專利名稱：調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍涉及一種在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法使用一種以受控方式將抗原暴露于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的可植入裝置。通過(guò)建立一種模仿淋巴節(jié)的組成和作用的人工環(huán)境并對(duì)裝置內(nèi)抗原的生物利用率進(jìn)行調(diào)控，可誘導(dǎo)出針對(duì)某種抗原的強(qiáng)烈應(yīng)答，或能夠?qū)σ延械拿庖邞?yīng)答進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)以及該應(yīng)答的強(qiáng)度取決于抗原、各種免疫細(xì)胞、和包括細(xì)胞因子和趨化因子在內(nèi)的協(xié)同刺激分子之間的復(fù)雜相互作用。免疫細(xì)胞暴露于抗原和協(xié)同刺激性環(huán)境的時(shí)間和程度可進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。體內(nèi)這些不同類型的細(xì)胞和輔助因子可被方便地帶到諸如淋巴節(jié)等淋巴組織的附近。在涉及該過(guò)程的眾多類型的細(xì)胞中，諸如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞可將抗原由外圍傳送至有組織的局部淋巴組織，也可對(duì)抗原進(jìn)行加工，將抗原性肽呈遞給T細(xì)胞，以及分泌協(xié)同刺激分子。因此，如果使抗原以一種局部交錯(cuò)方式抵達(dá)淋巴器官，那么在最佳濃度梯度及含有協(xié)同刺激分子的適當(dāng)環(huán)境下即能夠在引流淋巴節(jié)內(nèi)誘導(dǎo)應(yīng)答。
以這種方式，如通過(guò)疫苗接種，將外來(lái)抗原引入體內(nèi)并不一定會(huì)引起具有預(yù)期強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。用于疫苗接種的抗原可包括減毒并滅活的細(xì)菌和病毒及其組分。疫苗接種的成功在某種程度上取決于抗原的類型和數(shù)量、免疫位點(diǎn)的位置、以及疫苗接種時(shí)免疫系統(tǒng)的狀況。并非所有的抗原都具有同等的免疫原性，而對(duì)弱免疫原性抗原而言，幾乎沒(méi)有可用來(lái)提高免疫有效性的替代方法。盡管有多種技術(shù)可用來(lái)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中加強(qiáng)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，如將抗原與一種更具免疫原性的載體蛋白或生物分子(如鑰孔血藍(lán)素)相結(jié)合，或使用弗氏佐劑或明礬等佐劑，但這些技術(shù)和佐劑不能用于人類疫苗接種。因此，有許多疾病本可通過(guò)在暴露于感染性因子之前進(jìn)行免疫接種的方法加以預(yù)防，或利用治療性疫苗來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)已有致病因子或細(xì)胞，如癌，的有效免疫應(yīng)答，而這些方法卻無(wú)法對(duì)病人使用。
為確定由導(dǎo)致名為無(wú)菌性膿腫的異物所吸引的免疫細(xì)胞群體，而在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了海綿植入研究，并使植入前或植入后的海綿帶有抗原以進(jìn)一步研究被吸引的細(xì)胞群體。Vallera等(1982，癌癥研究42397-404)將含有腫瘤細(xì)胞的海綿植入小鼠以檢測(cè)在16天的周期內(nèi)被吸引的細(xì)胞的構(gòu)成，并發(fā)現(xiàn)在早期時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞毒性細(xì)胞前體，而細(xì)胞毒性在第16天時(shí)達(dá)到峰值。將含有腫瘤細(xì)胞的海綿植入已預(yù)先用腫瘤細(xì)胞免疫的小鼠，則顯示海綿內(nèi)細(xì)胞毒性細(xì)胞的出現(xiàn)更加迅速。在兩種情況下，來(lái)自脾、淋巴節(jié)或腹膜的細(xì)胞均未顯示出細(xì)胞毒性，這表明對(duì)海綿內(nèi)抗原的應(yīng)答具有高度區(qū)域性。
Jenski等(1985，免疫學(xué)方法雜志85153-161)則利用類似條件通過(guò)植入帶有抗原的海綿使亞致死照射后接受同系骨髓移植的小鼠恢復(fù)了細(xì)胞免疫力。免疫力恢復(fù)的確定是通過(guò)測(cè)量海綿內(nèi)恢復(fù)細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性隨時(shí)間的變化。Zangemeister-Wittke等(1989，免疫學(xué)雜志143379-385)是將腫瘤疫苗注射到植入腫瘤免疫小鼠的海綿內(nèi)，并監(jiān)測(cè)海綿部位產(chǎn)生的二次免疫應(yīng)答。在鄰近植入的海綿的淋巴節(jié)內(nèi)未出現(xiàn)明顯的伴發(fā)效應(yīng)。
Chen等(1994，癌癥研究541065-1070)收集了帶有已照射腫瘤細(xì)胞的植入海綿內(nèi)的T細(xì)胞，以說(shuō)明這些細(xì)胞可用來(lái)繼承性轉(zhuǎn)移抗腫瘤活性。在植入攜腫瘤細(xì)胞海綿的動(dòng)物體內(nèi)測(cè)量了由海綿及局部淋巴節(jié)和脾回收的腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的頻率。海綿內(nèi)包含的腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞比淋巴節(jié)高4倍，比脾則高50倍。
盡管為了解決可用的有效疫苗方面的這些缺陷而在進(jìn)行著有意義的研究，但與治療技術(shù)及材料相關(guān)的困難依然存在。因此需要開(kāi)發(fā)出一種可克服目前與流行免疫療法及治療協(xié)議，如預(yù)防性和治療性免疫接種，相關(guān)的難題的技術(shù)或方法，從而需要推進(jìn)有效而又高效的新策略的發(fā)展，用于改善對(duì)健康哺乳動(dòng)物及那些可受益于免疫療法的動(dòng)物實(shí)施免疫法的有效性。此外，對(duì)特定抗原或系列抗原的免疫應(yīng)答加以抑制的能力將為，例如，過(guò)敏反應(yīng)的治療及移植排異的預(yù)防提供優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明將針對(duì)這些目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種方法，該方法通過(guò)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)植入一種含有被裝入帶孔但又不通透的容器的多孔基質(zhì)的裝置來(lái)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答。在裝置的多孔基質(zhì)中存在有所需免疫應(yīng)答所針對(duì)的抗原。該抗原可在植入前即存在于裝置中，也可在植入后引入該裝置；植入時(shí)，裝置的基質(zhì)中存在的抗原能夠以不具生物利用率但植入后可變?yōu)榫哂猩锢寐实男问教峁Ｔ撗b置將吸引免疫系統(tǒng)的細(xì)胞與裝置中的抗原相遇，并且這種相遇將調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。帶孔容器作為擴(kuò)散屏障，可保持裝置內(nèi)由免疫細(xì)胞在裝置中產(chǎn)生的高水平的細(xì)胞因子和其它協(xié)同刺激因子，這些因子與裝置中的其它免疫細(xì)胞接觸時(shí)可提高所需免疫應(yīng)答的建立?？锥纯勺鳛槊庖呒?xì)胞的進(jìn)出通道。所需免疫應(yīng)答可包括細(xì)胞免疫、粘膜免疫和體液免疫，并且對(duì)健康哺乳動(dòng)物和那些可受益于免疫療法的動(dòng)物均適用。
例如，本發(fā)明的實(shí)施是在植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)之前在本發(fā)明的裝置中提供少量的抗原。而優(yōu)選的是在植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)約3天后，將抗原引入裝置的多孔基質(zhì)，或使其中的抗原變?yōu)榫哂猩锢寐?。在哺乳?dòng)物體內(nèi)將誘導(dǎo)出對(duì)該抗原的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。
在另一實(shí)施方案中，該裝置由最終可在體內(nèi)降解的生物可降解材料組成。作為選擇，也可在該裝置實(shí)現(xiàn)其預(yù)期效應(yīng)后將其由體內(nèi)取出。
從其最廣泛的方面來(lái)看，本發(fā)明提供一種用于免疫哺乳動(dòng)物的可植入裝置，該裝置具有以下特征一種被裝入帶孔但又不通透的容器的多孔基質(zhì)，裝置的基質(zhì)中另含有一種在植入前即以生物可用形式存在或可在植入后變?yōu)樯锟捎眯问降目乖?，或在植入后將抗原引入其中。裝置內(nèi)抗原的生物利用率可通過(guò)以延遲釋放劑型等非生物可用形式提供抗原來(lái)加以控制，如通過(guò)微球、微膠囊或脂質(zhì)體等一旦降解即可將抗原釋放入裝置的基質(zhì)中的形式提供。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和裝置可用來(lái)降低或減量調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答，它是通過(guò)在裝置中使用一種高濃度的特定抗原，這可導(dǎo)致對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答的抑制，并抑制對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答的建立。細(xì)胞因子或其它協(xié)同刺激分子也可在裝置中提供。
本發(fā)明所述方法和裝置的更多應(yīng)用包括從裝置中收集免疫細(xì)胞，以用于隨后為進(jìn)行繼承性免疫療法、主動(dòng)免疫法和免疫系統(tǒng)重建而實(shí)施的再次引入體內(nèi)。其它應(yīng)用還包括改善多克隆抗體(免疫血清)及單克隆抗體的制備，如在含有人免疫細(xì)胞的動(dòng)物中制備人單克隆抗體。
由下文將會(huì)明顯看出，利用本文所述發(fā)明，通過(guò)建立一種模仿淋巴節(jié)的組成和作用的人工環(huán)境并對(duì)裝置內(nèi)抗原的生物利用率進(jìn)行調(diào)控，可產(chǎn)生針對(duì)某種抗原的強(qiáng)烈應(yīng)答。在用于特定抗原的不同條件下，則能夠?qū)σ延械拿庖邞?yīng)答進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示在植入哺乳動(dòng)物皮膚后的9天時(shí)間中本發(fā)明所述裝置內(nèi)的細(xì)胞群體的時(shí)程。
圖2顯示在植入不含任何抗原的裝置4天后，裝置中出現(xiàn)的細(xì)胞的數(shù)量及類型分析。
圖3顯示在不引入任何抗原的情況下，植入4、7和10天后裝置中各種細(xì)胞類型群體的變化。
圖4顯示在植入后第3、7和10天將抗原引入裝置對(duì)裝置中CD3-陽(yáng)性細(xì)胞(T細(xì)胞)、CD80-陽(yáng)性細(xì)胞(B細(xì)胞)、以及CD14-陽(yáng)性細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞的代表性亞類的巨噬細(xì)胞)數(shù)量的影響。
圖5顯示在植入不含或含有不同數(shù)量流感抗原的裝置10天后、或利用抗原加佐劑于爪墊中免疫10天后，小鼠脾臟中CD4陽(yáng)性(輔助性T細(xì)胞)和CD8陽(yáng)性(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)細(xì)胞的表達(dá)變化分析。
圖6顯示脾細(xì)胞對(duì)流感抗原的增殖應(yīng)答測(cè)定，這些細(xì)胞來(lái)源于已植入含有抗原并含有或不含佐劑的裝置的小鼠，或來(lái)源于由抗原加佐劑于爪墊中免疫的小鼠。脾臟T細(xì)胞的增殖是根據(jù)干擾素的產(chǎn)生來(lái)進(jìn)行測(cè)量。
圖7顯示分離自小鼠腘淋巴節(jié)的T細(xì)胞的γ-干擾素分泌水平，這些小鼠已由流感抗原加佐劑于爪墊中免疫。
