物中的微量乙酸。將該粗產(chǎn)物溶于丙酮(10mL)，向該溶液中加入二環(huán)己基胺(0.3mL)，化合物14以DCHA-鹽的形式從該反應(yīng)混合物中沉淀出來。分離出該沉淀物，溶于乙酸乙酯(50mL)，用5％檸檬酸水溶液(2×30mL)洗滌。將有機層干燥(硫酸鎂)，并減壓濃縮，獲得了純14(產(chǎn)率為55％,0.25g)。N(N(Nα-2-萘磺?；?S-2-吡啶亞磺酰基-(L)-半胱氨?；?-(D,L)-4-脒基苯基丙氨?；?哌啶(16)向N-((D,L)-4-脒基苯基丙氨酰基)哌啶二鹽酸鹽(15)(0.13g,0.39mmol)和半胱氨酸衍生物14(0.16g,0.39mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)內(nèi)的溶液中加入HOBt(58mg,0.42mmol)、EDCI(82mg,0.42mmol)和N-乙基嗎啉(110μL,0.78mmol)。攪拌16小時后，將該混合物用二氯甲烷(20mL)稀釋，然后用水(2×10mL)洗滌。將有機層干燥(硫酸鎂)，并真空濃縮。將該殘余物通過硅膠柱色譜法(首先是10-20％甲醇的二氯甲烷溶液以除去雜質(zhì)，然后是乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水(16/7/1.6/4,v/v/v/v)以釋放產(chǎn)物)純化，然后通過Sephadex LH-20凝膠過濾(洗脫劑甲醇/二氯甲烷，4/1,v/v)進行純化，獲得了均質(zhì)16(70％,0.19g)。麥芽三糖十磷酸酯18與肽16的縮合偶聯(lián)向麥芽三糖十磷酸酯18(21mg,9.8μmol)在0.1M Na2HPO4緩沖液(1.0mL,pH7.5)內(nèi)的溶液中加入N-羥基琥珀酰亞氨基-2-溴乙酸酯的甲醇(1mL)溶液。攪拌2小時后，將該反應(yīng)混合物施加到Sephadex G25柱上，用10％乙腈(在水中)洗脫。合并合適的級分，并在低溫下(25℃)減壓濃縮，獲得了化合物19。將NAPAP類似物16(10mg,15μmol)溶于甲醇(1mL)和0.1M Na2HPO4緩沖液(0.75mL,pH7.0)的混合物中，通過通入氦氣和聲處理來脫氣。向該溶液中加入三丁基膦(4.1μL,16μmol)，將該反應(yīng)混合物在氬氣氛下攪拌。1小時后，HPLC分析(LichrospherRP18-柱)表明2-吡啶亞磺?；淹耆呀猓瑢⒒衔?9在二甲基甲酰胺(0.25mL)和0.1MNa2HPO4緩沖液(0.50mL,pH7.0)中的溶液加到該反應(yīng)混合物中。將該混合物攪拌3小時，然后通過凝膠過濾(Fractogel HW-40，洗脫劑0.15M TEAB)純化該粗混合物。將合適的級分濃縮，并進行Dowex50WX-Na+離子交換，冷凍干燥后獲得了均勻偶聯(lián)物Ⅰ(10.1mg，產(chǎn)率為47％)。通過半制備HPLC柱色譜法(LiChrospherRP18-柱，梯度洗脫17.5％-22.5％CH3CN(在0.05M TEAA水溶液中))將這兩種非對映異構(gòu)體分離，獲得了非對映異構(gòu)體Ⅰ-a(保留時間28.6分鐘)和非對映異構(gòu)體Ⅰ-b(保留時間33.0分鐘)。通過凝膠過濾(SephadexG-25 DNA-級Superfine)將這兩種非對映異構(gòu)體脫鹽，用Dowex 50WX4-Na+離子交換樹脂轉(zhuǎn)化成Na+-型。