專利名稱：：使用連接寡核苷酸調(diào)節(jié)tlr介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用特定的核酸調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
：與細(xì)菌DNA中的某些基序的反應(yīng)為天然免疫的重要功能。長(zhǎng)期以來(lái)已知細(xì)菌DNA對(duì)哺乳動(dòng)物B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)而言為促有絲分裂的，而哺乳動(dòng)物DM—般不是這樣。這一免疫識(shí)別定向于位于包含未甲基化的CpG二核苷酸的基序上中心位置的特異性DNA序列的發(fā)現(xiàn)打開(kāi)了通向分子免疫學(xué)手段的領(lǐng)域。KriegAM等(1995)374:546-9?？梢允褂冒承﹥?yōu)選側(cè)翼序列范圍內(nèi)的CpG二核苷酸，即CpG基序的合成寡脫氧核苷酸(ODN)再現(xiàn)所謂的CpGDNA的免疫刺激作用。已經(jīng)報(bào)道了含CpG的ODN(CpG-ODN)對(duì)免疫系統(tǒng)的各種類型的細(xì)胞發(fā)揮許多作用，包括防止初級(jí)B細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入和使免疫應(yīng)答偏向于Thl-類免疫應(yīng)答，例如，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6(IL-6)，白細(xì)胞介素12(IL-12)，Y干擾素(IFN"7)，活化抗原特異性溶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞(CTL)和誘導(dǎo)小鼠的IgG2a。近來(lái)已經(jīng)報(bào)道了CpGDNA的免疫調(diào)節(jié)作用涉及通過(guò)Toll樣受體9(TLR9)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。認(rèn)為CpGDNA經(jīng)序列非特異性途徑攝入細(xì)胞并且輸送至內(nèi)體區(qū)室，其中它與TLR9以序列特異性方式發(fā)生相互作用。TLR9信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致大量免疫功能相關(guān)基因誘導(dǎo)，包括值得注意的NF-icB。TLR為識(shí)別存在于病原體中的特異性分子結(jié)構(gòu)的大受體家族(病原體相關(guān)分子模式或PAMP)并且也稱作模式識(shí)別受體(PRR)。表達(dá)PRR的免疫細(xì)胞在識(shí)別PAMP時(shí)被活化并且引起最佳適應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)生。已經(jīng)描述了由IO種不同的TLR亞型TLR1-TLR10組成的PRR。已經(jīng)描述了這類TLR參與識(shí)別雙鏈RM(TLR3)，脂多糖(LPS)(TLR4)，細(xì)菌鞭毛蛋白(TLR5)，小抗病毒化合物(TLR7和TLR8)和細(xì)菌DNA或CpG0DN(TLR9)。(參見(jiàn)Uhlmann等的綜述(2003)C"rrZ7/"or/ere/6:204-17)。此外，已經(jīng)鑒定了認(rèn)為與和通過(guò)TLR7和TLR8與信號(hào)發(fā)生相互作用的RNA分子(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/10406)。認(rèn)為這類免疫刺激RNA分子具有包括至少一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤和至少一個(gè)尿嘧啶的堿基序列。富含G，U的免疫刺激RNA無(wú)需如對(duì)TLR9所述的CpG基序。認(rèn)為實(shí)際發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)RNA分子類別存在于核糖體RM(rRNA)，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)和病毒RNA(vRNA)中。在發(fā)現(xiàn)免疫刺激CpGDNA后，出現(xiàn)了大量描述具有免疫抑制作用的短DM序列的報(bào)道。已知聚-G序列為免疫抑制性的。公布的PCT專利申請(qǐng)WO00/14217中描述了包含抑制基序M2GN3G的ODN，其中N"&和&中的至少兩種為G(鳥(niǎo)苷)。Krieg和同仁描述了一組具有3或4個(gè)連續(xù)G的抑制性15-merODN,它們可阻斷刺激性O(shè)DN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護(hù)和細(xì)胞周期進(jìn)入。LenertP等(2001)j/2〃s謝e銣/e/cZr"g/7er11:247—56;StunzLL等(2002)///mz/u/zo/32:1212-22;LenertP等(2003)h〃se雄腸/e/c爿c//e卩13:143-50。據(jù)報(bào)道這些ODN的免疫抑制作用對(duì)CpG-ODN具有特異性并且涉及非單純竟?fàn)幖?xì)胞攝取的機(jī)制。StunzLL等(2002)fwr///mzzw/zo/32:1212-22。Klinman和同仁獨(dú)立地報(bào)道了單免疫抑制性O(shè)DN。ZeunerRA等(20(J2)^rMr/〃VA力e咖46:2219-24;YamadaH等(2002)169:5590-4。發(fā)明概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法和組合物，包括抑制某些應(yīng)答，加強(qiáng)其它應(yīng)答或其某些組合。本發(fā)明部分涉及如下發(fā)現(xiàn)某些寡核苷酸顯然能夠改變TLR配體的TLR信號(hào)傳導(dǎo)特性。因此，按照一個(gè)實(shí)施方案，這些"連接"寡核苷酸能夠主要將TLR7配體轉(zhuǎn)化成TLR8配體，而按照另一個(gè)實(shí)施方案，它們主要將TLR7/8配體轉(zhuǎn)化成TLR8配體。因此，本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了刺激TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)有此需要的受試者給予有效刺激TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的用量的TLR7/8配體和連接寡核苷酸。本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了使TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答重定向?yàn)門LR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)經(jīng)歷TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的受試者給予有效使TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答重定向?yàn)門LR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的用量的連接寡核苷酸。本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了包含TLR7/8配體和連接寡核苷酸的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR7/8配體為TLR7配體，諸如TLR7特異性配體。TLR7配體可以為鳥(niǎo)苷類似物，諸如，但不限于C8-取代的鳥(niǎo)苷。TLR7配體可以為3M-001。TLR7配體可以為基于腺普的化合物，諸如，但不限于6-氨基-9-千基-2-(3-羥基-丙氧基)-9H-噤呤-8-醇或6-氨基-9-芐基-2-丁氧基-9H-嘌呤-8-醇。TLR7配體可以為7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷。C8-取代的鳥(niǎo)苷的實(shí)例包括7-烯丙基-7，8-二氫-8-氧代-鳥(niǎo)苷(洛索立賓)，7-硫雜-8-氧代鳥(niǎo)普(immunosine，艾沙托立賓，AM245,7-硫雜-8-氧代-7，8-二氫鳥(niǎo)苷，5-氨基-3-(P-D-呋喃核糖基)-3H，6H-噢唑[4，5-d]嘧啶-2,7-二酮)，8-巰基鳥(niǎo)苷，8-溴鳥(niǎo)普，8-曱基鳥(niǎo)苷，8-氧代-7，8-二氫鳥(niǎo)苷，C8-芳氨基-2'-脫氧鳥(niǎo)苷，C8-丙炔基-鳥(niǎo)苷，C8-和N7-取代的鳥(niǎo)噪呤核糖核苷，7-曱基-8-氧代鳥(niǎo)苷，8-氨基鳥(niǎo)苷，8-羥基-2'-脫氧鳥(niǎo)苷，7-脫氮雜-8-取代的鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷。在某些實(shí)施方案中，C8-取代的鳥(niǎo)苷為洛索立賓，immunosine或7-脫氮雜鳥(niǎo)苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TLR7/8配體為TLR8配體，包括TLR8特異性配體。TLR8配體可以為3M-002。在配體為TLR8配體的實(shí)施方案中，TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以比沒(méi)有連接寡核苷酸存在下獲得的免疫應(yīng)答水平增強(qiáng)至少2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，10-倍，15-倍，20-倍或20-倍以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TLR7/8配體為TLR7配體TLR8配體。這類TLR7/8配體的實(shí)例為咪唑并喹啉。咪唑并喹啉類的實(shí)例包括咪唑并喹啉胺，咪唑并吡啶胺，6,7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺，1，2橋連咪唑并喹啉胺，R-848(S-28463或瑞喹莫德)，4-氨基-2乙氧基甲基-a，a-二曱基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-乙醇，1-(2-曱基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)或S-27609。