圖8顯示根據(jù)小鼠中γ-干擾素的分泌水平測(cè)量的脾臟T細(xì)胞的增殖應(yīng)答，這些小鼠已利用含有或不含佐劑的本發(fā)明所述裝置以流感抗原免疫。
圖9顯示根據(jù)已利用不含佐劑的本發(fā)明所述裝置以一定劑量范圍的卵清蛋白抗原免疫的小鼠中γ-干擾素的分泌水平測(cè)量的脾臟T細(xì)胞激活水平與通過(guò)爪墊注射相同劑量范圍的抗原和佐劑而免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞增殖應(yīng)答的比較。
圖10同樣顯示根據(jù)已利用不含或含有BCG佐劑的本發(fā)明所述裝置以0、50μg、50ng或50pg卵清蛋白免疫的小鼠中γ-干擾素的分泌水平測(cè)量的脾臟T細(xì)胞增殖應(yīng)答與通過(guò)爪墊注射含Ribi佐劑的相同劑量抗原而免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞增殖應(yīng)答的比較。
圖11顯示已植入含不同劑量HIV gp120肽抗原裝置的動(dòng)物中抗抗原IgG2a特異抗體的應(yīng)答與通過(guò)爪墊注射含佐劑的相同劑量抗原而免疫的動(dòng)物的比較。
圖12顯示除在第一次免疫后三星期時(shí)用初次免疫量的10％以相同途徑進(jìn)行加強(qiáng)外，其余均與圖11所示的實(shí)驗(yàn)相同時(shí)的結(jié)果。植入動(dòng)物體內(nèi)的裝置重新裝載抗原。
圖13為利用含有或不含Ribi或BCG佐劑的本發(fā)明所述裝置免疫的動(dòng)物或利用含相同佐劑的傳統(tǒng)爪墊免疫法免疫的動(dòng)物中產(chǎn)生抗HIV gp120肽的IgG2a特異抗體的比較。
圖14顯示利用不含佐劑的本發(fā)明所述裝置，或利用含Ribi佐劑的傳統(tǒng)爪墊免疫法以不同劑量細(xì)胞色素C抗原免疫的動(dòng)物中IgG2a特異抗體的水平。循環(huán)IgG2a的水平利用連續(xù)稀釋的小鼠血清加以監(jiān)測(cè)。
圖15顯示利用不含佐劑的本發(fā)明所述裝置以0.1μg或10μg流感血凝素蛋白片段(BHA)免疫后的小鼠與利用含Ribi佐劑在爪墊以相同抗原劑量免疫的小鼠所產(chǎn)生的總流感病毒特異IgG的水平比較。
圖16顯示利用γ-干擾素進(jìn)行T細(xì)胞激活測(cè)定的讀出結(jié)果。顯示小鼠利用不含佐劑的本發(fā)明所述裝置以流感抗原進(jìn)行免疫，與利用含佐劑的抗原以爪墊免疫法進(jìn)行免疫，以及將抗原置于植入的多孔聚合基質(zhì)中(但不象本發(fā)明的裝置那樣置于帶孔容器中)進(jìn)行免疫之間的比較。
圖17顯示上述實(shí)驗(yàn)中將來(lái)源于已被流感免疫的小鼠的脾細(xì)胞用無(wú)關(guān)抗原(EBV)進(jìn)行體外攻擊的結(jié)果，表明在利用本發(fā)明所述裝置免疫后產(chǎn)生的應(yīng)答的特異性。
圖18顯示一種蛋白(牛血清白蛋白)僅從海綿擴(kuò)散與從本發(fā)明所述裝置擴(kuò)散的測(cè)試結(jié)果比較。
圖19顯示在插入小鼠4天后由不含或含有流感抗原的本發(fā)明所述裝置提取的細(xì)胞的表型。圖中給出未處理的小鼠的外周血淋巴細(xì)胞中相同細(xì)胞類型的值。
圖20顯示不含抗原的本發(fā)明所述裝置與血清中的刺激性細(xì)胞因子水平的比較。
圖21顯示通過(guò)植入含流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置與通過(guò)流感病毒疫苗加佐劑經(jīng)皮下免疫的動(dòng)物中，由經(jīng)過(guò)流感感染的靶細(xì)胞裂解測(cè)量的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激發(fā)程度比較。
圖22顯示利用含流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置免疫的小鼠與利用該疫苗加佐劑經(jīng)皮下免疫的小鼠中，由流感病毒特異性IgG1的水平測(cè)量的體液應(yīng)答的比較。
圖23顯示利用含流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置免疫的動(dòng)物與利用該疫苗加佐劑經(jīng)皮下免疫的動(dòng)物中產(chǎn)生的流感特異性IgG1的親和力比較。
圖24顯示在利用含流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置免疫后，以及利用該疫苗加佐劑經(jīng)皮下免疫后，用流感病毒攻擊的小鼠的存活率比較。
圖25顯示經(jīng)本發(fā)明所述裝置免疫，以及經(jīng)肌內(nèi)免疫的SCID小鼠產(chǎn)生的流感特異性人IgG抗體的效價(jià)比較。
圖26顯示抗流感抗原的血清抗體(如圖25所述)與通過(guò)抗原的肌內(nèi)給藥產(chǎn)生的抗體的親和力比較。
圖27顯示由本發(fā)明所述裝置中存在大量抗原而導(dǎo)致的免疫應(yīng)答抑制。
圖28說(shuō)明本發(fā)明所述裝置利用質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫方面的應(yīng)用。
圖29-31說(shuō)明本發(fā)明所述裝置在產(chǎn)生對(duì)多糖抗原的免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用。
圖32顯示本發(fā)明所述裝置在誘導(dǎo)對(duì)高度保守從而具有弱免疫原性的抗原，親環(huán)蛋白，的免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用。
圖33顯示本發(fā)明所述裝置在全動(dòng)物誘導(dǎo)針對(duì)寄生蟲(chóng)抗原的免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法使用一種以受控方式將抗原暴露于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的可植入裝置。通過(guò)建立一種模仿淋巴節(jié)的組成和作用的人工環(huán)境并對(duì)該裝置內(nèi)抗原的生物利用率進(jìn)行調(diào)控，可誘導(dǎo)出針對(duì)某種抗原的強(qiáng)烈應(yīng)答，或能夠?qū)σ延械拿庖邞?yīng)答進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。該裝置包含一種多孔基質(zhì)，即一種海綿狀材料，周圍環(huán)繞著或被包含在一種帶孔但又不通透的在此被稱為容器的包層或屏障中。帶孔容器作為擴(kuò)散屏障，可使該裝置內(nèi)保持高濃度的免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)物?？稍诎言撗b置插入皮膚內(nèi)之前或之后將要產(chǎn)生的或要減量調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答所針對(duì)的抗原置于裝置的多孔基質(zhì)內(nèi)。對(duì)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答而言，優(yōu)選的是使裝置基質(zhì)內(nèi)的抗原在裝置插入約3天后變?yōu)榫哂猩锢寐?。這可通過(guò)在該時(shí)間點(diǎn)左右將抗原注射于裝置內(nèi)，或通過(guò)使用一種裝置，其基質(zhì)內(nèi)含有一種可在約3天后變?yōu)榫哂猩锢寐实难舆t釋放形式的抗原，來(lái)加以實(shí)現(xiàn)。對(duì)減量調(diào)節(jié)或抑制針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答而言，根據(jù)具體的抗原，優(yōu)選的是在裝置植入哺乳動(dòng)物之前將具有完全生物利用率的抗原置于其中。在植入裝置后再將抗原置于裝置內(nèi)的情況下，可利用注射器和皮下針頭通過(guò)確定裝置的位置，并將針頭插入該裝置的方法將抗原跨皮膚引入裝置。該裝置可留在體內(nèi)適當(dāng)位置，或可從體內(nèi)取出。它可由最終能夠在體內(nèi)分解的可生物降解材料制成，也可在實(shí)現(xiàn)其預(yù)定效果后被移除。在以后的時(shí)間里可將抗原再次引入裝置?？乖稍谠撗b置內(nèi)單獨(dú)使用，也可與一種佐劑或混合佐劑共同使用。優(yōu)選的是不使用任何佐劑。
本發(fā)明針對(duì)多種形式的免疫療法提供一些改進(jìn)措施，由其可產(chǎn)生或加強(qiáng)針對(duì)某種抗原的預(yù)期免疫應(yīng)答，也可反之將針對(duì)特定抗原的現(xiàn)有免疫應(yīng)答或可能產(chǎn)生的免疫應(yīng)答分別進(jìn)行抑制或阻斷。它們包括接種法，如針對(duì)特定抗原對(duì)健康哺乳動(dòng)物進(jìn)行接種，和治療性接種法。免疫應(yīng)答的阻斷或抑制可在與特定抗原相遇前施加于哺乳動(dòng)物，如未來(lái)的移植受體、預(yù)期要與一種過(guò)敏原接觸的哺乳動(dòng)物，或諸如在自身免疫疾病中易于對(duì)外源或內(nèi)源抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個(gè)體。在暴露于抗原后，對(duì)免疫應(yīng)答的抑制可能是有用的，如對(duì)抗原產(chǎn)生變應(yīng)性或過(guò)敏性應(yīng)答的哺乳動(dòng)物，或遭受移植排異的個(gè)體。本發(fā)明的方法和裝置可針對(duì)各種形式的免疫，如細(xì)胞免疫、體液免疫和粘膜免疫。
該裝置的形狀及其使用方法可模擬哺乳動(dòng)物淋巴組織，尤其是淋巴節(jié)，的結(jié)構(gòu)和功能。在體內(nèi)，引入的外來(lái)抗原被抗原呈遞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞吸收并加工，這些細(xì)胞進(jìn)入淋巴節(jié)后將來(lái)自抗原的免疫原性肽以特定的構(gòu)象與MHC抗原一同呈遞給T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞的特定亞類(CD4-Th2)可協(xié)助B細(xì)胞，并支持高親和力體液免疫的產(chǎn)生。B細(xì)胞能夠與抗原直接相互作用(尤其是復(fù)合抗原或記憶抗原)并分化為漿細(xì)胞，分泌針對(duì)免疫性抗原的特異抗體。抗原呈遞細(xì)胞還分泌可共同參與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的細(xì)胞因子、淋巴因子及趨化因子。裝置中的帶孔容器部件作為一道擴(kuò)散屏障，可維持裝置內(nèi)及裝置中的免疫細(xì)胞附近的抗原水平和諸如細(xì)胞因子等免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)物的水平?？锥纯上拗七@些分子從裝置中擴(kuò)散，但它允許免疫細(xì)胞和其它細(xì)胞自由進(jìn)出該裝置。據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，極少量的抗原已足以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。因此可將裝置中存在的抗原與裝置中的免疫細(xì)胞和協(xié)同刺激分子的相互作用進(jìn)行優(yōu)化，以增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，并通過(guò)產(chǎn)生記憶細(xì)胞群體而賦予長(zhǎng)期免疫。
將本發(fā)明的裝置植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)可導(dǎo)致無(wú)菌性膿腫，其中，免疫系統(tǒng)的某些細(xì)胞被異物所吸引并穿過(guò)有限數(shù)量的孔洞。在起初的幾天里，裝置中積聚的細(xì)胞群體逐漸增加，甚至在不存在任何抗原的情況下也是如此。隨著裝置中的抗原約在第3天變?yōu)榫哂猩锢寐?，以及抗原與基質(zhì)中存在的免疫系統(tǒng)細(xì)胞相遇，抗原則被抗原呈遞細(xì)胞所吸收并進(jìn)行加工，然后呈遞給T淋巴細(xì)胞。由于該裝置經(jīng)由帶孔容器而暴露于外界的程度有限，因而免疫細(xì)胞可以進(jìn)入，但抗原卻保留在裝置內(nèi)并保持高濃度，由裝置中的細(xì)胞群體所分泌的協(xié)同刺激因子同樣保持高濃度，這與淋巴節(jié)內(nèi)的方式相同。當(dāng)T淋巴細(xì)胞致敏并激活后可通過(guò)有限數(shù)量的孔洞離開(kāi)裝置并重新進(jìn)入循環(huán)。因此，該裝置提供一種方法，用于控制抗原暴露于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的程度，并維持細(xì)胞因子和其它產(chǎn)生穩(wěn)固免疫應(yīng)答所需的因子的水平。由下文實(shí)施例將會(huì)發(fā)現(xiàn)，該裝置在產(chǎn)生對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答方面將提供不同級(jí)別的改進(jìn)措施。