非對映異構(gòu)體Ⅰ-a:1H NMR(D2O,600MHz,HH-COSY)麥芽三糖(還原末端)4.65(bs,1H,H1),3.85(m,1H,H2),4.35(m,1H,H3),3.76(m,1H,H4)；5.50(bs,1H,H1′),4.18(m,1H,H2′),4.10(m,1H,H4′)；(非還原末端)5.71(bs,1H,H1"),4.09(m,1H,H2"),4.45(m,1H,H3"),4.15(m,1H,H4")；3.95-3.84(H5，麥芽三糖)；間隔基3.65-3.51(m,22H,OCH2HEG),3.35(m,2H,CH2NH2),3.15(s,2H,SCH2(O))；肽8.31(s,1H,HaromNAS),8.06-7.67(m,6H,HaromNAS),7.70,7.17(2xd,4H,HaromAPA,J=7.8 Hz),4.28(m,1H,αCHAPA),3.91(m,1H,αCH Cys),3.30-3.04(m,4H,CH2N哌啶),2.82-2.62(m,3H,βCH2Cys,βCH APA),2.57(m,1H,βCH′APA),1.45-1.25(m,6H,CH2哌啶)；ES-MS:[M-3H]3-724.1,[M-2H]2-1086.7.非對映異構(gòu)體Ⅰ-b:1H NMR(D2O,600MHz,HH-COSY)麥芽三糖(還原末端)3.80(m,1H,H2),4.32(m,1H,H3),3.89(m,1H,H4)；5.49(bs,1H,H1′),4.22(m,1H,H2′),4.11(m,1H,H4′)；(非還原末端)5.70(bs,1H,H1"),4.22(m,1H,H2"),4.52(m,1H,H3"),4.24(m,1H,H4")；3.91-3.84(H5，麥芽三糖)；間隔基3.63-3.52(m,22H,OCH2HEG),3.35(t,2H,CH2NH2),3.17(AB,2H,SCH2(O))；肽 8.35(s,1H,HaromNAS),8.07-7.65(m,6H,HaromNAS),7.77,7.22(2xd,4H,HaromAPA,J=7.8Hz),4.62(t,1H,αCH APA,JαCH,βCH=7.3Hz),4.05(m,1H,αCH Cys),3.05-3.00(m,4H,CH2N哌啶),2.85-2.67(m,4H,βCH2Cys,βCH2APA),1.88-1.24(m,6H,CH2哌啶)；ES-MS:[M-3H]3-724.0,[M-2H]2-1086.2.N-羥基琥珀酰亞氨基-14-S-2-吡啶亞磺?；?14-巰基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸酯(22)將間隔物20(0.75,2.4mmol)(P.Westerduin等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996,35,3,p331-333)和AldrithiolTM(2.6g,12.1mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，并用正丁基胺(4mL)處理。攪拌2小時后，將該反應(yīng)混合物真空濃縮，再溶于二氯甲烷(50mL)，用5％檸檬酸水溶液(2×50mL)洗滌。將有機層干燥，并減壓濃縮。通過硅膠柱色譜法(甲醇/乙酸/二氯甲烷，0/1/99-6/1/93,v/v/v)將殘余物純化，獲得了純21(0.80g，產(chǎn)率為88％)。將化合物21(0.80g,2.1mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，將N-羥基琥珀酰亞胺(0.26g,2.3mmol)和EDCI(0.45mg,2.3mmol)加到該溶液中。1小時后，將該反應(yīng)混合物用二氯甲烷(50mL)稀釋，用冰水(20mL)洗滌3次，干燥(硫酸鎂)并濃縮，獲得了22(0.98g，產(chǎn)率為98％)，無需純化直接使用。Nε-叔丁氧基羰基-Nα-苯磺?；?(L)-賴氨酸(24)使用23和苯磺酰氯作為原料，按照制備12所采用的方法進行制備(0.86g，產(chǎn)率為75％)。Nε-(14-S-2-吡啶亞磺酰基-14-巰基-3,6,9,12-四氧雜十四烷?；?-Nα-苯磺酰基-(L)-賴氨酸(26)用3 N HCl(在乙酸乙酯中)處理化合物24(0.86g,2.2mmol)。15分鐘后，將該反應(yīng)混合物真空濃縮。