在某些重要的實(shí)施方案中，咪唑并會(huì)啉為R848。TLR7/8配體可以為3M-003。在配體為TLR7和TLR8配體的實(shí)施方案中，TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以比沒(méi)有連接寡核苷酸存在下獲得的TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平增強(qiáng)至少2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，10-倍，15-倍，20-倍或20-倍以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含式5'X-N廣X3'或式5'X-N43'，其中X可以為任何核苷酸并且可以存在或不存在且化和Ns表述4或5個(gè)連續(xù)的T(胸苷)，U(尿嘧咬)或A(腺嘌呤)，使得N4或Ns中的每個(gè)N相同。根據(jù)實(shí)施方案的不同，寡核苷酸為7,8，9，10，11，12,13，14，15，16，17或17個(gè)以上核苷酸長(zhǎng)度。在重要的實(shí)施方案中，它包含至少一個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵(直到并且包括完全硫代磷酸化主鏈)。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含式5'Xa-TTTTT-Xb3'，其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核苷酸并且可以存在或不存在。Xa和Xb可以為一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，1-IOO個(gè)核苷酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含6，7或7個(gè)以上連續(xù)的T。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，連接寡核苷酸為(dT)均聚物，其任選為17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含式5'Xa-UUUUU-Xb3、其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核苷酸并且可以存在或不存在。L和Xb可以為一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，i-ioo個(gè)核苷酸)，在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可以包含6，7或7個(gè)以上連續(xù)的U。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，寡核苷酸為尿嘧啶(dU)均聚物，其任選為17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含式5'Xa-AAAAA-Xb3'，其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核苷酸并且可以存在或不存在。Xa和Xb可以為一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，i-ioo個(gè)核苷酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可以包含6，7或7個(gè)以上連續(xù)的A。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，寡核苷酸為腺嘌呤(dA)均聚物，其任選為17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含式5'Cn-Tffl-Cp3、其中n為0-100的整數(shù)，p為0-100的整數(shù)和m為0-100的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，n和p之和為等于或低于m的值，使得整個(gè)寡核苷酸的C含量為50%,低于50%，低于45%，低于40%，低于35%，低于30%,低于25%,低于20%，低于15%，低于10%,低于5%或更低。在某些實(shí)施方案中，n在3-7，m在2-10且p在4-8，只要滿足上述百分比。實(shí)例包括5'"1\。(;43'(SEQIDNO:1)和5'。1^53'(SEQIDNO:2)。連接寡核苷酸包含CpG基序或它可以缺乏這樣的基序。該基序可以為未甲基化的CpG基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者分別給予TLR7/8配體和連接寡核苷酸。在這些和其它實(shí)施方案中，可以將配體和寡核苷酸彼此同時(shí)給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使寡核苷酸和TLR7/8配體彼此綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，使連接寡核苷酸與TLR7/8配體共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接寡核苷酸為DNA，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，它為RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，連接寡核苷酸不為免疫刺激性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，單獨(dú)的連接寡核苷酸不刺激TLR7-或TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包含抗原和/或所述的方法進(jìn)一步包含對(duì)受試者給予抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有過(guò)敏反應(yīng)或哞喘。所述的組合物可以為包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備用于對(duì)受試者預(yù)防接種的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了制備疫苗的方法。該方法包括將如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合與抗原和任選藥學(xué)上可接受的栽體緊密結(jié)合的步驟。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者感染的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了用于治療感染的組合物，它包括如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合和抗病毒藥或藥劑。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者癌癥的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了用于治療癌癥的組合物，它包括如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合和癌癥用藥劑。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者過(guò)敏性疾病的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了用于治療過(guò)敏性疾病的組合物，它包括如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者過(guò)敏反應(yīng)用藥劑。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者哮喘的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了用于治療哮喘的組合物，它包括如上所述的TLR配體和連接寡核苷酸組合在制備治療受試者哮喘用藥劑。本發(fā)明在其它方面中提供了鑒定TLR7/8配體和連接寡核苷酸的方法。因此，本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了鑒定TLR8配體的方法，包括使表達(dá)TLR8的細(xì)胞在有和沒(méi)有連接寡核苷酸存在下接觸測(cè)試配體，并且測(cè)定在有和沒(méi)有連接寡核苷酸存在下響應(yīng)該測(cè)試配體的表達(dá)TLR8的細(xì)胞的刺激。根據(jù)在有連接寡核苷酸存在下刺激的增加鑒定TLR8配體。刺激的增加優(yōu)選超過(guò)沒(méi)有連接寡核苷酸存在下非零的刺激水平。本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了TLR7配體的方法，包括使表達(dá)TLR7的細(xì)胞和表達(dá)TLR8的細(xì)胞在有和沒(méi)有連接寡核苷酸存在下接觸測(cè)試配體，并且測(cè)定在有和沒(méi)有連接寡核苷酸存在下響應(yīng)該測(cè)試配體的表達(dá)TLR7的細(xì)胞和表達(dá)TLR8的細(xì)胞的刺激。根據(jù)在有連接寡核苷酸存在下表達(dá)TLR7的細(xì)胞中的刺激減少和表達(dá)TLR8的細(xì)胞中的刺激增加鑒定TLR7配體。在該方面中，刺激的增加優(yōu)選超過(guò)沒(méi)有連接寡核香酸存在下的零刺激水平。本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了鑒定連接寡核苷酸的方法，包括使并且測(cè)定在有和沒(méi)有測(cè)試連接寡核苷酸存在下響應(yīng)該TLR7配體的表達(dá)TLR8的細(xì)胞的刺激?？梢詫⒋碳に脚c在沒(méi)有測(cè)試寡核苷酸存在下的水平，在沒(méi)有TLR7配體存在下的水平和在有測(cè)試寡核苷酸存在下的水平和/或在有TLR7配體和已知連接寡核苷酸存在下的水平進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)在有連接寡核苷酸存在下比其沒(méi)有時(shí)的對(duì)表達(dá)TLR8的細(xì)胞刺激增加鑒定連接寡核苷酸，條件是該寡核苷酸自身并不介導(dǎo)TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(如通過(guò)上述對(duì)照試驗(yàn)測(cè)定的)。