從理論角度進(jìn)一步考慮，植入含有大量特定抗原的本發(fā)明所述裝置將會(huì)以相反于上文所述的方式發(fā)揮功能，因?yàn)樗軌驕p量調(diào)節(jié)或抑制現(xiàn)有的或潛在的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。將T細(xì)胞暴露于過(guò)量抗原明顯會(huì)誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞的凋亡，從而除去抗原特異性T細(xì)胞和祖細(xì)胞，而有效抑制針對(duì)抗原的細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答。通過(guò)在抗原刺激中加入細(xì)胞因子(如IL-2、IL-4、-IFN、IL-12)而介導(dǎo)的T細(xì)胞超活化，或在不應(yīng)狀態(tài)下(即在激活狀態(tài)消退之前)將T細(xì)胞暴露于額外抗原刺激都將觸發(fā)細(xì)胞的凋亡，并導(dǎo)致抗原特異性系統(tǒng)中反應(yīng)性克隆(B細(xì)胞或T細(xì)胞)的缺失。熟練技術(shù)人員將了解或能夠很容易地確定應(yīng)選擇的適當(dāng)特定抗原濃度，以利用本發(fā)明所述裝置實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫應(yīng)答的刺激或抑制。特定抗原的免疫原性以及由此決定的其免疫抑制劑量和免疫刺激劑量的范圍可利用該領(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)方法加以確定。
此外，由利用本發(fā)明所述裝置實(shí)現(xiàn)的免疫應(yīng)答的加強(qiáng)要超出可由傳統(tǒng)免疫法實(shí)現(xiàn)的水平，傳統(tǒng)的免疫法通常包括對(duì)動(dòng)物使用佐劑。從理論基礎(chǔ)上來(lái)看，僅將抗原受控暴露于裝置內(nèi)的免疫細(xì)胞和其協(xié)同刺激因子似乎可提供一種用于實(shí)現(xiàn)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的最佳環(huán)境，它要優(yōu)于由利用佐劑實(shí)現(xiàn)的免疫應(yīng)答。
免疫法可提供一種有效方法，用于預(yù)防眾多感染性疾病因素，例如病毒如流感病毒、HIV病毒、乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和狂犬病病毒；細(xì)菌，如大腸桿菌、假單胞菌、志賀氏菌、梅毒、分枝桿菌、衣原體、立克次氏體和粘質(zhì)沙雷菌；真菌，如曲霉、念珠菌；以及原生動(dòng)物和多細(xì)胞寄生蟲(chóng)，如血吸蟲(chóng)屬、瘧原蟲(chóng)屬、盤尾屬和變形蟲(chóng)。免疫法還可能利用治療性疫苗對(duì)已患有感染性疾病的個(gè)體進(jìn)行治療。此外，免疫法還可預(yù)防或治療非感染性疾病，如癌癥。但許多抗原的免疫原性很弱，而在預(yù)防或治療這些疾病方面未能證明免疫法是一種適當(dāng)?shù)牟呗浴Ｔ趧?dòng)物免疫中常規(guī)使用的佐劑不能使免疫應(yīng)答增強(qiáng)。此外，個(gè)體或患者的免疫系統(tǒng)可能不處于最佳運(yùn)行狀態(tài)，從而對(duì)能夠在其它健康個(gè)體中產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的抗原可能無(wú)法產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這些狀況為利用本發(fā)明所述裝置來(lái)刺激由傳統(tǒng)免疫法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答提供了機(jī)會(huì)。
在治療某些病情，如過(guò)敏反應(yīng)，或準(zhǔn)備將患者暴露于外來(lái)抗原，如進(jìn)行移植，時(shí)可能還需要對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行抑制。不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答被認(rèn)為是眾多自身免疫疾病及其它疾病的病因，如I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、葡萄膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力以及毒性彌漫性甲狀腺腫。在個(gè)體中植入含有可疑抗原的本發(fā)明所述裝置可誘導(dǎo)那些經(jīng)致敏后能夠識(shí)別該抗原的進(jìn)入細(xì)胞發(fā)生凋亡，并將其從免疫系統(tǒng)中清除。將抗原特異性祖細(xì)胞清除能夠使以后的外來(lái)抗原移植不發(fā)生排異。
本發(fā)明的更多應(yīng)用包括改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體的產(chǎn)生，并獲得由此產(chǎn)生的所需同種抗體。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的裝置可實(shí)現(xiàn)針對(duì)極少量抗原的多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體的制備過(guò)程。為對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，本發(fā)明所述裝置只需含有少量的稀有抗原，而且能夠在此后收集脾細(xì)胞。這種方法為目前直接將稀有抗原引入脾臟這種單調(diào)且無(wú)法預(yù)測(cè)結(jié)果的方法提供了改進(jìn)措施。此外，利用本發(fā)明所述裝置可避免對(duì)加強(qiáng)免疫的依賴。并且除此之外還能夠更迅速地產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫動(dòng)物所需的時(shí)間縮短，使得單克隆抗體的產(chǎn)生更加迅速。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可在利用該裝置提供抗原以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫之后從裝置中收集用于產(chǎn)生雜交瘤的免疫細(xì)胞。該方法還可用于人單克隆抗體的產(chǎn)生，方法是將本發(fā)明的裝置植入個(gè)體，在裝置中裝填抗原，然后從裝置中收集用于產(chǎn)生雜交瘤的免疫細(xì)胞。上述的多克隆抗體(免疫血清)和單克隆抗體可用于診斷、基礎(chǔ)研究、成像和/或治療。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，利用在重度復(fù)合性免疫缺陷病(SCID)小鼠中植入本發(fā)明所述裝置可產(chǎn)生人單克隆抗體，其方法如下。首先，將人周圍血淋巴細(xì)胞注射到SCID小鼠體內(nèi)，使其中的人淋巴細(xì)胞填充小鼠免疫系統(tǒng)。將本發(fā)明的裝置植入，裝置中含有可在植入約3天后變?yōu)榫哂猩锢寐实乃杩乖?，然后從裝置中收集細(xì)胞，由此獲得的人B淋巴細(xì)胞即可用于產(chǎn)生雜交瘤，這些雜交瘤能夠分泌抗所需抗原的抗體。
本發(fā)明所述裝置的進(jìn)一步應(yīng)用是從哺乳動(dòng)物中收集免疫細(xì)胞，用于以后的再次引入哺乳動(dòng)物。從該裝置中去除細(xì)胞的方法有，例如，從植入的裝置中吸出，或由體內(nèi)取出后通過(guò)聚合物基質(zhì)溶解而從裝置中收集，隨后可將細(xì)胞通過(guò)諸如冷凍保存的方法加以儲(chǔ)存，并可以在以后的時(shí)間里重新引入哺乳動(dòng)物。這對(duì)經(jīng)受全身放射治療的哺乳動(dòng)物尤其有效。可將不含抗原的本發(fā)明所述裝置植入并保持7-10天，然后取出該裝置或其內(nèi)容物，并把其中包含的細(xì)胞冷凍保存。在放射治療之后，可把這些細(xì)胞重新引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，由此，這些細(xì)胞將重構(gòu)免疫系統(tǒng)。在該項(xiàng)應(yīng)用的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可在收集前將協(xié)同刺激因子，如能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，引入該裝置，以提高裝置內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)量。在一項(xiàng)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，從帶有抗原的裝置中收集的免疫細(xì)胞可用于主動(dòng)免疫，其中的細(xì)胞可被儲(chǔ)存，而后可在，例如，化療或其它治療操作的一個(gè)療程后重新引入哺乳動(dòng)物。在又一項(xiàng)實(shí)施方案中，可將由裝置收集的細(xì)胞儲(chǔ)存，并在此后于引入體內(nèi)之前將其暴露于抗原(如癌抗原)，使T細(xì)胞先體外后體內(nèi)傳播，以此來(lái)進(jìn)行繼承性免疫治療。
在本發(fā)明的另一項(xiàng)應(yīng)用中，該裝置可用于以基因轉(zhuǎn)染裝置內(nèi)的免疫細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞繼而可致敏裝置中的免疫細(xì)胞，并且/或能夠在遷移出該裝置后致敏遠(yuǎn)端的免疫細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，可將編碼腫瘤特異性抗原或病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲(chóng)性抗原的DNA、RNA或cDNA置于含有或不含相應(yīng)蛋白抗原的裝置內(nèi)。進(jìn)入該裝置的抗原呈遞細(xì)胞可被基因轉(zhuǎn)染，從而表達(dá)抗原蛋白，并且能夠遷移至體內(nèi)的周邊部位，在那里它們將刺激免疫細(xì)胞。
本發(fā)明的裝置可通過(guò)熟練技術(shù)人員所了解的方法加以制備，只要其結(jié)構(gòu)能夠使它以上文所述的方式發(fā)揮作用，其大小和形狀則可各不相同。如上文所述，該裝置可作為小分子，如引入裝置的抗原、細(xì)胞因子及其它由裝置內(nèi)的免疫細(xì)胞分泌的因子，的擴(kuò)散屏障，但它允許免疫細(xì)胞進(jìn)出該裝置。因此，蛋白和其它小分子的被動(dòng)擴(kuò)散受到限制，而免疫細(xì)胞卻能夠主動(dòng)移進(jìn)并移出該裝置。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，可在需要的情況下將裝置由一小段中空的生物惰性塑料管，如硅酮管制成，以便于插入皮膚的小切口，并便于以后取出。多孔聚合物基質(zhì)，即海綿狀材料，要配合管孔的尺寸。其開(kāi)口端封閉或不封閉均可。在管壁上造少量孔洞?？锥磾?shù)量、形狀及大小的各種變化均處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。引入的抗原可采用溶液或懸浮液形式或不具有生物利用率的形式，這些抗原可通過(guò)在制造過(guò)程中摻入基質(zhì)或通過(guò)管的一端或管壁本身注射入基質(zhì)。