通過與甲苯共蒸發(fā)除去殘余物中的微量酸。將粗產(chǎn)物25溶于二噁烷/水(4/1,v/v,2.5mL)中，向該溶液中加入化合物22(0.98g,2.1mmol)和DiPEA(1.1mL,6.6mmol)。1小時后，將該反應(yīng)混合物用二氯甲烷(100mL)稀釋，用5％檸檬酸水溶液(2×50mL)洗滌。將有機層干燥(硫酸鎂)，并真空濃縮。通過硅膠柱色譜法(0-10％甲醇/乙酸乙酯)將殘余油狀物純化，獲得了均質(zhì)26(0.95g，產(chǎn)率為67％)。N(N(Nε-(14-S-2-吡啶亞磺?；?14-巰基-3,6,9,12-四氧雜十四烷?；?-Nα-苯磺酰基-(L)-賴氨?；?-(D,L)-4-脒基苯基丙氨酰基)哌啶(27)使用26和15作為原料，按照制備16所采用的方法進行制備(87mg，產(chǎn)率為70％)。麥芽三糖十磷酸酯18與肽27的縮合偶聯(lián)(Ⅱ)使用18和27作為原料，按照制備Ⅰ所采用的方法進行制備。通過半制備HPLC(LiChrospherRP18-柱)純化粗產(chǎn)物Ⅱ。然后通過凝膠過濾(Sephadex G-25 DNA-級Superfine)脫鹽，用Dowex 50 WX4-Na+離子交換樹脂轉(zhuǎn)化成Na+-型，冷凍干燥后獲得了純Ⅱ，為白色蓬松固體(8.5mg，按18計算產(chǎn)率為23％。)1H NMR(D2O,600MHz,HH-COSY)麥芽三糖(還原末端)4.67(m,1H,H1),4.07(m,1H,H2),4.40(m,1H,H3),4.06(m,1H,H4)；5.49(bs,1H,H1′),4.24(m,1H,H2′),4.66(m,1H,H3′),4.10(m,1H,H4′)；(非還原末端)5.73(bs,1H,H1"),4.17(m,1H,H2"),4.38(m,1H,H3"),4.22(m,1H,H4")；3.95-3.82(H5，麥芽三糖)；間隔基4.03,4.02(2xs,2H,OCH2C(O)),3.73-3.59(m,36H,OCH2TEG,HEG),3.38(t,2H,CH2NH2),3.27,3.26(2xs,2H,SCH2(O)),2.75(2xt,2H,CH2S)；肽7.81-7.52(m,5H,HaromBS),7.79,7.76,7.42,7.41,(4xd,4H,HaromAPA),4.87,4.66(2xt,1H,αCH APA,JαCH,βCH=7.4Hz),4.07(m,1H,αCH Lys),3.37-3.73(m,8H,εCH2Lys,βCH2APA,CH2N哌啶)，1.96-1.46(m,12H,CH2哌啶，β/γ,δCH2Lys)；ES-MM+3H]3+801.2,[M+2H]2+1200.8.部分保護的五糖30將已知的五糖29(53mg,49μmol)(R.C.Buijsman等人，Chem.Eur.J.1996,2,12,p1572-1577)溶于二甲基甲酰胺(0.25mL)和水(1mL)中，并用N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(18mg,72μmol)和N-乙基嗎啉(18.6mL)處理。攪拌15分鐘后，TLC分析(乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水，5/7/1.6/4,v/v/v/v)表明反應(yīng)已完全，將該反應(yīng)混合物直接置于RP-18柱上，用水/甲醇(90/10-60/40)洗脫。合并適當?shù)募壏郑瑵饪s至小體積，置于在水中的Dowex 50 WX4-H+離子交換柱上。將洗脫液真空濃縮，獲得了純30(54mg，產(chǎn)率為91％)。硫酸化五糖32將化合物30(54mg,45μmol)溶于二甲基甲酰胺(1mL)。加入三乙胺三氧化硫復(fù)合物(0.51g，對于每一羥基是5當量)，將該混合物在氮氣氛下于55℃攪拌16小時。