TLR7和TLR8配體和連接寡核苷酸可以為前述方面和實(shí)施方案中所述那些中的任一種。表達(dá)TLR7或TLR8的細(xì)胞可以為天然表達(dá)TLR7或TLR8的細(xì)胞或它們可以為經(jīng)改造以表達(dá)(例如異位地)TLR7或TLR8的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)經(jīng)TLR7或TLR8的信號(hào)傳導(dǎo)及其下游效應(yīng)測(cè)定刺激，包括，但不限于基因表達(dá)增加(例如，如使用與TLR7或TLR8下游靶的啟動(dòng)子元件結(jié)合的報(bào)道構(gòu)建體顯現(xiàn)的)，生長(zhǎng)因子(細(xì)胞因子)表達(dá)，產(chǎn)生或分泌增加等。本發(fā)明的這些和其它方面在下文中更詳細(xì)地描述。附圖簡(jiǎn)述圖1A-1B表示0DN選擇性強(qiáng)化和抑制R-848介導(dǎo)的對(duì)人TLR8和TLR7的活性。圖1A表示0DN6056(SEQIDNO:3)和1982(SEQIDNO:4)(就序列而言，參見(jiàn)表1和2)抑制R-848對(duì)人TLR7的活性。將穩(wěn)定表達(dá)TLR7和NF-kB熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞與2R-848在有或沒(méi)有所示量的寡(dT)n均聚物ODN6056或雜聚物ODN1982存在下孵育。將單獨(dú)R-848的活性設(shè)定為100%。一式三份測(cè)定所有數(shù)據(jù)點(diǎn)并且展示平均值(+Z-SD)。所示結(jié)果為兩次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。圖1B表示寡(dT)nODN序列-選擇性強(qiáng)化R-848對(duì)人TLR8的活性。將穩(wěn)定表達(dá)hTLR8和NF-kb-焚光素酶報(bào)道構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞與增加量的R-848在沒(méi)有或有0.1，1和5jiM寡(dT)n均聚物0DN6056或雜聚物0DN1982存在下孵育。參比培養(yǎng)基本底計(jì)算NF-kB活化刺激。一式三份測(cè)定所有數(shù)據(jù)點(diǎn)并且展示平均值(+/-SD)。所示結(jié)果為四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。圖2A-C表示與寡(dT)nODN聯(lián)用時(shí)TLR7配體，洛索立賓和7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷改變的靶特異。在圖2A中，將穩(wěn)定表達(dá)hTLR7，hTLR8或hTLR9的HEK293細(xì)胞與增加量的洛索立賓孵育。通過(guò)測(cè)定16小時(shí)后的熒光素酶活性測(cè)定NF-kB活化并且展示為高于培養(yǎng)基本底的倍增刺激。在圖2B中，將表達(dá)hTLR8的HEK293細(xì)胞與增加量的洛索立賓在有或沒(méi)有所示濃度均聚物ODN6056或雜聚物ODN1982存在下孵育。將NF-kB活化指定為高于培養(yǎng)基本底的倍增誘導(dǎo)。在圖2C中，在沒(méi)有(實(shí)心圓圏)或有(空心圓圏)5jiM0DN6056存在下對(duì)表達(dá)hTLR8的HEK293細(xì)胞測(cè)定增加量的7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷(左面的小組)和肌苷(右面的小組)并且計(jì)算高于培養(yǎng)基本底的NF-kB刺激。一式三份測(cè)定所有數(shù)據(jù)點(diǎn)。所示數(shù)據(jù)來(lái)自三次實(shí)驗(yàn)之一。圖3A-3B表示0DN6056抑制HEK293細(xì)胞中TLR7介導(dǎo)的NF-kB活化。將穩(wěn)定表達(dá)hTLR7和NF-kb-熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞在有或沒(méi)有所示濃度的0DN6056存在下與2.5mM洛索立賓(圖3A)或2jiMR-848(圖3B)孵育16小時(shí)。參比培養(yǎng)基本底計(jì)算NF-kB活化刺激。一式三份測(cè)定所有數(shù)據(jù)點(diǎn)并且展示平均值(+/-SD)。所示結(jié)果來(lái)自兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。圖4A-4D表示特異性0DN使洛索立賓誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生重定向。將人PBMC與1mM洛索立賓在沒(méi)有或有增加量的ODN6056和ODN1982存在下孵育。24小時(shí)后收集上清液并且上清液并且通過(guò)ELISA測(cè)定IFN-a(圖4A)，IL一12p40(圖4B)，IFN，(圖4C)和TNF-a(圖4D)的量。數(shù)值代表3個(gè)供體的平均值(+/-SEM)。數(shù)據(jù)來(lái)自四次實(shí)驗(yàn)中的一次有代表性的實(shí)驗(yàn)。圖5A-5F表示在與洛索立賓和寡(dT)nODN共培養(yǎng)時(shí)對(duì)人單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p40和TNF-a的刺激。將人PBMC與所示量的洛索立賓和ODN孵育。使用抗IL-12p40/p70(圖5A)和抗TNF-a(圖5B)抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色。用抗CD14和抗CD19抗體同時(shí)染色細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞門控CD14-陽(yáng)性細(xì)胞并且計(jì)算IL-12p40/p70-或TNF-a-陽(yáng)性細(xì)胞百分比。結(jié)果表示三個(gè)供體的平均值(+/-SEM)。圖5C-5F表示有代表性的流式細(xì)胞計(jì)量斑點(diǎn)印跡。顯示的是兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。圖6A-6L表示在與洛索立賓和寡(dT)nODN6056共培養(yǎng)時(shí)對(duì)人NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y的刺激。將人PBMC與所示量的洛索立賓和ODN孵育。使用抗IFN-Y抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色。用抗CD56和抗CD3抗體同時(shí)染色細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞門控cd56-陽(yáng)性/cd3陰性細(xì)胞(NK細(xì)胞)并且計(jì)算IFN-y-陽(yáng)性細(xì)胞百分比并且在流式細(xì)胞計(jì)量斑點(diǎn)印跡內(nèi)展示。顯示的是五個(gè)中兩個(gè)有代表性的供體。圖7A和7B表示洛索立賓與ODN共孵育對(duì)細(xì)胞因子從分離細(xì)胞群中產(chǎn)生的影響。在圖7A中，使用CD14mAb從人PBMC中分裂單核細(xì)胞(96%純度)并且與所示量的洛索立賓在有或沒(méi)有ODN存在下孵育。通過(guò)ELISA測(cè)定上清液中IL-12p40的量。數(shù)據(jù)展示了兩個(gè)單獨(dú)供體的結(jié)果(灰色和黑色條)。表示為3次類似的實(shí)驗(yàn)之一。在圖7B中，使用BDCA-4mAb從2個(gè)供體(灰色和黑色條)的人PBMC中富集PDC(85%純度)并且與所示的洛索立賓和ODN組合孵育24小時(shí)。通過(guò)ELISA檢測(cè)上清液中的IFN-a。顯示的是來(lái)自3次類似的實(shí)驗(yàn)之一的數(shù)據(jù)。圖8A表示對(duì)在有所示量的ODN存在下與50jiMR-848孵育16小時(shí)的hTLR8-LUC-293細(xì)胞的作用。通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性測(cè)定NF-kB刺激。將由單獨(dú)的50R-848誘導(dǎo)的NF-kB活性設(shè)定為100%.圖8B表示在有1pM所示ODN存在下與增加濃度的R-848孵育16小時(shí)的hTLR8-LUC-293細(xì)胞。通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性測(cè)定NF-kB刺激。圖9A和9B表示使用TLR7特異性配體6-氨基-9-節(jié)基-2-丁氧基-9H-噤呤-8-醇與ODN6056的組合的TLR7和TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。圖9A表該組合對(duì)TLR7信號(hào)傳導(dǎo)的作用。圖9B表示該組合對(duì)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的作用。圖IO表示對(duì)兩種不同RMs的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的作用。聚(rU)^(SEQIDNO:5)在沒(méi)有TLR7/8配體存在下刺激TLR8?；旌系腞NA寡(SEQIDNO:16)不能單獨(dú)刺激TLR8。圖11表示在有TLR7/8配體存在下兩種RNAs對(duì)R-848TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的作用。圖12表示TLR8介導(dǎo)的ODN6056對(duì)TLR7配體(洛索立賓，immunosine)和化合物的作用，所述的配體既可以為TLR7，又可以為TLR8配體(R-848),而所述的化合物不為TLR7/8配體(利巴韋林)。圖13A-D表示immunosine(A),可以為在3'末端或在內(nèi)部(B)或在5'末端(C)結(jié)合的兩種immunosine變體/單體(B和C)的寡核苷酸和6-氨基-9-芐基-2-丁氧基-9H-嘌呤-8-醇(D)的結(jié)構(gòu)，圖14表示包含連接基的immunosine-寡核苷酸綴合物的結(jié)構(gòu)。