抗原能夠以文中稱為生物可用或完全生物可用的形式直接在裝置的基質(zhì)中提供，或能夠以隨后可變?yōu)榫哂猩锢寐实姆巧锟捎眯问教峁?。將抗原摻入提供受控釋放、持續(xù)釋放或延遲釋放特性的成分也同樣適合；這些方法及成分可包括裝入微囊、脂質(zhì)體和小球體。優(yōu)選而言，為刺激或加強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，配制的抗原應(yīng)在植入約3天后在基質(zhì)內(nèi)恢復(fù)生物利用率。適當(dāng)?shù)尼尫艅┬途辉擃I(lǐng)域所了解。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，裝置可由聚合基質(zhì)材料制成預(yù)期的最終裝置的形狀，并可在其表面使用一層不通透的涂層。作為選擇，也可將具有一定孔隙度和交聯(lián)度的聚合基質(zhì)壓塑成預(yù)期的裝置形狀，然后外部用一種可在裝置表面與聚合物進(jìn)一步交聯(lián)的制劑處理，以有效形成不通透的涂層或容器。隨后可將涂層打孔并引入抗原。如果使用一種可由紫外光固化的聚合物，那么表面用紫外光處理也可影響裝置表面聚合作用的增加。熟練技術(shù)人員在設(shè)計(jì)具有上述特性的適當(dāng)裝置時(shí)均可輕易地實(shí)現(xiàn)，因而文中提供的實(shí)例均不是限制性的。
構(gòu)成該裝置的材料可選自廣泛的天然或合成的適當(dāng)組合物。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，聚合基質(zhì)可以是一種生物相容性材料，如羥基化聚乙酸乙烯酯。另一種可廣泛采用的基質(zhì)是聚氨基甲酸乙脂。其它適當(dāng)?shù)牟牧习ㄒ蚁?乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚交酯/乙交酯共聚物、膠原蛋白、交連的膠原蛋白以及明膠。
如上文所述，能夠通過(guò)許多方法在聚合基質(zhì)周圍實(shí)現(xiàn)帶孔但不通透的屏障或涂層。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，是將多段聚合基質(zhì)置于一小段諸如硅酮管等生物相容性塑料管的管腔中，在一項(xiàng)實(shí)施例中，是將一段內(nèi)徑0.15cm、外徑0.2cm、長(zhǎng)2.5cm的管材以相應(yīng)長(zhǎng)度2.5cm的一段預(yù)濕的羥基化聚乙酸乙烯酯基質(zhì)填充。在另一項(xiàng)實(shí)施例中，屏障或涂層是由適當(dāng)?shù)奶烊换蚝铣刹牧现瞥桑缢芰匣蚱渌酆衔?，如聚乙烯、交連的膠原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳膠樹(shù)脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹(shù)脂、聚乙烯吡咯烷酮，以及其組合物。有一種可從Dow Corning購(gòu)得的材料是SILASTIC硅酮。這些非限制性實(shí)例僅作為可適用于本發(fā)明的廣泛組合物中的典型。
在符合可限制小分子擴(kuò)散但允許免疫細(xì)胞進(jìn)出的上述的該裝置預(yù)期特性的情況下，作為制備本發(fā)明所述裝置的一個(gè)非限制性實(shí)例，可按照以下方法手工制備一種裝置。用外徑0.047英寸、直徑0.0235英寸、長(zhǎng)1.125英寸的硅酮管作為本發(fā)明所述裝置的非通透性容器?？锥纯衫?0號(hào)皮下注射針頭穿過(guò)該裝置的壁而手工鉆成，其產(chǎn)生的孔洞直徑約為1/16和1/32英寸。管內(nèi)鉆20個(gè)孔。這些參數(shù)僅作為該裝置的特征的一個(gè)參考，熟練技術(shù)人員將了解可同樣實(shí)現(xiàn)上文所提目標(biāo)，即不限制細(xì)胞進(jìn)出但限制和禁閉裝置內(nèi)諸如細(xì)胞因子等小分子的擴(kuò)散，的其它參數(shù)。
本發(fā)明的可生物降解裝置可包含一種由已知能夠在體內(nèi)緩慢降解的材料制成的基質(zhì)和容器。這些材料包括明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物以及其它為熟練技術(shù)人員所了解的材料。因此，用于刺激免疫應(yīng)答的優(yōu)選可完全生物降解裝置含有一種可生物降解容器、一種可生物降解基質(zhì)，以及包含于基質(zhì)的一種可生物降解的延遲釋放抗原制劑。末尾提到的制劑可在植入約3天后釋放抗原；而基質(zhì)和容器則在該裝置的使用期之后開(kāi)始明顯生物降解，這大約是植入10天后。
該裝置的容器中的孔洞可通過(guò)多種方法中的任何一種來(lái)形成，如手工方法或自動(dòng)方法。以少量的孔洞最為適宜，盡管其數(shù)量在某種程度上取決于該裝置的大小和形狀，但優(yōu)選的數(shù)量為每厘米管長(zhǎng)約10個(gè)。從上述的理論來(lái)考慮，孔洞的作用是允許免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)入裝置，從而使其能夠與抗原和協(xié)同刺激分子相接觸并被致敏，然后還允許致敏細(xì)胞外出。這些目標(biāo)必須要實(shí)現(xiàn)，同時(shí)帶孔裝置還必須容納并保持裝置內(nèi)預(yù)期水平的抗原和免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的諸如細(xì)胞因子等協(xié)同刺激因子。如下文的實(shí)施例所示，這些要求可通過(guò)適當(dāng)數(shù)量和形狀的孔洞來(lái)得以實(shí)現(xiàn)。在裝置由一段管材制成的情況下，管的末端可保持開(kāi)放以充當(dāng)孔洞，也可充當(dāng)植入前或植入后引入針頭或其它裝載抗原的方法的插孔。
該裝置可植入身體的適當(dāng)部位，使插入、裝載抗原及取出能夠在患者的不適感最小的情況下得以實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)部位之一為上臂內(nèi)側(cè)面。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該裝置由可生物降解材料制成，其程度達(dá)到該裝置可在使用期后降解而無(wú)需取出。
對(duì)刺激免疫應(yīng)答而言，可在植入時(shí)或優(yōu)選的是在植入后將具有生物利用率的抗原置于該裝置中；如果是在植入后，則優(yōu)選的時(shí)間約為植入3天后。也可在植入時(shí)將能夠在植入約3天后向裝置的基質(zhì)中釋放抗原的具有延遲釋放特性的非生物利用率抗原制劑置于該裝置內(nèi)。約3天后，裝置中所含細(xì)胞的數(shù)量和類型足以對(duì)存在的抗原產(chǎn)生應(yīng)答，并且由這些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和其它協(xié)同刺激分子通過(guò)帶孔容器賦予的擴(kuò)散屏障而被維持在足夠高的水平，然后向裝置中引入抗原將誘發(fā)產(chǎn)生最佳的免疫應(yīng)答。
如果該裝置不是由上述的可生物降解材料構(gòu)成，那么可在它實(shí)現(xiàn)其預(yù)期作用后通過(guò)簡(jiǎn)單的手術(shù)操作將其取出。一般約10天后，免疫細(xì)胞群體已離開(kāi)裝置，而該裝置也不再發(fā)揮作用。另一方面，也可在此后用抗原重新裝填裝置以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。
如上所述，為實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫應(yīng)答的預(yù)期刺激或抑制，對(duì)裝置的基質(zhì)中抗原的生物利用率進(jìn)行時(shí)間調(diào)配顯得十分重要，而且依賴于特定抗原的特性。一般而言，在植入時(shí)提供高濃度的具有完全生物利用率的抗原將對(duì)該抗原引起的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制效應(yīng)。而在裝置植入約3天后提供少量的具有生物利用率的抗原通常會(huì)產(chǎn)生刺激免疫應(yīng)答的效應(yīng)。這些條件在不降低本發(fā)明實(shí)用性的情況下可有所變化，這將取決于該裝置所用特定抗原的特性。熟練技術(shù)人員將能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的體外或體內(nèi)方法評(píng)定特定抗原的免疫原性，并能夠確定抗原的適當(dāng)濃度以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效應(yīng)。
利用本發(fā)明所述裝置來(lái)增強(qiáng)或刺激對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法是希望產(chǎn)生免疫細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞群體，這些細(xì)胞將針對(duì)該裝置所用抗原發(fā)動(dòng)有效的免疫應(yīng)答。
利用上述方法和裝置對(duì)一種特定抗原引起的免疫應(yīng)答進(jìn)行減量調(diào)節(jié)是本發(fā)明的另一目標(biāo)。通過(guò)在裝置中加入高劑量的抗原，可誘導(dǎo)進(jìn)入裝置并與抗原相遇的免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡。如果在植入前或植入后讓受者使用一種含有供者抗原的本發(fā)明所述裝置，則可預(yù)防或治療移植物排斥或移植排異等病癥。免疫應(yīng)答的減量調(diào)節(jié)可影響的一般病癥包括移植，在該病癥中可使受者耐受供者的血細(xì)胞，以減量調(diào)節(jié)受者對(duì)供者移植物的免疫應(yīng)答；自身免疫疾病，在該病癥中，對(duì)自體抗原的耐受可減量調(diào)節(jié)致病T細(xì)胞，并可利用內(nèi)源性抗原來(lái)改善免疫復(fù)合物的形成，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中使用膠原蛋白；糖尿病，在該病癥中可使糖尿病患者耐受胰島素或GAD；以及重癥肌無(wú)力，在該病癥中可使患者產(chǎn)生耐受性，以避免對(duì)乙酰膽堿受體的免疫應(yīng)答。此外，以過(guò)敏癥和變應(yīng)性反應(yīng)為特征的免疫應(yīng)答可通過(guò)誘導(dǎo)那些負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而使患者對(duì)變應(yīng)原耐受或脫敏來(lái)加以治療?？稍诒景l(fā)明所述裝置中使用以抑制免疫應(yīng)答的過(guò)敏癥及抗原的實(shí)例包括貓過(guò)敏癥過(guò)敏原DERP-1，以及由漆酚修飾肽引起的毒葉藤/毒葛(poison ivy/oak)過(guò)敏癥。
給出以下實(shí)施例是為了能夠更充分地闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。但它們決不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的廣闊范圍。
實(shí)施例1制備本發(fā)明所述裝置的一個(gè)實(shí)例是采用一段內(nèi)徑0.15cm、外徑0.2cm、長(zhǎng)2.5cm的硅酮管，并用長(zhǎng)2.5cm的一段羥基化聚乙酸乙烯酯海綿填充。將該裝置浸沒(méi)于含有磷酸緩沖鹽溶液的容器中并高壓滅菌。用三溴乙醇麻醉雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)。第1天將該裝置通過(guò)背側(cè)中線處的一個(gè)0.5cm的切口插入。在植入后2天時(shí)，取一些動(dòng)物在裝置中引入50μl的1mg/ml流感抗原(FLUSHIELD流感病毒疫苗，三價(jià)，A&B型；來(lái)自Henry Schein，Melville NY)，方法是用一個(gè)注射針頭穿透植入裝置附近的皮膚，然后靠感覺(jué)將針頭導(dǎo)入裝置的一端。
利用注射針頭在植入后2、4、7和9天時(shí)各從5只動(dòng)物的植入裝置中吸出流體，然后將流體中的細(xì)胞合并、清洗并計(jì)數(shù)。如圖1所示，在植入不含抗原的裝置的動(dòng)物中，細(xì)胞群體于第4天開(kāi)始增加，并在第7天達(dá)到峰值。第9天時(shí)，裝置中的細(xì)胞數(shù)下降，表明移入裝置的細(xì)胞正在移出該裝置而進(jìn)入周邊。如果在植入后2天時(shí)把流感抗原加入該裝置，則在植入后4天時(shí)裝置中的細(xì)胞數(shù)量增加了數(shù)倍，達(dá)225,000，相比之下不含抗原的裝置中的細(xì)胞數(shù)為60,000。因此，裝置中抗原的存在增加了募集至裝置中的細(xì)胞數(shù)，并/或觸發(fā)了裝置內(nèi)細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例2該實(shí)驗(yàn)利用BALB/c小鼠檢測(cè)裝置中出現(xiàn)的細(xì)胞的數(shù)量和表型。在如實(shí)施例1所述將裝置植入后的4天里，各從5只動(dòng)物的裝置中吸出細(xì)胞，并將其合并、清洗，再分裝至幾個(gè)試管中。加入對(duì)以下標(biāo)記物(CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD62P、CD62E、CD3和I-Ad)具有特異性的經(jīng)異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標(biāo)記的單克隆抗體，于4℃保溫30-45分鐘，然后清洗細(xì)胞并利用流式細(xì)胞光度計(jì)測(cè)定熒光的幾何平均值。為了進(jìn)行比較，還利用同組特異抗體測(cè)定來(lái)自同系未處理的小鼠的外周血淋巴細(xì)胞的熒光值，并將各抗體的所得結(jié)果表示為來(lái)自裝置的細(xì)胞相對(duì)于外周血淋巴細(xì)胞的熒光值增加百分率。