然后將該混合物冷卻至0℃，加入碳酸氫鈉水溶液(對于每當量三乙胺三氧化硫復(fù)合物是5當量)。將該混合物攪拌1小時，濃縮至小體積，并置于Sephadex G-25柱上，用10％乙腈(在水中)洗脫。合并適當?shù)募壏郑瑵饪s至小體積，然后過Dowex 50 WX4(Na+形式)柱，用水洗脫。將洗脫液濃縮，再溶于0.2N鹽酸(1mL)中，在4℃放置16小時。用0.1N氫氧化鈉溶液將該反應(yīng)混合物中和，在Sephadex G-25柱上脫鹽，用10％乙腈(在水中)洗脫。獲得了均質(zhì)的31。將化合物31溶于含有幾滴乙酸的叔丁醇/水(6/1,v/v,20mL)中。在連續(xù)氫氣流下、在10％Pd/C(100mg)存在下，將該溶液攪拌。3小時后，通過過濾除去Pd/C催化劑，將濾液真空濃縮。獲得了純32(60mg，產(chǎn)率為60％)。五糖32與肽16的縮合偶聯(lián)將五糖32(15mg,6.5μmol)溶于0.1M NaH2PO4緩沖液(2mL,pH7.5)，向該溶液中加入sulfo-SIABTM(16mg,33μmol)溶液。在暗處攪拌3小時后，HPLC分析(單Q陰離子交換)表明反應(yīng)已完全，用Superdex 30柱(10％乙腈(在水中))純化粗產(chǎn)物34。合并合適的級分，并在低溫下(25℃)減壓濃縮。向NAPAP類似物16(9mg,14μmol)在甲醇(1mL)和0.1M Na2HPO4緩沖液(0.75mL,pH7.0)的混合物中的溶液內(nèi)(使用前通過通入氦氣和聲處理來脫氣)加入三丁基膦(3.9μL,15μmol)。在氬氣氛下攪拌1小時后，HPLC分析(LichrospherRP18-柱)表明2-吡啶亞磺?；淹耆呀?。將衍生的五糖34在二甲基甲酰胺(0.25mL)和0.1M Na2HPO4緩沖液(0.50mL,pH7.0)中的溶液加到該反應(yīng)混合物中，并將該混合物攪拌3小時。將該粗產(chǎn)物置于Sephadex G-50柱上，用10％乙腈(在水中)洗脫。合并合適的級分，濃縮至小體積，用Superdex 30柱脫鹽，用10％甲醇(在水中)洗脫。濃縮并冷凍干燥，獲得了偶聯(lián)物Ⅲ，為白色固體(9mg，產(chǎn)率為52％)。1H NMR(D2O,600MHz,HH-COSY):δ3.60,3.53,3.43(3xs,9H,CH3OE,G,H)；環(huán)D:5.53(m,1H,H1),4.15(m,1H,H2),4.58(m,1H,H3),3.56(m,1H,H4),3.92(m,1H,H5),4.26,4.13(2xm,2H,H6,H6′)；環(huán)E:4.70(d,1H,H1,J1,2=8.1Hz,),4.21(m,1H,H2),3.62(m,1H,H3),3.92(m,1H,H4),3.74(m,1H,H5)；環(huán)F:5.39(d,1H,H1,J1,2=3.8Hz),4.22(m,1H,H2),4.56(m,1H,H3),3.83(t,1H,H4,J3,4=J4,5=9.8Hz),4.12(m,1H,H5)；環(huán)G:5.15(bs,1H,H1),4.35(m,1H,H2),3.76(m,1H,H3),4.21(m,1H,H4),4.80(m,1H,H5)；環(huán)H:5.10(d,1H,H1,J1,2=3.6Hz),4.31(m,1H,H2),4.54(m,1H,H3),4.21(m,1H,H4)；間隔基7.51,7.53,7.13,712(4xd,4H,HaromSIAB),3.73(m,2H,CH2CH2NH2),3.66(m,12H,OCH2TEG),3.31(m,2H,CH2NH2)；肽8.27,8.22(2xs,1H,HaromNAS),7.98-7.60(m,6H,HaromNAS),7.71,7.64,7.46,7.44(4xd,4H,HaromAPA),4.60,4.45(2xt,1H,αCH APA,JαCH,βCH=6.6Hz),4.00,3.97(2xm,1H,αCH Cys),3.10-2.85(m,4H,CH2N哌啶),2.82-2.70(m,3H,βCH2Cys,βCH APA),2.61(m,1H,βCH′APA),1.55-1.15(m,6H,CH2哌啶)；ES-MS:[M-H]-2680.6