圖15A-C表示R-848(A)，CL-029(B)和immunosine(C)的結(jié)構(gòu)和可以結(jié)合連接基和/或寡核苷酸的點(diǎn)。發(fā)明詳述本發(fā)明部分涉及某些寡核苷酸能夠調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)。本文所用的調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答意指操縱一種或多種TLR信號(hào)傳導(dǎo)的能力。例如，本發(fā)明能夠改變特定TLR配體的TLR特性，使得在有某些寡核苷酸存在下，這些配體通過(guò)不同的TLR傳導(dǎo)信號(hào)。作為另一個(gè)實(shí)例，在有某些寡核苷酸存在下，已知通過(guò)一種以上TLR傳導(dǎo)信號(hào)的TLR配體表現(xiàn)出僅通過(guò)一種TLR進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，并且在許多情況下，這樣的信號(hào)傳導(dǎo)得到增強(qiáng)。在另一個(gè)實(shí)例中，在有某些寡核苷酸存在下，TLR信號(hào)傳導(dǎo)的效能和功效得到顯著增加。因此，本發(fā)明能夠通過(guò)TLR7，TLR8和TLR9中任一種或通過(guò)其中任何的組合選擇性抑制和/或增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明部分涉及如下觀察結(jié)果通過(guò)自身活化TLR7和TLR8的咪唑并喹啉衍生物瑞喹莫德(R-848)與寡(dT)17均聚物寡核苷酸(0DN6056)共孵育顯著增加了R-848對(duì)表達(dá)TLR8的HEK293細(xì)胞的活性，而TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)被消除。類似地，通過(guò)自身活化TLR7的鳥(niǎo)苷類似物洛索立賓與寡(dT)uODN6056的組合以序列選擇性方式誘導(dǎo)TLR8介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)并且消除TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)與寡(dT)17共孵育還改變了洛索立賓在人免疫細(xì)胞種誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分布。IL-12,TNF-a或IFN-y大量分泌，而IFN-a產(chǎn)生被消除。盡管并不預(yù)計(jì)受到任何特定機(jī)制約束，但是推定在誘導(dǎo)細(xì)胞因子中觀察到的改變是因單獨(dú)的洛索立賓使從類漿細(xì)胞DC活化的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)移至通過(guò)其與ODN組合活化的單核細(xì)胞所致，并且表明單核細(xì)胞不表達(dá)功能性TLR7。本發(fā)明由此用于調(diào)節(jié)一定范圍的免疫應(yīng)答。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明用于抑制TLR7信號(hào)傳導(dǎo)(和相關(guān)的TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)，任選同時(shí)誘導(dǎo)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(和相關(guān)的TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(和相關(guān)的TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)的誘導(dǎo)(包括增強(qiáng))。根據(jù)連接寡核苷酸性質(zhì)的不同，能夠同時(shí)誘導(dǎo)TLR9信號(hào)傳導(dǎo)(和相關(guān)的TLR9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。例如，包含CpG基序的連接寡核苷酸與TLR7配體，諸如洛索立賓的組合可以誘導(dǎo)TLR8和TLR9信號(hào)傳導(dǎo)(及其相關(guān)的免疫應(yīng)答)。本發(fā)明還可用于治療一系列疾病，它們可以得益于任選在沒(méi)有或有TLR9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答存在下TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制和/或TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)(包括增強(qiáng))?？梢缘靡嬗赥LR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制的疾病包括自身免疫疾病，諸如，但不限于狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，特別是那些與DNA病毒感染相關(guān)的疾病?？梢允褂肨LR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制，伴隨TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，其中需要增強(qiáng)由T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制的T細(xì)胞應(yīng)答。這類疾病包括，但不限于某些形式的癌癥以及HCV，HBV和HIV感染。聯(lián)合的TLR7抑制和TLR8誘導(dǎo)還可能有益于治療自身免疫疾病，或其中需要誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但避免TLR7相關(guān)毒性。不依賴于TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)(包括增強(qiáng))尤其可用于在疫苗或非疫苗環(huán)境中治療癌癥和感染。本發(fā)明還可用于治療可以得益于細(xì)胞因子產(chǎn)生的疾病，或其中受試者對(duì)某些細(xì)胞因子的作用難以控制或變得對(duì)其難以控制(例如，IFN-a，正如有時(shí)在治療病毒感染中觀察到的)。TLRTol1樣受體(TLR)為在哺乳動(dòng)物先天免疫性中起決定性作用的高度保守的多肽類家族。目前鑒定了10個(gè)家族成員，命名為TLR1-TLR10。各種TLR的胞質(zhì)域的特征在于Tol1-白細(xì)胞介素1(IL-1)受體(TIR)結(jié)構(gòu)域。MedzhitovR等(1998)Molcell2:253-8。TLR識(shí)別微生物侵入引起果蠅屬(Drosophila)和哺乳動(dòng)物中進(jìn)化保守的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)活化。已經(jīng)報(bào)道了包含TIR結(jié)構(gòu)域的連接蛋白MyD88與TLR結(jié)合并且將IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6(TRAF6)補(bǔ)充給TLR。認(rèn)為MyD88依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)導(dǎo)致NF-kB轉(zhuǎn)錄因子和c-JunNH2末端激酶(Jnk)促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活化，免疫活化中的關(guān)鍵步驟和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。就綜述而言，參見(jiàn)AderemA等(2000)A^wre406:782-87。認(rèn)為TLR在不同組織和各種類型的免疫細(xì)胞中差別表達(dá)。例如，據(jù)報(bào)道人TLR7在胎盤，肺，脾，淋巴結(jié)，扁桃體中和在類漿細(xì)胞前體樹(shù)突細(xì)胞(pDCs)上表達(dá)。ChuangT-H等(2000)五i/rO^oir/zze;Ve11:372—8);KadowakiN等(2001)/加M194:863-9。據(jù)報(bào)道人TLR8在肺，外周血白細(xì)胞(PBL)，胎盤，脾，淋巴結(jié)中和在單核細(xì)胞上表達(dá)。KadowakiN等(2001)/^r/;194:863-9;ChuangT-H等(2000)fi/rC7"h'/7e11:372-8。據(jù)報(bào)道人TLR9在脾，淋巴結(jié)，骨髓，PBL中和在pDC和B細(xì)胞上表達(dá)。KadowakiN等(2001)JExpMed194:863-9;BauerS等(2001)/VocY"/JcacT美萄98:9237-42;ChuangT-H等(2000)新C/^/力e淑"l:372-8。已知人和鼠TLR7的核苷酸和氨基酸序列。例如，參見(jiàn)GenBank登記號(hào)AF240467,AF245702,NM畫016562，AF334942,NM一133211;和AAF60188,AAF78035,NP-057646,AAL73191和AAL73192，將所用這些的內(nèi)容引入本文作為參考。據(jù)報(bào)道人TLR7為1049個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。據(jù)報(bào)道鼠TLR7為1050個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。TLR7多肽類包括具有富含亮氨酸的重復(fù)單位的胞外域，跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)域。已知人和鼠TLR8的核苷酸和氨基酸序列。例如，參見(jiàn)GenBank登記號(hào)AF246971,AF245703,NNL016610,XM一045706，AY035890，NM一133212;和AAF64061,AAF78036,NP-057694,XP-045706,AAK62677和NP-573475,將所用這些的內(nèi)容引入本文作為參考。