圖2給出在插入后4天時(shí)由裝置吸出的細(xì)胞的表型。在裝置中明顯遷入并聚集有高密度的T細(xì)胞(CD3、CD40)、巨噬細(xì)胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、樹(shù)突狀細(xì)胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B細(xì)胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。
實(shí)施例3通過(guò)在植入后3、7和10天時(shí)從裝置中收集細(xì)胞來(lái)計(jì)算如實(shí)施例1所述的裝置中細(xì)胞群體隨時(shí)間的變化。在第一次實(shí)驗(yàn)中，裝置內(nèi)不含任何抗原。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)由5只小鼠的植入裝置中吸出的細(xì)胞合并，并按照實(shí)施例2所述的相同方法測(cè)定帶有CD3、CD8、CD80、CD44、CD11c、CD45R/B220和CD14標(biāo)記物的細(xì)胞的密度，測(cè)定值表示為相對(duì)于未處理的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增加百分率。
圖3給出在植入后3、7和10天時(shí)計(jì)算的各表型細(xì)胞的密度。對(duì)所有標(biāo)記物而言，裝置中各細(xì)胞類型的富集明顯發(fā)生在第3天和第7天，而第10天時(shí)，細(xì)胞群體已遷出該裝置。
實(shí)施例4在與上例完全相同的第二次實(shí)驗(yàn)中于植入后2天時(shí)將流感抗原引入該裝置。如圖4所示，裝置中抗原的存在進(jìn)一步加大了T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(CD3、CD80或CD14)的密度，而且導(dǎo)致第10天時(shí)仍存留有這3種類型的細(xì)胞。加入抗原可延緩免疫細(xì)胞離開(kāi)該裝置。
實(shí)施例5通過(guò)測(cè)定植入動(dòng)物的脾臟中CD4和CD8 T細(xì)胞的表達(dá)變化，對(duì)植入含流感抗原裝置的遠(yuǎn)端效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估。方法如上文所述，并利用實(shí)施例2的方法測(cè)定T細(xì)胞的表型。在植入后2天時(shí)，裝置中引入0、5、10或50μg流感疫苗，并在免疫后10天(植入后12天)時(shí)收集脾臟。將脾臟置玻片粗面輕輕磨碎以分離脾細(xì)胞。細(xì)胞用PBS清洗并在紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma)中保溫5分鐘以去除紅細(xì)胞。如上所述用流式細(xì)胞光度計(jì)測(cè)定CD4和CD8的熒光。作為對(duì)照，還采用了傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)免疫方案，將小鼠經(jīng)爪墊注射相同劑量的流感抗原和Ribi佐劑R-700，一種由RibiImmunoChem Research,Inc.制造的含有單磷?；珹及合成海藻糖dicrynomycolate(MPLA+TDM)的乳劑。對(duì)照鼠亦在免疫后10天時(shí)取血。
如圖5所示，在裝置中裝載抗原后，來(lái)源于已植入裝置小鼠脾細(xì)胞的T細(xì)胞顯示出CD4和CD8分子的密度增加。來(lái)自以傳統(tǒng)方法用50μg抗原加佐劑免疫的動(dòng)物脾臟的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8)的水平與利用本發(fā)明所述裝置用10μg抗原誘導(dǎo)的水平相等。此外，不含抗原的裝置中也顯示出脾臟內(nèi)CD8細(xì)胞的增加，這是該裝置誘導(dǎo)的無(wú)菌性炎癥的結(jié)果。值得注意的是，在動(dòng)物中植入含有50μg抗原(與對(duì)照動(dòng)物中經(jīng)爪墊注射含佐劑的抗原的量相等)的本發(fā)明所述裝置顯示出脾臟內(nèi)CD8細(xì)胞表達(dá)的喪失。一種解釋是在裝置中加入高劑量的抗原導(dǎo)致抗原特異性細(xì)胞的凋亡。過(guò)強(qiáng)刺激的使用可能觸發(fā)了一種滋擾效應(yīng)，而其最終結(jié)果是清除已處理小鼠的脾臟中所有的CD4+CD8+T細(xì)胞。在免疫應(yīng)答被認(rèn)為有害，如移植排異，的情況下，這可應(yīng)用于對(duì)免疫應(yīng)答的預(yù)期減量調(diào)節(jié)。
有關(guān)利用本發(fā)明所述裝置可提高免疫效率的解釋且認(rèn)為是在把抗原注射于周邊部位后真正到達(dá)動(dòng)物的淋巴節(jié)的抗原量要比免疫所提供的量少幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，利用本發(fā)明所述裝置誘發(fā)出陽(yáng)性免疫應(yīng)答所需的最佳劑量會(huì)比傳統(tǒng)免疫法所采用的劑量少得多(即少幾個(gè)數(shù)量級(jí))。
實(shí)施例6以脾臟T細(xì)胞分泌的γ-干擾素為標(biāo)記物來(lái)確定由本發(fā)明所述裝置提供的對(duì)流感抗原的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。分泌γ-干擾素是Th1型和CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的主要特征之一，它被認(rèn)為是對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體和癌癥的保護(hù)性武器。如上所述將裝置植入小鼠，并在植入后3天時(shí)提供5μg的流感疫苗。對(duì)照組則通過(guò)爪墊以50μg抗原加Ribi佐劑免疫。免疫后10天時(shí)，按前例中的方法將脾細(xì)胞分離，涂片，并在以一定劑量范圍的抗原(1.4-180μg/ml)刺激之后利用ELISA試劑盒(Endogen)檢測(cè)產(chǎn)生的γ-干擾素。
圖6表明，利用含5μg抗原的本發(fā)明所述裝置對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫與利用50μg抗原加佐劑經(jīng)爪墊免疫所產(chǎn)生的活化T細(xì)胞水平相同。因此，利用本發(fā)明所述裝置無(wú)需使用佐劑即可實(shí)現(xiàn)強(qiáng)免疫應(yīng)答，并且所用抗原的量要少得多。
將分離自相同動(dòng)物的腘淋巴節(jié)的T細(xì)胞暴露類似濃度范圍的抗原之后，對(duì)這些T細(xì)胞的γ-干擾素分泌進(jìn)行了測(cè)定。如圖7所示，來(lái)自利用抗原加佐劑經(jīng)爪墊免疫的動(dòng)物的T細(xì)胞的γ-干擾素分泌并不象利用本發(fā)明所述裝置免疫的動(dòng)物的脾T細(xì)胞所產(chǎn)生的那樣強(qiáng)烈(與圖6對(duì)比)。由于腘淋巴節(jié)可對(duì)爪墊區(qū)域進(jìn)行引流并因而認(rèn)為可通過(guò)提供抗原而被致敏，因此該結(jié)果進(jìn)一步表明本發(fā)明所述裝置無(wú)需佐劑即可用來(lái)產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的效能。在進(jìn)一步的測(cè)定中，針對(duì)植入10天后仍保留在裝置中(已于第3天引入抗原)的細(xì)胞群體評(píng)定了γ-干擾素分泌隨暴露于抗原的反應(yīng)。圖8顯示，與記錄的脾細(xì)胞應(yīng)答水平相比，在對(duì)流感抗原體外誘發(fā)的應(yīng)答中只分泌了極少量的γ-干擾素。這一結(jié)果意味著，由裝置內(nèi)免疫法致敏的效應(yīng)細(xì)胞已移出該部位，并且第10天時(shí)(此時(shí)由裝置中吸出)大多數(shù)效應(yīng)細(xì)胞群體已喪失。圖1和圖3顯示第9天和第10天時(shí)裝置中帶有B細(xì)胞和T細(xì)胞表型的細(xì)胞的喪失，也證明了這些細(xì)胞移出至外周器官的可能性。
實(shí)施例7在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了脾細(xì)胞的增殖，目的是明確檢驗(yàn)植入裝置并裝載抗原后由本發(fā)明所述裝置誘導(dǎo)的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。采用的方案與前例所述相同。該實(shí)驗(yàn)中使用的抗原為卵清蛋白；裝置中含有不同劑量的卵清蛋白，范圍為10pg-50μg；對(duì)照動(dòng)物則利用相同劑量的抗原加Ribi佐劑經(jīng)爪墊注射免疫。
植入后10天時(shí)，將小鼠無(wú)痛致死，并除去脾臟。增殖測(cè)定在96孔板中進(jìn)行。于37℃下將每孔20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞暴露于180μg/ml的抗原，時(shí)間為72小時(shí)；對(duì)照采用相同劑量的Epstein-Barr病毒抗原。在暴露于抗原或?qū)φ湛乖螅?H-胸腺嘧啶核苷將細(xì)胞脈沖標(biāo)記6小時(shí)，測(cè)量摻入的標(biāo)記，并表示為刺激指數(shù)。
圖9顯示，利用含有卵清蛋白的裝置對(duì)小鼠進(jìn)行免疫可引起強(qiáng)烈的抗原特異性脾細(xì)胞增殖應(yīng)答。在利用低至幾皮克的抗原免疫的動(dòng)物中亦檢測(cè)到了應(yīng)答。而來(lái)源于由傳統(tǒng)方法加佐劑免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞要在高出5-7個(gè)數(shù)量級(jí)的抗原濃度下才產(chǎn)生增殖應(yīng)答。對(duì)照(Epstein-Barr病毒)抗原的刺激水平可以忽略(數(shù)據(jù)未給出)，表明由卵清蛋白誘發(fā)的免疫應(yīng)答具有高度特異性。
在以卵清蛋白為抗原的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，利用本發(fā)明所述裝置或通過(guò)爪墊，以單獨(dú)存在于裝置中、與BCG佐劑同存在于裝置中或與Ribi佐劑一同經(jīng)爪墊免疫的50μg、50ng或50pg卵清蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。這些實(shí)驗(yàn)中使用的BCG(卡介苗)佐劑TheraCys(R)為Connaught LaboratoriesLimited制備的減毒牛結(jié)核菌株凍干懸浮液，可用于膀胱癌的治療。免疫10天后時(shí)收集脾細(xì)胞，并在體外將其暴露于不同濃度的抗原(1.4-180μg/ml)，或同樣范圍的對(duì)照抗原，Epstein-Barr病毒。保溫72小時(shí)后，細(xì)胞用3H-胸腺嘧啶核苷脈沖標(biāo)記6小時(shí)，標(biāo)記的摻入以刺激指數(shù)表示，并作為T細(xì)胞刺激和增殖的量度標(biāo)準(zhǔn)。
圖10顯示，利用本發(fā)明所述裝置可實(shí)現(xiàn)以低劑量抗原誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。將脾細(xì)胞暴露于對(duì)照抗原后所檢測(cè)到的刺激水平可以忽略，進(jìn)一步表明該應(yīng)答對(duì)免疫原具有特異性。
實(shí)施例8將極低劑量的HIV gp120肽(315-322位殘基，RIQRGPGRAFVTIGK)抗原裝載到本發(fā)明所述裝置中后，評(píng)定對(duì)該抗原的抗原特異性抗體應(yīng)答。利用不同劑量的HIV肽經(jīng)裝置或與佐劑經(jīng)爪墊對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。免疫10天后收集血液，測(cè)定抗體對(duì)該肽的效價(jià)。四天后，用初次免疫原量的10％對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)注射，10天后收集二次血液并測(cè)定效價(jià)。