使用類似方法，制得了下述化合物 通過下述測試方法測定本發(fā)明化合物的生物活性。Ⅰ．抗凝血酶分析凝血酶(Ⅱa因子)是血凝級聯(lián)中的因子。
通過分光光度法測定由凝血酶導(dǎo)致的產(chǎn)色底物s-2238水解的速率來評價本發(fā)明化合物的抗凝血酶活性。使用在緩沖系統(tǒng)中進行的抗凝血酶活性分析來評價測試化合物的IC50值。測試介質(zhì)氨丁三醇-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)緩沖液參照化合物12581(Kabi)載體TNP緩沖液可用二甲亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促進溶解，這些溶劑在最終的反應(yīng)混合物中高達2.5％的濃度下沒有不利作用。技術(shù) 試劑*1．氨丁三醇-NaCl(TN)緩沖液該緩沖液組分氨丁三醇(Tris) 6.057g(50mmol)NaCl5.844g(100mmol)水至1升在37℃用HCl(10mmol/升)將該溶液的pH調(diào)節(jié)至7.4。2．TNP緩沖液將聚乙二醇6000溶于該TN緩沖液，使其濃度為3g/升。3．S-2238溶液將一瓶S-2238(25mg；Kabi Diagnostica,Sweden)溶于20mlTN緩沖液，使其濃度為1.25mg/ml(2mmol/升)。4．凝血酶溶液人凝血酶(16000nKat/瓶；Centraal Laboratorium voorBloedtransfusie,Amsterdam,The Netherlands)溶于TNP緩沖液，獲得了濃度為835nKat/ml的貯備液。
使用前立即用TNP緩沖液將該溶液稀釋至濃度為3.34nKat/ml。*-使用的所有組分都是分析級-對于水溶液使用超純水(Mili-Q質(zhì)量)制備測試化合物和參照化合物溶液將測試化合物和參照化合物溶于Mili-Q水，以獲得濃度為10-2mol/升的貯備液。用載體將每一濃度進行梯度稀釋，以獲得10-3、10-4和10-5mol/升的濃度。在該分析中使用包括貯備液在內(nèi)的稀釋液(在反應(yīng)混合物中的終濃度分別為3×10-3；10-3；3×10-4；10-4；3×10-5；10-5；3×10-6；和10-6mol/升)。操作在室溫用吸量管將0.075ml和0.025ml測試化合物或參照化合物溶液或載體置于微量滴定板的孔中，分別用0.115ml和0.0165mlTNP緩沖液將這些溶液稀釋。向每一孔中加入等分試樣的0.030mlS-2238溶液，在振搖條件下將該微量滴定板在恒溫箱(Amersham)中于37℃預(yù)加熱和預(yù)保溫10分鐘。預(yù)保溫后，通過向每一孔中加入0.030ml凝血酶溶液來使S-2238開始水解。將該微量滴定板在37℃保溫(振搖30秒)。保溫后1分鐘，用動力學(xué)微量滴定板讀數(shù)器(Twinreaderplus,Flow Laboratories)在405nm測定每一樣本的吸光度，在90分鐘期間內(nèi)每2分鐘測定一次。
所有數(shù)據(jù)均用LOTUS-MEASURE收集在IBM個人計算機中。對于所有化合物濃度(以mol/升反應(yīng)混合物表示)以及空白，將反應(yīng)時間(min)對吸收度作圖。反應(yīng)評價對于每一終濃度，由測定圖計算最大吸收度。依據(jù)Hafner等人的方法(Arzneim-Forsch./Drug Res.1977；27(Ⅱ)；1871-3)使用對數(shù)轉(zhuǎn)化分析計算IC50-值(使空白的最大吸收度抑制50％的終濃度，以μmol/升表示)?？鼓富钚?