據(jù)報(bào)道人TLR8為以至少兩種同種型存在，一種為1041個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，而另一種為1059個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。鼠TLR8為1032個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。TLR8多肽類包括具有富含亮氨酸的重復(fù)單位的胞外域，跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)域。已知人和鼠TLR9的核苷酸和氨基酸序列。例如，參見(jiàn)GenBank登記號(hào)NM-017442,AF259262，AB045180，AF245704，AB045181,AF348140，AF314224，NM—031178;和NP一059138，AAF72189，BAB19259,AAF78037,BAB19260,AAK29625，AAK28488和NP一112455,將所用這些的內(nèi)容引入本文作為參考。據(jù)報(bào)道人TLR9為以至少兩種同種型存在，一種為1032個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，而另一種為1055個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。鼠TLR9為1032個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。TLR9多肽類包括具有富含亮氨酸的重復(fù)單位的胞外域，跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)域。TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答本文所用的術(shù)語(yǔ)"TLR信號(hào)傳導(dǎo)"意指與通過(guò)TLR的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的任何方面。本文所用的術(shù)語(yǔ)"TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答"意指與TLR信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)(例如，作為其結(jié)果)的免疫應(yīng)答。TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為與TLR7信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征一般在于IFN-a和IFN誘導(dǎo)型細(xì)胞因子，諸如IP-IO和I-TAC誘導(dǎo)。在TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-la/P,IL-6，IL-8，MIP-la/P和MIP-3a/P水平低于在TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中誘導(dǎo)的那些水平。TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為與TLR8信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。該應(yīng)答的特征在于促炎細(xì)胞因子，諸如IFN-y，IL-12p40/70，TNF-a，IL-la/P,IL-6，IL-8，MIP-la/P和MIP-3a/P的誘導(dǎo)。TLR9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為與TLR9信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。該應(yīng)答的特征至少在于IFN，和IL-12產(chǎn)生和/或分泌，不過(guò)在水平上低于通過(guò)TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答獲得的水平。TLR7/8配體本文所用的"TLR7/8配體，，共同意指能夠增加TLR7和/或TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的任何活性劑(即TLR7和/或TLR8激動(dòng)劑)。因此，當(dāng)沒(méi)有本發(fā)明的連接寡核苷酸存在下使用時(shí)，某些TLR7/8配體誘導(dǎo)單獨(dú)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)(例如，TLR7特異性配體)，某些誘導(dǎo)單獨(dú)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(例如，TLR8特異性配體)，而其它誘既誘導(dǎo)TLR7，又誘導(dǎo)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這類配體與連接寡核苷酸聯(lián)用時(shí)，這些配體的TLR信號(hào)傳導(dǎo)特性改變。在某些實(shí)例中，TLR7信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制且TLR8信號(hào)傳導(dǎo)得到誘導(dǎo)。在其它實(shí)例中，TLR8信號(hào)傳導(dǎo)得到誘導(dǎo)(即從本底水平增加)或增強(qiáng)(即從非本底水平增加)，而在其它實(shí)施方案中，TLR8和TLR9信號(hào)傳導(dǎo)得到誘導(dǎo)或增強(qiáng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"TLR7配體"意指能夠增加TLR7信號(hào)傳導(dǎo)的任何活性劑(即TLR7的激動(dòng)劑)。在這方面，TLR7信號(hào)傳導(dǎo)水平可以比預(yù)先存在的信號(hào)傳導(dǎo)水平增強(qiáng)，或其誘導(dǎo)可以超過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)的本底水平。TLR7配體包括，但不限于鳥(niǎo)苷類似物，諸如C8-取代的鳥(niǎo)苷，主要由G和U組成的核糖核苷的混合物，鳥(niǎo)苷核苷酸和RNA或RNA-類分子(PCT/US03/10406)和基于腺苷的化合物(例如6-氨基-9-千基-2-(3-羥基-丙氧基)-9H-嘌呤-8-醇(CL-029，Sumitomo),6-氨基-9-節(jié)基-2-丁氧基-9H-嘌呤-8-醇(如圖13D中所示)和其它相關(guān)化合物，諸如US6310070Bl中所述的那些)。TLR7配體還披露在Gorden等J.Immunol.2005，174:1259-1268(例如，3M-001，N-[4-(4-氨基-2-乙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基)丁基-]甲磺酰胺;C17H23N502S;mw361)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"鳥(niǎo)苷類似物"意指具有涉及鳥(niǎo)嘌呤堿基，鳥(niǎo)苷核苷糖或鳥(niǎo)嘌呤堿基和鳥(niǎo)苷核苷糖的化學(xué)修飾的鳥(niǎo)苷-類核苷酸(不包括鳥(niǎo)苷)。鳥(niǎo)苷類似物特別包括，但不限于7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷。鳥(niǎo)苷類似物進(jìn)一步包括C8-取代的鳥(niǎo)苷，諸如7-硫雜-8-氧代鳥(niǎo)苷(immunosine),8-巰基烏苷，8-溴鳥(niǎo)苷，8-甲基鳥(niǎo)苷，8-氧代-7，8-二氫鳥(niǎo)苷，C8-芳氨基-2'-脫氧鳥(niǎo)苷，C8-丙炔基-鳥(niǎo)苷，C8-和N7-取代的鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷，諸如7-烯丙基-8-氧代鳥(niǎo)苷(洛索立賓)和7-曱基-8-氧代鳥(niǎo)苷，8-氨基烏苷，8-羥基-2'-脫氧鳥(niǎo)苷，8-羥基鳥(niǎo)苷和7-脫氮雜8-取代的鳥(niǎo)苷。本文所用的術(shù)語(yǔ)"TLR8配體"意指能夠增加TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的任何活性劑(即TLR8的激動(dòng)劑)。在這方面，TLR8信號(hào)傳導(dǎo)水平可以比預(yù)先存在的信號(hào)傳導(dǎo)水平增強(qiáng)，或其誘導(dǎo)可以超過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)的本底水平。TLR8配體包括主要由G和U組成的核糖核苷混合物，鳥(niǎo)苷核苷酸和RNA或RNA-類分子(PCT/US03/10406)。額外的TLR8配體還披露在Gorden等J.Immunol.2005,174:1259-1268中(例如，3M-002，2-丙基噻唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；C13H13N3S;mw243)。某些TLR7/8配體為TLR7和TLR8配體。它們包括咪唑并喹啉類，主要由G和U組成的核糖核苷混合物，鳥(niǎo)苷核苷酸和RM或RNA-類分子(PCT/US03/10406)。額外的TLR7/8配體還披露在Gorden等J.Immunol,2005,174:1259-1268中(例如，3M-003，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-6，7，8，9-四氫-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-乙醇水合物；C17H26N402;mw318)。咪唑并喹啉類免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，認(rèn)為它們誘導(dǎo)幾種細(xì)胞因子的表達(dá)，包括千擾素(例如，IFN-a)，TNF-a和某些白細(xì)胞介素(例如，IL-1，IL-6和IL-12)。咪唑并喹啉能夠刺激Thl免疫應(yīng)答，正如根據(jù)其誘導(dǎo)IgG2a水平增加的能力所證實(shí)的。據(jù)報(bào)道咪唑并喹啉活性劑還能夠抑制Th2細(xì)胞因子，諸如IL-4,IL-5和IL-13產(chǎn)生。