根據(jù)常規(guī)方法通過(guò)ELISA對(duì)抗原特異性IgG2a亞類抗體進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，即4℃下用溶于磷酸緩沖鹽溶液的抗原(1g/ml)包被微量滴定板，時(shí)間為16小時(shí)。將板清洗，并在孔中加入100μl血清樣品，從1∶50的稀釋度開(kāi)始，每步再進(jìn)一步稀釋3倍。樣品的測(cè)試一式兩份。室溫保溫1小時(shí)后，如上所述清洗板，并在孔中加入生物素標(biāo)記的抗鼠IgG2a抗體溶液(1μg/ml)。保溫1小時(shí)后，如上所述充分清洗，并在孔中加入以1∶4000稀釋于阻斷緩沖液的抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶。室溫保溫30分鐘后加入底物(每孔加入100μl四甲基聯(lián)苯胺)。將板保溫30分鐘。每孔加入100μl 2N的H2SO4以終止反應(yīng)。利用ELISA板閱讀儀在450nm波長(zhǎng)下讀板。
圖11顯示抗HIV gp120肽的特異性IgG2a的水平，該圖表明，在利用本發(fā)明所述裝置進(jìn)行單次免疫后，誘導(dǎo)出高濃度的抗原特異性抗體(IgG2a)，而利用傳統(tǒng)方案經(jīng)單次爪墊免疫后卻沒(méi)有產(chǎn)生應(yīng)答。二次爪墊免疫(加強(qiáng))后，由傳統(tǒng)方法免疫的動(dòng)物中產(chǎn)生了抗體應(yīng)答，而起初用本發(fā)明所述裝置免疫然后再加強(qiáng)(以裝置內(nèi)提供的最初劑量的10％)的動(dòng)物卻顯示出IgG2a水平的增加，并且在較低的抗原水平下還誘導(dǎo)出顯然更加強(qiáng)烈的應(yīng)答(圖12)。
實(shí)施例9在比較由本發(fā)明所述裝置免疫和由傳統(tǒng)爪墊免疫法免疫而產(chǎn)生的所得免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)上對(duì)不同佐劑的效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)定。如上所述，利用裝置或經(jīng)爪墊用不同劑量的HIV gp120肽(如前例)單獨(dú)或與Ribi或BCG佐劑一同免疫BALB/c小鼠。植入后3天時(shí)將免疫原引入裝置，并在免疫后10天時(shí)測(cè)定抗體的效價(jià)。如上例所述通過(guò)ELISA測(cè)定IgG2a抗體對(duì)gp120肽抗原的特異性。
使用了Ribi或BCG佐劑的傳統(tǒng)免疫法產(chǎn)生低水平的肽特異性IgG2a(圖13)。相比之下，由不含佐劑的本發(fā)明所述裝置(50ng肽)進(jìn)行的免疫明顯產(chǎn)生了高水平的肽特異性IgG2a。肽與任一種佐劑(Ribi或BCG)共同使用均產(chǎn)生低水平的應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)表明，在已經(jīng)很強(qiáng)的抗原性刺激物中加入佐劑則導(dǎo)致免疫應(yīng)答的降低。為了證明佐劑與抗原的加合效應(yīng)或協(xié)同作用，也許應(yīng)該以較低范圍(低于飛克劑量)的抗原和較低濃度的佐劑來(lái)檢驗(yàn)免疫方案。
檢驗(yàn)單純皰疹病毒糖蛋白B的一種15元肽(497-507位殘基TSSIEFARLQF)時(shí)獲得了類似的結(jié)果。
實(shí)施例10在檢驗(yàn)由本發(fā)明所述裝置中的抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度的進(jìn)一步測(cè)試中，將裝置植入小鼠，并在3天后引入不同劑量的細(xì)胞色素C。對(duì)照是將不同劑量的相同抗原經(jīng)爪墊與Ribi佐劑一同給藥。植入后10天時(shí)或爪墊接種后10天時(shí)，取動(dòng)物血液并對(duì)血清進(jìn)行ELISA以檢測(cè)可特異識(shí)別該抗原的IgG2a。除進(jìn)行ELISA時(shí)血清系列稀釋度為1∶50-1∶6400之外，方法與前例中采用的方法相似。
圖14顯示，在本發(fā)明所述裝置中使用極低劑量的抗原即實(shí)現(xiàn)了對(duì)該抗原的極強(qiáng)的特異性體液免疫應(yīng)答。在裝置中使用低至50飛克的抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)答類似于在傳統(tǒng)爪墊加佐劑免疫法中使用高出4個(gè)數(shù)量級(jí)的5ng抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)答。
實(shí)施例11利用由流感A病毒裂解并純化的血細(xì)胞凝集素蛋白抗原(斷裂血細(xì)胞凝集素抗原，BHA)對(duì)體液應(yīng)答的發(fā)展作進(jìn)一步的評(píng)定。利用在植入后3天時(shí)被引入0.1μg和10μg劑量抗原的本發(fā)明所述裝置對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。對(duì)照鼠則利用相同劑量的抗原及Ribi佐劑經(jīng)尾基部皮下注射進(jìn)行免疫。免疫后7、14、21和28天時(shí)取動(dòng)物血液，并通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中的抗原特異性總IgG抗體。
如圖15所示，免疫后2周時(shí)，由0.1μg抗原獲得了強(qiáng)體液應(yīng)答，并實(shí)現(xiàn)了高濃度的HA-特異性抗體。而第2周時(shí)，利用傳統(tǒng)方案與佐劑一同免疫的小鼠顯示出低水平的抗原特異性體液應(yīng)答，并且其水平在免疫后3周和4周時(shí)有所增加。在利用裝置免疫的小鼠的血清中，BHA-特異性抗體的水平比使用更高劑量的抗原且使用佐劑的傳統(tǒng)免疫法所實(shí)現(xiàn)的水平高出75-80％。在該實(shí)驗(yàn)中，裝置含有低劑量的抗原所產(chǎn)生的體液應(yīng)答要優(yōu)于含更高劑量抗原所產(chǎn)生的應(yīng)答。由前述實(shí)驗(yàn)可看出，高于5μg的劑量可導(dǎo)致免疫應(yīng)答的抑制，這可能是由于過(guò)量刺激誘發(fā)了凋亡。
實(shí)施例12利用包含于完整的上述裝置，或僅包含于植入到一段帶孔管旁邊的海綿基質(zhì)的流感抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，由此來(lái)評(píng)定在本發(fā)明所述裝置的海綿基質(zhì)周圍加上帶孔但不通透的生物惰性涂層或容器的重要性。在植入3天后，將評(píng)定的一定范圍劑量的抗原(0、50pg、500pg、5μg和50μg)引入裝置，或僅引入海綿。作為對(duì)照，用相同劑量的抗原與Ribi佐劑一同對(duì)小鼠爪墊進(jìn)行免疫。植入后或爪墊免疫后10天時(shí)，收集動(dòng)物脾臟，并如上所述進(jìn)行T細(xì)胞增殖測(cè)定，所用抗原量的范圍為0.1-180μg/ml。作為特異性的對(duì)照，還于體外使用Epstein-Barr病毒。3H-胸腺嘧啶核苷的摻入表示為刺激指數(shù)，以說(shuō)明T細(xì)胞刺激和增殖。
如圖16所示，與抗原由不處在帶孔但不通透容器中的海綿提供時(shí)相比，由完整裝置免疫的動(dòng)物顯示出的T細(xì)胞活化應(yīng)答明顯更強(qiáng)。圖18表明對(duì)無(wú)關(guān)抗原的應(yīng)答及其微弱。
實(shí)施例13通過(guò)進(jìn)行擴(kuò)散測(cè)試來(lái)評(píng)定在本發(fā)明所述裝置的海綿基質(zhì)周圍加上帶孔但不通透的生物惰性涂層或容器的重要性。將200μg牛血清白蛋白(BSA)注入裝置或海綿。將裝置或海綿放在含有1.5ml PBS的管中。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并測(cè)定BSA濃度。
如圖18所示，在5分鐘的保溫時(shí)間內(nèi)，海綿完全釋放了其內(nèi)容物。而本發(fā)明所述裝置控制著抗原的釋放，并且在960分鐘后仍保留有65％以上的抗原。保持一道擴(kuò)散屏障，以維持裝置內(nèi)有高水平的抗原、細(xì)胞因子、趨化因子和其它協(xié)同刺激分子與免疫細(xì)胞相接觸，這被認(rèn)為是該裝置在強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的激發(fā)中對(duì)傳統(tǒng)免疫方法做出明顯改進(jìn)的一種重要機(jī)制。
因此以上實(shí)例可證明，與傳統(tǒng)爪墊免疫法和僅將抗原裝載于植入的海綿基質(zhì)相比，本發(fā)明所述裝置能夠刺激更優(yōu)越的對(duì)不同抗原的T細(xì)胞應(yīng)答及體液應(yīng)答。
實(shí)施例14測(cè)定植入后不加抗原的本發(fā)明所述裝置中出現(xiàn)的細(xì)胞的表型。將植入后4天時(shí)由本發(fā)明所述裝置中吸出的細(xì)胞收集，清洗，并利用經(jīng)異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標(biāo)記的對(duì)以下標(biāo)記物有特異性的單克隆抗體染色CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD3和I-Ad(PharMingen，CA)。利用流式細(xì)胞光度計(jì)測(cè)定熒光的幾何平均值。為了進(jìn)行比較，還利用同組特異抗體測(cè)定來(lái)自同系未處理小鼠的周圍血淋巴細(xì)胞(PBL)的熒光值，并將各抗體的所得結(jié)果表示為平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
圖19給出在插入后4天時(shí)由裝置吸出的細(xì)胞的表型。裝置中明顯遷入并聚集有高密度的T細(xì)胞(CD3、CD40)、巨噬細(xì)胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、樹(shù)突狀細(xì)胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B細(xì)胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。因此，裝置中存在產(chǎn)生免疫應(yīng)答所必需的免疫細(xì)胞。與PBL(數(shù)據(jù)未給出)相比，由本發(fā)明所述裝置吸出的免疫細(xì)胞上協(xié)同刺激分子(CD80和CD86)及粘連分子(CD44)的表達(dá)明顯增加。有趣的是，對(duì)本發(fā)明所述裝置的切面進(jìn)行的電鏡分析結(jié)果表明存在含有大量溶酶體的巨噬細(xì)胞，在是其細(xì)胞活化的強(qiáng)化狀態(tài)。
實(shí)施例15將植入后不含抗原的本發(fā)明所述裝置中包含的細(xì)胞因子的濃度與未處理的鼠血清中的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行比較。如圖20所示，裝置中含有更高濃度的刺激性細(xì)胞因子L-2、IL-4和TNF-α以及約1/7濃度的TGF-β(數(shù)據(jù)未給出)。因此，本發(fā)明所述裝置一旦用抗原“點(diǎn)燃”，將為免疫應(yīng)答的爆發(fā)準(zhǔn)備好一個(gè)可引起強(qiáng)烈反應(yīng)的環(huán)境。
實(shí)施例16細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答被認(rèn)為是對(duì)流感病毒產(chǎn)生免疫所必需的。為評(píng)價(jià)本發(fā)明所述裝置在引發(fā)抗原特異性CTLs方面的能力，利用含有500pg流感病毒的本發(fā)明所述裝置對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。作為對(duì)照，還利用500pg疫苗加Ribi佐劑經(jīng)皮下注射對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。獲得免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞，并通過(guò)經(jīng)流感病毒感染的靶細(xì)胞的裂解來(lái)檢測(cè)其對(duì)流感病毒的特異性。CTLs的制備如下。將小鼠無(wú)痛致死并去除脾臟。制備單細(xì)胞懸浮液并用PBS清洗細(xì)胞。利用紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma,MO)去除紅細(xì)胞。在體外將脾細(xì)胞(5×106)與5×106個(gè)已被病毒感染(100 HAU/107個(gè)細(xì)胞/ml，37℃,60分鐘)并經(jīng)過(guò)照射(3000Rad)的同系脾細(xì)胞共培養(yǎng)，并在37℃和5％CO2條件下保溫5天。