Ⅱ．抗Ⅹa因子分析活化因子Ⅹ(Ⅹa)是血凝級聯(lián)中的因子。
通過分光光度法測定由Ⅹa導(dǎo)致的產(chǎn)色底物s-2222水解的速率來評價本發(fā)明化合物的抗Ⅹa活性。使用在緩沖系統(tǒng)中進行的抗Ⅹa活性分析來評價測試化合物的IC50值。
下述操作和測試條件一般與上述抗凝血酶分析類似。不同之處如下。參照化合物芐脒載體TNP緩沖液可用二甲亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促進溶解，這些溶劑在最終的反應(yīng)混合物中高達1％(對于DMSO)和2.5％(對于其它溶劑)的濃度下沒有不利作用。技術(shù) 試劑*3．S-2222溶液將一瓶S-2222(15mg；Kabi Diagnostica,Sweden)溶于10ml水，使其濃度為1.5mg/ml(2mmol/升)。4．Ⅹa溶液牛Ⅹa因子人(Bovine Factor Ⅹa Human)(71nKat/瓶；KabiDiagnostica)溶于10ml TNP緩沖液，然后用30ml TNP緩沖液進一步稀釋，使?jié)舛葹?.77nkat/ml。稀釋液必須臨用現(xiàn)配。操作替代S-2238溶液(在抗凝血酶分析中)，在該分析中將S-2222溶液加到每一孔中?？耿鷄因子活性
結(jié)構(gòu)式圖表1
結(jié)構(gòu)式圖表2
結(jié)構(gòu)式圖表3
結(jié)構(gòu)式圖表4
結(jié)構(gòu)式圖表5
權(quán)利要求
1．式(Ⅰ)化合物或其可藥用鹽或其前藥 其中R1是苯基、萘基、1,2,3,4-四氫萘基、(異)喹啉基、四氫(異)喹啉基、3,4-二氫-1H-異喹啉基、苯并二氫吡喃基、或樟腦基，所述基團可選擇性地被一個或多個選自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；R2和R3獨立地為H或(1-8C)烷基；R4是(1-8C)烷基或(3-8C)環(huán)烷基；或者R3和R4與它們所連的氮原子形成可選擇性地包含另外的雜原子的非芳香(4-8)元環(huán)，該環(huán)可選擇性地被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；Q是鏈長為10-70個原子的間隔基；Z是包含2-6個單糖單元的帶負電荷的低聚糖殘基，其中的負電荷由帶正電荷的抗衡離子抵消。
2．權(quán)利要求1的化合物，其中Z衍生自本身具有AT-Ⅲ介導(dǎo)的抗-Ⅹa活性的低聚糖。
3．權(quán)利要求2的化合物，其中Z是五糖殘基。
4．權(quán)利要求3的化合物，其中Z具有式(Ⅱ)所示結(jié)構(gòu) 其中R5獨立地為OSO3-或(1-8C)烷氧基。
5．權(quán)利要求1-4任一項的化合物，其中R1是苯基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基或萘基；R2是H；且NR3R4代表哌啶基。
6．權(quán)利要求1-5任一項的化合物，其中Q具有式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)-[(CH2)2O]m-[(CH2)n-NR3-C(O)]p-W-(CH2)s- (Ⅲ)其中W是-[1,4-亞苯基-NR3-C(O)]q-(CH2)r-S-或-(CH2)t-S-(CH2)u-[O(CH2)2]v-O-(CH2)w-C(O)-NR3-；且R3獨立地為H或(1-8C)烷基；m=1-12；n=1-8；p=0-4；q=0或1；r=1-8；s=1-8；t=1-8；u=1-8；v=1-12；w=1-8；總的原子數(shù)是10-70；且-[(CH2)2O]m-部分是末端，Q通過該部分連接在Z上。
7．權(quán)利要求6的化合物，其中Q選自-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-CH2-；-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-(CH2)2-[O(CH2)2]3-O-CH2-C(O)-NH-(CH2)4-；和-[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH-C(O)-1,4-亞苯基-NH-C(O)-CH2-S-CH2-。
8．包含權(quán)利要求1-7任一項的化合物和可藥用輔料的藥物組合物。
9．用于治療的權(quán)利要求1-7任一項的化合物。
10．權(quán)利要求1-7任一項的化合物在制備用于治療或預(yù)防血栓形成或其它與凝血酶有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(Ⅰ)化合物或其可藥用鹽或其前藥:其中R
文檔編號A61P7/02GK1305494SQ99807399
公開日2001年7月25日 申請日期1999年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月17日
發(fā)明者J·E·M·巴斯坦, C·A·A·范博凱爾, R·C·比杰斯曼, C·M·德里夫－特龍普 申請人:阿克佐諾貝爾公司, 萊頓大學(xué)