咪唑并喹啉類誘導(dǎo)的某些細(xì)胞因子由巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道咪唑并喹啉的某些種類增加NK細(xì)胞裂解活性并且刺激B細(xì)胞增殖和分化，由此誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和分泌。本文所用的咪唑并喹啉類包括咪唑并會(huì)啉胺類，咪唑并吡啶胺類，6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺類和1，2橋連咪唑并喹啉胺類。這些化合物描述在美國(guó)專利US4689338，4929624，5238944,5266575,5268376,5346905，5352784，5389640，5395937，5494916，5482936，5525612,6039969和6110929中。咪唑并會(huì)啉類的具體種類包括R-848(S-28463);4-氨基-2乙氧基甲基-a，ot-二甲基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-乙醇；1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)和S-27609。咪喹莫特目前用于局部治療疣，諸如生殖器和肛門疣，并且還在基底細(xì)胞癌的局部治療中進(jìn)行了測(cè)試。本文所用的術(shù)語(yǔ)"TLR9配體"意指意指能夠增加TLR9信號(hào)傳導(dǎo)的任何活性劑(即TLR9的激動(dòng)劑)。TLR9配體特別包括，但不限于免疫刺激核酸且特別是CpG免疫刺激核酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)"免疫刺激CpG核酸"意指能夠活化免疫細(xì)胞的含CpG的任何核酸。至少CpG二核苷酸中的C一般為，但不一定未甲基化。免疫刺激CpG核酸描述在許多授權(quán)專利和公布的專利申請(qǐng)中，包括美國(guó)專利US6,194,388;6,207,646;6,218,371;6,239,116;6，339，068;6,406,705;和6，429，199。在某些實(shí)施方案中，TLR配體為特異性配體。本文所用的TLR7特異性配體為在沒(méi)有本發(fā)明連接寡核苷酸存在下使用時(shí)通過(guò)TLR7，但并非TLR8或TLR9傳導(dǎo)信號(hào)的配體。類似地，TLR8特異性配體為在沒(méi)有本發(fā)明連接寡核苷酸存在下使用時(shí)通過(guò)TLR8,但并非TLR7或TLR9傳導(dǎo)信號(hào)的配體。優(yōu)選TLR7特異性配體在沒(méi)有連接寡核苷存在下使用時(shí)通過(guò)TLR7而不是TLR傳導(dǎo)信號(hào)，而TLR8特異性配體在沒(méi)有連接寡核苷酸存在下使用時(shí)通過(guò)TLR8而不是TLR傳導(dǎo)信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，TLR配體不是RNA。TLR7/8配體與連接寡核苷酸的應(yīng)用可以刺激TLR8和TLR9，同時(shí)產(chǎn)生來(lái)自兩種受體的下游效應(yīng)。例如，寡核苷酸刺激TLR9可以導(dǎo)致，例如IFN-a產(chǎn)生，而寡核苷酸刺激TLR8可以導(dǎo)致，例如IL-12，TNF-a和IFN-y產(chǎn)生。配體和寡核苷酸可以彼此綴合或可以以物理方式彼此分離。連接寡核苷酸本發(fā)明將TLR7/8配體與連接寡核苷酸聯(lián)用。本文所用的連接寡核苷酸為與TLR7/8配體一起使用時(shí)通過(guò)抑制經(jīng)TLR7配體的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)經(jīng)TLR7配體的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)和/或增強(qiáng)經(jīng)為TLR7和TLR8配體的配體的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)添加該配體活性的寡核苷酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)寡核苷酸與術(shù)語(yǔ)核酸可以互換使用。優(yōu)選該術(shù)語(yǔ)不包括質(zhì)粒，栽體和/或反義核酸。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以為免疫刺激性的，而在其它實(shí)施方案中，它在單獨(dú)使用時(shí)可以為非免疫刺激性的。寡核苷酸可以為任何長(zhǎng)度，優(yōu)選7或8個(gè)至100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。一類廣泛的連接寡核苷酸包含式5'X-N4-X3'或5'X-N廣X3'，其中X可以為任何核苷酸并且可以存在或不存在和凡和A表示4和5個(gè)連續(xù)的T(胸苷)，U(尿嘧啶)或A(腺噤呤)，使得N4或Ns中的每個(gè)N均相同。寡核苷酸可以為7，8，9，10，11，12，13，14，15，16,17或17個(gè)以上核苷酸長(zhǎng)度。它優(yōu)選包含至少一個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵(直到并且包括完整的硫代磷酸化主鏈)。因此，一類連接寡核苷酸包含式5'Xa-TTTTT-Xb3、其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核普酸并且可以存在或不存在。Xa和Xb可以表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，l-100個(gè)核苷酸)。寡核苷酸可以為7，8，9，10，11,12,13，14，15，16，17,18，19，20，21，22，23或23個(gè)以上核苷酸長(zhǎng)度。寡核普酸可以飽和6，7或7個(gè)以上連續(xù)的T。優(yōu)選連接寡核苷酸為dT均聚物(即本文所述長(zhǎng)度的寡dT)。甚至更優(yōu)選連接寡核苷酸為胸苷(dT)均聚物17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。最優(yōu)選它包含至少一個(gè)硫代磷酸化核苷酸間鍵(直到并且包括完整的硫代磷酸化主鏈)。根據(jù)實(shí)施方案的不同，連接寡核普酸可以由100%T，99%T，98%T,97%T，96%T，95%T,94%T，93%T，92%T，91%T,90%T，85%T，80%T，75%T，70%T，65%T，60%T，55%T,50%T，45%T或45。/。以下T組成。另一類連接寡核苷酸包含式5'Xa-UUUUU-Xb3'，其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核苷酸并且可以存在或不存在。Xa和Xb可以表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，l-100個(gè)核苷酸)。寡核苷酸可以為7，8，9，10，11，12,13，14，15，16，17，18，19,20,21,22，23或23個(gè)以上核苷酸長(zhǎng)度。寡核苷酸可以飽和6，7或7個(gè)以上連續(xù)的U。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，寡核苷酸為dU均聚物，其優(yōu)選為17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且具有至少一個(gè)硫代磷酸化核苷酸間鍵(直到并且包括完整的硫代磷酸化主鏈)。根據(jù)實(shí)施方案的不同，連接寡核苷酸可以由100%U，99%U，98%U，97%U，96%U，95%U，94%U，93%U，92%U，91%U，90%U，85%U，80%U,75%U，70%U,65%U，60%U，55%U，50%U,45%U或45。/。以下U組成。另一類連接寡核苷酸含式5'Xa-AAAAA-Xb3'其中Xa和Xb可以獨(dú)立為任何核普酸并且可以存在或不存在。Xa和Xb可以表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，l-100個(gè)核苷酸)。寡核苷酸可以為7，8,9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或23個(gè)以上核苷酸長(zhǎng)度。寡核普酸可以飽和6，7或7個(gè)以上連續(xù)的A。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，寡核苷酸為dA均聚物，其優(yōu)選為17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且具有至少一個(gè)硫代磷酸化核苷酸間鍵(直到并且包括完整的硫代磷酸化主鏈。根據(jù)實(shí)施方案的不同，連接寡核苷酸可以可以由100%A，99%A,98%A，97%A，96%A，95%A，94%A，93%A，92%A,91%A,90%A，85%A，80%A,75%A,70%A，65%A,60%A，55%A,50%A，45%A或45%以下A組成。另一類連接寡核苷酸包含式Cn-Tm-Cp3、其中n為0-100的整數(shù)(例如，3-7),p為0-100的整數(shù)(例如，4-8)和m為0-100的整數(shù)(例如，2-10)。優(yōu)選n與p之和等于或低于m的值，使得C含量為50%,低于50%,低于45°/。，低于40%，低于35%，低于30°/。，低于25%，低于20%，低于15%，低于10%，低于5%或更低。在某些實(shí)施方案中，n在3-7，m在2-10和p在4-8，只要滿足上述百分比。該式的某些種類如圖8中所示。實(shí)例5'(Vr!。C43'(SEQIDNO:1)，5'CJ8C5(SEQIDNO:2)，5'CsLC^(SEQIDNO:6)，5'CJ4C7(SEQIDNO:7)和5'C7T2C83'(SEQIDNO:8)。在某些實(shí)施方案中，連接寡核苷酸飽和免疫刺激CpG基序。該基序可以為曱基化或未甲基化的。在后一種情況中，完整寡核苷酸可以未甲基化的或部分可以為未甲基化的，但至少5'CG3'的C必須未曱基化。未甲基化基序及其對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用廣泛描述在下列文獻(xiàn)中美國(guó)專利，諸如US6,194,388Bl;US6,207,646Bl;US6,239,116Bl;和US6，218，371Bl;和^>布的專利申請(qǐng)，諸如PCT/US98/03678,PCT/US98/10408，PCT/US98/04703和PCT/US99/09863。