以PR8感染(500HAU/106細(xì)胞)的P1.HTR細(xì)胞和未經(jīng)感染的P1.HTR細(xì)胞作為細(xì)胞毒性的靶。用100mCi的Na251CrO4將細(xì)胞標(biāo)記90分鐘，然后清洗3次。在效應(yīng)細(xì)胞中以不同的濃度加入懸浮于100ml RPMI 1640的靶細(xì)胞(104/ml)及5％的FCS培養(yǎng)基，濃度由100∶1的比率(E∶T)開(kāi)始，并在96孔圓底微量滴定板中滴定為兩倍。保溫6小時(shí)后收集上清。結(jié)果根據(jù)以下公式表示為51Cr特異釋放的百分率〔(實(shí)驗(yàn)釋放量)-(自發(fā)釋放量)〕×100/〔(最大釋放量)-(自發(fā)釋放量)〕。
如圖21所示，利用含有500pg流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置進(jìn)行的免疫觸發(fā)了強(qiáng)有力的流感特異性CTLs，它在裂解經(jīng)流感感染的靶細(xì)胞方面明顯優(yōu)于對(duì)同時(shí)使用Ribi佐劑進(jìn)行傳統(tǒng)皮下免疫的應(yīng)答中所產(chǎn)生的CTLs。產(chǎn)生的CTL在體外不殺死非感染靶細(xì)胞，這表明了激發(fā)的應(yīng)答的特異性。在本發(fā)明所述裝置中使用更高劑量的抗原則未見(jiàn)到刺激。
實(shí)施例17為確定利用本發(fā)明所述裝置進(jìn)行免疫還可調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答，利用一些不同劑量的流感病毒疫苗經(jīng)本發(fā)明所述裝置給藥或與Ribi佐劑一同經(jīng)皮下注射給藥來(lái)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。與結(jié)合Ribi經(jīng)皮下免疫的方法(數(shù)據(jù)未給出)相比，在利用本發(fā)明所述裝置以更低劑量的疫苗進(jìn)行免疫的小鼠的血清中產(chǎn)生了高水平的流感特異性IgM、IgG1和IgG2a抗體。通過(guò)逐步提高血清稀釋度并記錄吸光度的方法對(duì)病毒特異性IgG1進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)結(jié)果顯示出更高的結(jié)合(圖22)。由IgG2a抗體亦觀測(cè)到類似的結(jié)果。
實(shí)施例18為確定抗體對(duì)流感抗原的相對(duì)親和力，把利用本發(fā)明所述裝置進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的血清抗體以及作為比較的經(jīng)傳統(tǒng)方案并使用佐劑而產(chǎn)生的血清抗體與摩爾濃度逐漸增加的KSCN(硫氰酸鉀)混合，KSCN可從結(jié)合在由抗原包被的微量滴定板上的復(fù)合物中洗脫抗原特異性抗體。如上文所述采用一種基于微量滴定板的標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法。在加入生物素標(biāo)記的抗鼠IgG之前，要先將板清洗并在孔中加入不同濃度的KSCN。室溫下將板保溫30分鐘。清洗板，然后在孔中加入生物素標(biāo)記的抗鼠IgG抗體溶液(0.5μg/ml)。不斷增加KSCN的濃度是分解由高親和力抗體與抗原結(jié)合所形成的復(fù)合物所必需的。如圖23所示，產(chǎn)生的抗體對(duì)病毒性抗原具有更高的親和力。因此，若利用本發(fā)明所述裝置，則極少量的疫苗已足以刺激強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例19在小鼠流感模型中測(cè)試?yán)帽景l(fā)明所述裝置進(jìn)行的免疫在保護(hù)哺乳動(dòng)物免受感染性疾病侵害方面的能力。利用本發(fā)明所述裝置或結(jié)合Ribi佐劑經(jīng)皮下給藥以兩種劑量的流感病毒疫苗流感疫苗(5pg和500pg)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。約免疫12周后，用致死劑量的流感疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊。如圖24所示，利用本發(fā)明所述裝置以5pg和500pg劑量的流感疫苗進(jìn)行接種均產(chǎn)生了完全的保護(hù)性，而利用500pg流感疫苗加Ribi佐劑經(jīng)皮下免疫的小鼠中只有60％存活下來(lái)。到第14天時(shí)，所有用5pg劑量加佐劑免疫的動(dòng)物均死于該疾病。引人注意的是，不但利用本發(fā)明所述裝置進(jìn)行免疫可提供完全的保護(hù)，而且使用1/100的抗原劑量且無(wú)需佐劑亦可實(shí)現(xiàn)完全的保護(hù)。用病毒攻擊后，由本發(fā)明所述裝置免疫的小鼠還表現(xiàn)出穩(wěn)定的體重，表明產(chǎn)生了一種與其對(duì)急性感染的相對(duì)抵抗力相關(guān)的更輕度的疾病。
實(shí)施例20通過(guò)植入含有流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置來(lái)評(píng)定該裝置在含有人免疫細(xì)胞的重度復(fù)合性免疫缺陷(SCID)小鼠中產(chǎn)生特異性人IgG的效用。在SCID Beige CD17(6-8周齡雌性)小鼠中注入(腹膜內(nèi)方式)20×106個(gè)來(lái)自正常人供體的PBMC。3天后通過(guò)肌內(nèi)注射或通過(guò)植入預(yù)注有50ng流感病毒疫苗的本發(fā)明所述裝置對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。免疫3周后取小鼠血液，并利用傳統(tǒng)ELISA測(cè)試血清的流感特異性體液應(yīng)答。如圖25所示，用疫苗免疫產(chǎn)生了流感特異性人IgG。此外還如圖所示，利用摩爾濃度逐漸增加的KSCN來(lái)測(cè)定血清抗體對(duì)流感抗原的相對(duì)親和力(按照上文實(shí)施例18所述)，與傳統(tǒng)的肌內(nèi)免疫相比，本發(fā)明所述裝置產(chǎn)生了更高效價(jià)的人流感特異性抗體(圖26)。該方法還可用來(lái)生成能夠產(chǎn)生人單克隆抗體的人雜交瘤。
實(shí)施例21在本發(fā)明所述裝置中提供更高劑量的抗原可導(dǎo)致免疫應(yīng)答的抑制。在Balb/c小鼠體內(nèi)植入裝載了5-50μg流感疫苗的裝置，或利用混有Ribi佐劑的抗原進(jìn)行爪墊內(nèi)免疫。免疫后10天時(shí)將小鼠無(wú)痛致死，分離脾細(xì)胞并鋪在96孔板內(nèi)(2×105細(xì)胞/孔)。37℃下將細(xì)胞暴露于流感抗原72小時(shí)。用抗原刺激后，去除培養(yǎng)物中的上清，并利用ELISA試劑盒(Endogen)測(cè)定γ-干擾素的產(chǎn)生。如圖27所示，利用抗原結(jié)合Ribi佐劑免疫的小鼠產(chǎn)生一種直接隨抗原劑量而增加的免疫應(yīng)答。相比之下，由裝置中的抗原免疫的小鼠在低劑量抗原情況下顯示出對(duì)免疫應(yīng)答的刺激(如前文中的實(shí)施例所述)，但在更高劑量抗原的情況下卻顯示出免疫應(yīng)答的下降。因此，在植入的本發(fā)明所述裝置中含有大量抗原會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答的減量調(diào)節(jié)。在特定免疫抑制被認(rèn)為有益，如移植、過(guò)敏癥等，的治療策略中可使用該方法。
實(shí)施例22本發(fā)明所述裝置還可用來(lái)產(chǎn)生對(duì)多糖抗原的免疫應(yīng)答。利用裝載有肺炎球菌抗原(Pneumovax-23)的裝置進(jìn)行單次免疫可產(chǎn)生一種特異的免疫應(yīng)答。在23種最流行的或侵襲性的肺炎球菌類型中，Pneumovax是一種多價(jià)的肺炎球菌疫苗，它含有高純度的莢膜多糖。用5μg或40pgPneumovax疫苗通過(guò)如上文所述植入皮下的裝置，或通過(guò)與Ribi佐劑混合并注入墊腳對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。第10天時(shí)取所有小鼠的血液，并通過(guò)ELISA測(cè)定總IgG應(yīng)答(圖29)、IgG1應(yīng)答(圖30)和IgG2a應(yīng)答(圖31)。這些結(jié)果表明，利用本發(fā)明所述裝置可實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖抗原的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例23本發(fā)明所述裝置可用來(lái)對(duì)高保守性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在這些實(shí)驗(yàn)中選擇親環(huán)蛋白作為模型蛋白，這是因?yàn)樵摰鞍自诓溉閯?dòng)物物種中高度保守，因而產(chǎn)生對(duì)親環(huán)蛋白的免疫應(yīng)答一直難以實(shí)現(xiàn)。將5μg、50ng或0.5ng人親環(huán)蛋白裝載入本發(fā)明所述裝置并植入，或?qū)⑵渑cRibi佐劑混合并皮下注射，由此對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。取小鼠血液，并通過(guò)ELISA測(cè)定血清對(duì)人親環(huán)蛋白的IgG2a應(yīng)答。如圖32所示，與利用親環(huán)蛋白加Ribi佐劑經(jīng)皮下免疫的小鼠相比，利用本發(fā)明所述裝置以兩種較低劑量的抗原進(jìn)行免疫的小鼠顯示出更優(yōu)越的對(duì)抗原的應(yīng)答。這一結(jié)果表明，該裝置可誘導(dǎo)對(duì)高保守抗原的免疫應(yīng)答，而這些抗原在其它方面可能不具有免疫原性。利用本發(fā)明所述裝置中含有的高劑量抗原進(jìn)行的免疫未能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答。
實(shí)施例24本發(fā)明所述裝置可用來(lái)產(chǎn)生對(duì)完整活組織的免疫應(yīng)答。在該實(shí)驗(yàn)中使用活鉤蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，方法是利用植入皮下的本發(fā)明所述裝置提供5只幼蟲(chóng)，或2周中分別皮下注射1000只活幼蟲(chóng)。如圖33所示，由ELISA測(cè)定發(fā)現(xiàn)兩種方案均誘導(dǎo)出L3特異性總IgG。分別利用照射后的幼蟲(chóng)和孢子體可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)多種寄生生物的免疫，如鉤蟲(chóng)和瘧疾；文中的研究結(jié)果表明，利用本發(fā)明所述裝置可通過(guò)較少量的生物來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫。
本發(fā)明可在不偏離其實(shí)質(zhì)或基本特征的情況下通過(guò)其它形式體現(xiàn)，或通過(guò)其它方式加以實(shí)施。因此無(wú)論從哪方面來(lái)看，本公開(kāi)內(nèi)容都將被認(rèn)為是說(shuō)明性的和非限定性的，本發(fā)明的范圍通過(guò)所附的權(quán)利要求書(shū)表示，并且所有處在同等含義和界限的范圍內(nèi)的變化都將被認(rèn)為包含在本文中。
文中引用多種出版物，其公開(kāi)內(nèi)容將被全面包括在內(nèi)以作為參考。
權(quán)利要求