將這些專利權(quán)和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。如上所述術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"和"核酸"可以互換使用以便指連接或脫i核糖二所述的堿基為A嘧咬(例:，胞嘧咬(c)，胸苷("或丄嘧啶(U))或噪呤(例如，腺嘌呤(A)或鳥(niǎo)嘌呤(G))。因此，該術(shù)語(yǔ)包括DNA和RNA寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)包括多核苷(即減去磷酸的多核苷酸)和任何其它含聚合物的堿基。寡核苷酸可以獲自現(xiàn)存的核酸來(lái)源(例如，基因組或cDNA)，但優(yōu)選合成的(例如，用核酸合成儀產(chǎn)生)。寡核苷酸可以為雙鏈或單鏈。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)寡核苷酸為單鏈時(shí)，它能夠形成形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如通過(guò)在其自身上折回或通過(guò)在其本體自始至終或沿其長(zhǎng)度在選擇片段上與其自身雜交)。因此，盡管這類寡核苷酸的初級(jí)結(jié)構(gòu)可以為單鏈的，其高級(jí)結(jié)構(gòu)可以為雙鏈或三鏈的。寡核苷酸可以具有一定長(zhǎng)度范閨，但它們優(yōu)選等于或低于100個(gè)核苷酸(或堿基)長(zhǎng)度。連接寡核苷酸優(yōu)選不為質(zhì)粒或載體。它們還優(yōu)選不能具有反義活性或本發(fā)明表現(xiàn)出的作用至少不與任何反義活性相關(guān)。寡核苷酸可以具有修飾的主鏈。例如，它們可以包含至少一個(gè)不為磷酸二酯鍵的核苷酸間鍵合。這類鍵可以為硫代磷酸酯鍵。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以具有嵌合主鏈(即由證實(shí)兩種不同類型的核苷酸鍵合組成的主鏈)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"硫代磷酸酯主鏈"意指寡核苷酸的穩(wěn)定糖磷酸主鏈，其中非橋連磷酸氧被至少一個(gè)核普酸間鍵上的硫取代。在一個(gè)實(shí)施方案中非橋連磷酸氧被每個(gè)核苷酸間鍵上的硫取代。寡核苷酸的來(lái)源和制備本發(fā)明的寡核苷酸可以與天然RNA和DNA相比包括各種化學(xué)修飾和取代，包括磷酸二酯核苷間橋，P核糖單元和/或天然核苷堿基(腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤，胞嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知化學(xué)修飾的實(shí)例并且描述在下列文獻(xiàn)中，例如UhlmannE等(1990)90:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs"SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal,Ed,HumanaPress,Totowa，美國(guó)1993;CrookeST等(1996)爿/2/i/Wer尸/wr邊aco/7bx/co/36:107—29;和HunzikerJ等(1995)#od5yi3M7:331-417。本發(fā)明的寡核苷酸可以具有一種或多修飾，其中每種修飾與由天然DNA或RNA組成的相同序列的寡核苷酸位于特定的磷酸二酯核苷間橋和/或特定的P-D-核糖單元和/或特定天然核苷堿基位置上。例如，寡核苷酸可以包括一種或多種修飾，并且其中每種修飾獨(dú)立地選自a)位于核苷的3'和/或5'末端上的磷酸二酯核苷間橋被修飾的核苷橋取代；b)位于核苷的3'和/或5'末端上的磷酸二酯核苷間橋被脫磷酸橋取代；c)來(lái)自糖磷酸主鏈的糖磷酸單元被另一種單元取代；d)D-核糖單元被修飾的糖單元取代；和e)天然核苷堿基被修飾的核苷堿基取代。用于寡核苷酸化學(xué)修飾的更具體的實(shí)例如下。寡核苷酸可以包括修飾的核苷酸間鍵合，諸如上述(a)或(b)中所述的那些。這些修飾的鍵可以部分耐受降解(例如穩(wěn)定)。"穩(wěn)定的寡核苷酸"應(yīng)指相對(duì)耐受體內(nèi)因這類修飾導(dǎo)致的降解(例如通過(guò)外-或內(nèi)-切核酸酶)的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，具有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸可以提供最大活性并且防止寡核苷酸發(fā)生因胞內(nèi)外-或內(nèi)-切核酸酶導(dǎo)致的降解。位于核苷的3'和/或5'末端上的磷酸二酯核苷間橋可以被修飾的核苷間橋取代，其中修飾的核苷間橋例如選自硫代磷酸，二硫代磷酸酯，NRf-氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯(boranophosphate)，a-羥基節(jié)基膦酸酯，磷酸-(d-C21)-0-烷基酯，磷酸-[(C6-C12)芳基-(d-C21)-0-烷基]酯，(C廣Cs)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯鍵，(C7-C12)-a-羥甲基-芳基(例如，披露在WO95/01363中)，其中(C「d2)芳基，(C6-C2。)芳基和(C6-Cu)芳基任選被卣素，烷基，烷氧基，硝基，氰基取代，且其中W和y彼此獨(dú)立為氫，(d-ds)-烷基，(C6-C2。)-芳基，(C「C")-芳基-(CrC8)-烷基，優(yōu)選氫，(C廣C8)-烷基，優(yōu)選(d-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或W和R2與攜帶它們的氮一起構(gòu)成包含另一個(gè)選自0,S和N的雜原子的5-6-元雜環(huán)。位于核苷的3'和/或5'末端上的磷酸二酯核苷間橋可以被脫磷酸橋取代(脫磷酸橋披露在，例如UhlmannE和PeymanA的"MethodsinMolecularBiology",Vol.20，"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs",S.Agrawal，Ed.，HumanaPress,Totowa1993，Chapter16，pp.355ff中)，其中脫磷酸橋例如選自脫磷酸橋縮曱醛(formacetal)，3，-硫代縮甲酪，曱基羥基胺，肟，亞甲基二曱基-亞肼基，二亞甲基砜和/或曱硅烷基。(即彼此構(gòu)成糖磷酸單元的D-核糖和磷酸二酯核苷間橋)可以被另一種單元取代，其中另一種單元例如適合于構(gòu)成"嗎啉代-衍生物"寡聚體(例如，如StirchakEP等(1989)腸/e/ch油k17:6129-41中所述)，即，例如，被嗎啉代-衍生物單元取代或構(gòu)成聚酰胺核酸("PNA";例如，如NielsenPE等(1994)"/oco/力gC力咖5:3-7中所述)，即，例如，被PNA主鏈單元，例如被2-氨基乙基甘氨酸取代。寡核苷酸可以具有其它碳水化合物主鏈修飾和取代，諸如具有磷酸基(PH0NA)的肽核酸，鎖定核酸(LNA)和具有帶有烷基連接基或氨基連接基的主鏈部分的寡核苷酸。烷基連接基可以為支鏈或非支鏈的，取代或未被取代的和手性純或外消旋混合物。P-核糖單元或P-0-2'-脫氧核糖單元可以被修飾的糖單元取代，其中修飾的糖單元例如選自P-D-核糖，orD-2'-脫氧核糖，L-2'-脫氧核糖，2'-F-2'-脫氧核糖，2'-F-阿拉伯糖，2'-0-(C廣Cj烷基-核糖，2'-0-甲基核糖，2'-0-(C廣C6)鏈烯基-核糖，2'--核糖，2'-冊(cè)2-2'-脫氧核糖，呋喃木糖，a-阿拉伯呋喃糖，2，4-雙脫氧-p-D-赤型-吡喃己糖和羧酸(例如，描述在Froehler(1992)/h5bc114:8320)和/或開(kāi)鏈糖類似物(例如，描述在Vandendriessche等(1993)7e"s力ei/ro/749:7223)和/或雙環(huán)糖類似物(例如，描述在TarkovM等(1993)HelvChimActa76:481)。在某些實(shí)施方案中，修飾的糖為2M務(wù)飾的核糖。在某些實(shí)施方案中，糖為2'-0-甲基核糖，特別是1或2個(gè)均為通過(guò)磷酸二酯或磷酸二酯-類核苷間鍵連接的核苷酸。核酸還包括取代的嘌呤類和嘧啶類，諸如C-5丙炔嘧啶和7-脫氮雜-7-取代的嘌呤基修飾的堿基。WagnerRW等(1996)A^,S/0"c力/70/14:840-4。嘌呤類和嘧咬類包括，但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶和其它天然和非天然存在的核堿基，取代和未被取代的芳族部分。修飾的堿基為在化學(xué)上不同于一般在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的堿基，諸如T,C，G,A和U，但與天然存在的堿基共有基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，修飾的核苷堿基可以選自次黃嘌呤，尿嘧啶，二氫尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧咬，4-硫尿嘧咬，5-氨基尿嘧啶，5-(d-C6)-烷基尿嘧咬，5-(C廣C6)-鏈烯基尿嘧啶，5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶，5-(羥基甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羥基胞嘧啶，5-(d-C6)-烷基胞嘧啶，5-(C廣C6)-鏈烯基胞嘧啶，5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤，2，4-二氨基-噤呤，8-氮雜嘌呤，取代的7-脫氮雜噤呤，優(yōu)選7-脫氮雜-7-取代的和/或7-脫氮雜-8-取代的噪呤，5-羥基甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，例如，N4-乙基胞嘧啶，5-羥基脫氧胞苷，5-羥基曱基脫氧胞普，N4-烷基脫氧胞普，例如，N4-乙基脫氧胞苷，6-硫代脫氧鳥(niǎo)苷和硝基吡咯的脫氧核糖核苷，C5-丙炔基嘧啶和二氨基嘌呤，例如，2，6-二氨基嘌呤，肌苷，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黃嘌呤或天然核苷堿基的其它修飾物。該目錄的含義為典型的，但并不解釋為起限定作用。在本文所述的具體式子中，可以摻入修飾的堿基。