1．一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法是通過(guò)在所述哺乳動(dòng)物身體中植入一種裝置，該裝置含有一種多孔基質(zhì)，基質(zhì)則包含在一種帶孔但不通透的容器中，所述基質(zhì)含有一定量的所述抗原，其中該裝置可吸引免疫系統(tǒng)細(xì)胞與所述抗原相遇并調(diào)節(jié)所述免疫應(yīng)答。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔基質(zhì)內(nèi)的抗原在將所述裝置植入所述哺乳動(dòng)物時(shí)具有生物利用率。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔基體內(nèi)的抗原在裝置已植入所述哺乳動(dòng)物之后變?yōu)榫哂猩锢寐省?br> 4．權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原在植入所述哺乳動(dòng)物后約3天時(shí)變?yōu)榫哂猩锢寐省?br> 5．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原在植入后約3天時(shí)被引入所述裝置。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原以延遲釋放劑型提供。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔基質(zhì)含有一種聚合材料。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、聚氨基甲酸乙脂、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述容器包含的聚合材料選自天然原料和合成原料。
11．權(quán)利要求1的方法，其中多孔聚合基質(zhì)含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
12．權(quán)利要求1的方法，其中與所述裝置植入所述哺乳動(dòng)物的時(shí)間相關(guān)的該裝置中的所述抗原量和該抗原的生物利用率的時(shí)間安排可導(dǎo)致對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答的誘發(fā)或增強(qiáng)。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述裝置內(nèi)的所述抗原在該裝置植入所述哺乳動(dòng)物之后具有生物利用率。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述抗原在所述裝置植入所述哺乳動(dòng)物后約2-4天時(shí)被引入該裝置。
15．權(quán)利要求1的方法，其中與所述裝置植入所述哺乳動(dòng)物的時(shí)間相關(guān)的該裝置中的所述抗原量和該抗原的生物利用率的時(shí)間安排可導(dǎo)致對(duì)該抗原的已有或潛在免疫應(yīng)答的抑制或減量調(diào)節(jié)。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述裝置中的所述抗原在植入所述哺乳動(dòng)物時(shí)具有生物利用率。
17．權(quán)利要求1的方法，其中所述裝置可在約10天的周期后由所述哺乳動(dòng)物的體內(nèi)取出。
18．權(quán)利要求1的方法，其中第二種量的所述抗原可被再次引人所述裝置。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述第二種量的所述抗原是通過(guò)植入時(shí)裝置中存在的該第二種量的該抗原的延遲釋放而被再次引人所述裝置。
20．一種用于調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的可植入裝置，該裝置含有多孔基質(zhì)，基體則包含在一種帶孔但不通透的容器中。
21．權(quán)利要求20的裝置，其中所述抗原存在于所述多孔基質(zhì)中。
22．權(quán)利要求20的裝置，該裝置進(jìn)一步包含用于在植入前或植入后將所述抗原引入并接觸所述多孔基質(zhì)的工具。
23．權(quán)利要求20的裝置，其中所述多孔基質(zhì)含有一種聚合材料。
24．權(quán)利要求23的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
25．權(quán)利要求24的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
26．權(quán)利要求20的裝置，其中所述容器含有一段帶孔管。
27．權(quán)利要求20的裝置，其中所述容器含有一種帶孔但不通透的涂層并安排在所述多孔基質(zhì)的周圍。
28．權(quán)利要求27的裝置，其中所述涂層含有一種聚合材料。
29．權(quán)利要求28的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
30．權(quán)利要求29的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括交連的膠原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯、硅酮、乳膠樹(shù)脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹(shù)脂、聚乙烯吡咯烷酮及其組合物。
31．權(quán)利要求20的裝置，其中多孔基質(zhì)含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
32．一種從哺乳動(dòng)物中獲得免疫細(xì)胞的方法，其中所述免疫細(xì)胞收集自植入在所述哺乳動(dòng)物中的一種裝置，該裝置含有一種多孔基質(zhì)，基質(zhì)則包含在一種帶孔但不通透的容器中。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述收集的細(xì)胞被重新引入所述哺乳動(dòng)物。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述收集的細(xì)胞在被重新引入所述哺乳動(dòng)物之前被冷凍保存。
35．權(quán)利要求32的方法，其中在所述裝置的多孔基質(zhì)內(nèi)存在一種抗原。
36．權(quán)利要求35的方法，其中所述免疫細(xì)胞被重新引入所述哺乳動(dòng)物。
37．權(quán)利要求35的方法，其中所述免疫細(xì)胞在體外接觸所述抗原后被重新引入所述哺乳動(dòng)物。
38．權(quán)利要求32的裝置，其中所述基質(zhì)含有一種聚合材料。
39．權(quán)利要求38的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
40．權(quán)利要求39的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括羥基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明膠、膠原蛋白、交連的膠原蛋白及其組合物。
41．權(quán)利要求32的裝置，其中所述容器含有一段帶孔管。
42．權(quán)利要求32的裝置，其中所述容器含有一種帶孔但不通透的涂層并安排在所述多孔基質(zhì)的周圍。
43．權(quán)利要求42的裝置，其中所述涂層含有一種聚合材料。
44．權(quán)利要求43的裝置，其中所述聚合材料選自天然原料和合成原料。
45．權(quán)利要求44的裝置，其中所述聚合材料的選擇集合包括交連的膠原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳膠樹(shù)脂、聚苯乙烯、丙烯酸樹(shù)脂、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮及其組合物。
46．權(quán)利要求32的裝置，其中多孔基質(zhì)含有羥基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段帶孔管。
47．權(quán)利要求35的方法，其中所述免疫細(xì)胞用于制備一種為產(chǎn)生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤。
48．一種用抗原免疫哺乳動(dòng)物用于制備一種為產(chǎn)生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤的方法，其中哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求12的方法進(jìn)行免疫。
49．一種用抗原免疫哺乳動(dòng)物用于制備一種為產(chǎn)生抗所述抗原的單克隆抗體的雜交瘤的方法，其中哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求21的裝置進(jìn)行免疫。
50．權(quán)利要求12的方法，其中針對(duì)所述抗原的所述免疫應(yīng)答選自預(yù)防性接種、治療性接種、細(xì)胞免疫、體液免疫、粘膜免疫、長(zhǎng)期免疫及其組合。
51．一種用于產(chǎn)生雜交瘤的方法，該雜交瘤可產(chǎn)生針對(duì)選定抗原的人單克隆抗體，該方法的連續(xù)步驟包括(a)將人外周血淋巴細(xì)胞引入一種嚴(yán)重復(fù)合性免疫缺陷(SCID)小鼠的循環(huán)，并使該淋巴細(xì)胞在該小鼠的免疫系統(tǒng)中增殖；(b)在該小鼠中植入權(quán)利要求21的裝置，該裝置的抗原包括所述的選定抗原；(c)從該裝置中收集免疫細(xì)胞；(d)從該收集的免疫細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞制備雜交瘤；以及(e)通過(guò)篩選法鑒定那些可產(chǎn)生能夠識(shí)別所述選定抗原的單克隆抗體的雜交瘤。
52．一種用遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞的方法，該方法包括將所述遺傳物質(zhì)引入一種裝置的基質(zhì)中，該裝置含有多孔基質(zhì)，基質(zhì)則包含在一種帶孔但不通透的容器中，將該裝置植入所述哺乳動(dòng)物的體內(nèi)。
53．權(quán)利要求52的方法，其中所述遺傳物質(zhì)的選擇集合包括DNA、RNA和cDNA。
54．權(quán)利要求52的方法，其中所述遺傳物質(zhì)可編碼一種抗原。
55．一種對(duì)免疫應(yīng)答引起的疾病或病癥進(jìn)行治療或預(yù)防的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求15的對(duì)免疫應(yīng)答的抑制。
56．權(quán)利要求55的方法，其中所述疾病或病癥的選擇集合包括過(guò)敏癥、移植排異和自身免疫疾病。
57．一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法是通過(guò)在所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)植入一種裝置，該裝置含有所述抗原，并進(jìn)一步包含一種用于限制分子被動(dòng)擴(kuò)散到該裝置外，但不限制免疫細(xì)胞主動(dòng)移入或移出該裝置的工具。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)、刺激、封閉、和減弱對(duì)于抗原的免疫應(yīng)答的方法和裝置,采用一種可植入裝置,將抗原以受控方式暴露于免疫系統(tǒng)細(xì)胞。該裝置包含放置在帶孔但不通透的容器中的多孔基質(zhì)。通過(guò)調(diào)節(jié)該抗原的生物利用率,以及相對(duì)于裝置植入動(dòng)物的時(shí)間抗原導(dǎo)入裝置的時(shí)間安排,可以誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的強(qiáng)烈的長(zhǎng)期的應(yīng)答,或減量調(diào)節(jié)或封閉現(xiàn)存的或潛在的免疫應(yīng)答。該方法和裝置可用治療接種,以及未暴露的動(dòng)物的預(yù)防接種。免疫可以細(xì)胞的,體液的,粘膜的。免疫應(yīng)答的抑制可用于變態(tài)反應(yīng),自身免疫病的預(yù)防和治療,以及使動(dòng)物耐受以抑制移植性抗原的免疫應(yīng)答。該裝置亦可用于收獲免疫細(xì)胞,以稍后再導(dǎo)入動(dòng)物,及制備免疫血清和雜交瘤。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1299272SQ99805765
公開(kāi)日2001年6月13日 申請(qǐng)日期1999年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月2日
發(fā)明者A·切拉米, C·切拉米, C·格爾貝爾, D·達(dá)夫 申請(qǐng)人:應(yīng)用疫苗技術(shù)公司