例如，胞嘧啶可以被修飾的胞嘧啶取代。本文所用的修飾的胞嘧啶為胞嘧啶的天然存在的或非天然存在的嘧啶堿基類似物，其可以取代該堿基，但不會(huì)損害寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾的胞嘧啶包括，但不限于5-取代的胞嘧咬(例如，5-甲基-胞嘧啶，5-氟-胞嘧啶，5-氯-胞嘧啶，5-溴-胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-羥基-胞嗜啶，5-羥曱基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶和未被取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如，N4-乙基-胞嘧啶)，5-氮雜-胞嘧啶，2-巰基-胞嘧啶，異胞嘧啶，假-異胞嘧啶，具有稠合環(huán)系的胞嘧啶類似物(例如，N，『-丙烯胞嘧咬或汾噍喚)和尿嘧咬及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶，5-溴-尿嘧啶，5-溴乙烯基-尿嘧啶，4-硫-尿嘧啶，5-羥基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。優(yōu)選胞嘧啶中的某些包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟-胞嘧啶，5-羥基-胞嘧啶，5-羥曱基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，胞嘧啶堿基被通用堿基(例如，3-硝基吡咯，P-堿基)，芳族環(huán)系(例如，氟苯或二氟苯)或氬原子(dSpacer)取代。作為另一個(gè)實(shí)例，鳥(niǎo)噤呤可以被修飾的鳥(niǎo)嘌呤堿基取代。本文所物，它可以取代該堿基，但不會(huì)損害寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾的鳥(niǎo)嘌呤包括，但不限于7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤，7-脫氮雜-7-取代的鳥(niǎo)噪呤(諸如7-脫氮雜-7-(C2-C6)炔基鳥(niǎo)噪呤)，7-脫氮雜-8-取代的鳥(niǎo)嘌呤，次黃嘌呤，N2-取代的鳥(niǎo)噪呤(例如，N2-甲基-鳥(niǎo)嘌呤)，5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2，7-二酮，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺噪呤，取代的腺嘌呤(例如，N6-甲基-腺噪呤，8-氧代-腺嘌呤)，8-取代的鳥(niǎo)噪呤(例如，8-羥基鳥(niǎo)嘌呤和8-溴鳥(niǎo)嘌呤)和6-硫鳥(niǎo)嘌呤。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)嘌呤堿基被通用堿基(例如，4-曱基-吲哚，5-硝基-吲哚和K-堿基)，芳族環(huán)系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑，l-曱基-lH-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)或氫原子(dSpacer)取^R。就本發(fā)明的應(yīng)用而言，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的許多方法中的任一種從頭合成本發(fā)明的寡核苷酸，包括，例如，p-氛基乙基亞磷酰胺法(BeaucageSL等(1981)re"fl力e&加22:1859)或核普H-膦酸酯法(Garegg等(1986)re"a力e&o/zZe〃27:4051-4;FroehlerBC等(1986)iV"c/e/c14:5399-407;Garegg等(1986)7"etra力effro/227:4055—8;Gaffhey等(1988)7e^ra力^/ro/729:2619-22)。這些化學(xué)方法可以通過(guò)商購(gòu)自動(dòng)化核酸合成儀進(jìn)行。這些寡核苷酸稱作合成寡核苷酸。分離的寡核苷酸一般意指從通常實(shí)際結(jié)合的成分中分離的寡核苷酸。作為實(shí)例，分離的寡核苷酸可以為從細(xì)胞，細(xì)胞核，線粒體或染色質(zhì)中分離的寡核苷酸。可以使用應(yīng)用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學(xué)的自動(dòng)化技術(shù)合成修飾的主鏈，諸如硫代磷酸。例如，可以如美國(guó)專利US4，469，863中所述制備芳基-和烷基-膦酸酯類；并且可以通過(guò)自動(dòng)化固相合成，使用商購(gòu)試劑制備烷基磷酸三酯類(其中帶電荷的氧部分如美國(guó)專利US5，023，243和歐洲專利EP092，574中所述烷基化)。描述了制備其它DNA主鏈修飾和取代的方法(例如，UhlmannE等(1990)iw90:544;GoodchildJQ990)A/ocon乂"g"eC力e/z1:165)。分離的在某些實(shí)施方案中，分離了TLR7/8配體和/或連接寡核苷酸。分離的配體或寡核苷酸為基本上純的或不含其它一般在天然中或在體內(nèi)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)達(dá)到實(shí)際應(yīng)用程度和適合于其指定應(yīng)用的物質(zhì)的配體或寡核苷酸。特別地，配體或寡核苷酸為足夠純的并且足以不含細(xì)胞的其它生物成分，以便，例如用于生產(chǎn)藥物制劑。因?yàn)榭梢詫⒎蛛x的配體或寡核苷酸可以與藥學(xué)上可接受的載體混合在藥物制劑中，所以配體或寡核苷酸可以僅占制劑重量的小百分比。盡管如此，但是分離配體或寡核苷酸，使得將其基本上從它在生物相同中結(jié)合的物質(zhì)中分離。綴合物本文所用的術(shù)語(yǔ)"級(jí)合物"意指通過(guò)任何生理化學(xué)相互作用直接或間接彼此連接的兩種或多種組成部分的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物為通過(guò)共價(jià)鍵合直接或間接彼此連接的兩種或多種組成部分的組合。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了包括TLR配體和連接寡核苷酸的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)共價(jià)鍵形成綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物包含連接基。綴合物可以包括本發(fā)明的一種或多種連接寡核苷酸和一種或多種TLR7/8配體?？蛇x擇地或另外。綴合物可以包括一種或多種其它分子，包括，但不限于抗原或其它藥物。圖13-15例示了這類綴合物的許多特征，包括配體和寡核苷酸的連接點(diǎn)和連接基在促進(jìn)這類結(jié)合中的任選的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物為連接寡核苷酸與某些TLR7特異性配體，諸如但不限于immunosine或洛索立賓的綴合物。連接寡核苷酸可以為，但不限于長(zhǎng)度在8-20，優(yōu)選IO-20且更優(yōu)選14-18個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的聚(dT)寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，特別是如果連接寡核苷酸自身為免疫刺激性的或通過(guò)TLR9傳導(dǎo)信號(hào)，那么不包括連接寡核苷酸與某些TLR7/8配體，諸如咪唑并喹啉類和C8-取代的鳥(niǎo)苷的綴合物。圖13A-C例示了可以用于結(jié)合方法的immunosine的結(jié)構(gòu)及其兩種單體變體。圖13B中所示的變體可以與寡核苷酸在內(nèi)部位置或3'末端上結(jié)合。因此，可以存在這些與寡核苷酸連接的變體中的一種或多種。圖13C中所示的變體可以與寡核苷酸在5'末端上結(jié)合。圖14例示了使用連接基使immunosine與寡核苷酸結(jié)合。圖15例示了連接基和/或寡核苷酸可以結(jié)合為R-848，CL-029和immunosine上的連接點(diǎn)。本發(fā)明的綴合物可以包含l，2,3，4，5或5個(gè)以上連接基，或可選擇地，它們可以不含連接基。綴合物的實(shí)例為聚(dT)纊L廣IM(其中L表示連接基且IM表示immunosine且下標(biāo)表示綴合物中每個(gè)單元的數(shù)量)(SEQIDNO:9)。另一個(gè)實(shí)例為IM-L廣(dT)"(SEQIDNO:10)。這些實(shí)例之間的差異在于在3'末端或5'末端上配置immunosine和連接基。連接基可以為寡核苷酸上的任何反應(yīng)部分連接，包括，但不限于主鏈磷酸基團(tuán)或糖羥基。例如，可以將它們通過(guò)磷酸二酯，硫代磷酸，甲基膦酸酯和/或酰胺鍵引入。連接基實(shí)際上可以為非核苷酸。它們包括，例如，堿性殘基(dSpacer)，寡乙二醇，諸如三甘醇(間隔基9)或六乙二醇(間隔基18)或烷-二醇，諸如丁二醇。連接基可以通過(guò)磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵彼此結(jié)合。其它連接基為烷氨基連接基，諸如C3，C6，C12氨基連接基，且還有烷基巰基連接基，諸如C3或C6巰基連接基。還可以在一種綴合物中使用不同類型的連接基。寡核苷酸可以被芳族殘基連接，這些殘基可以進(jìn)一步被烷基或取代的烷基取代。寡核苷酸還可以包含二重或三重單元，這使得一種或不同類型的多種配體與寡核苷酸結(jié)合。寡核苷酸還可以包含由肽修飾試劑或寡核苷酸修飾試劑產(chǎn)生的連接基。此外，它們可以包含一種或多種通過(guò)肽(酰胺)鍵連接的天然或非天然氨基酸殘基。通過(guò)建立的方法合成不同的寡核苷酸并且它們可以在固相合成過(guò)程中在線彼此連接?？蛇x擇地，可以在合成單個(gè)單元后使它們彼此連接。免疫應(yīng)答在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為Thl-類免疫應(yīng)答。本文所用的術(shù)語(yǔ)"Thl-類"意指具有Thl免疫應(yīng)答的特性特征。Thl免疫應(yīng)答在特征上可以包括^"導(dǎo)某些細(xì)胞因子，諸如IFN，，IgG2a免疫球蛋白的分泌(小鼠中)和巨噬細(xì)胞活化。術(shù)語(yǔ)"Thl-類"與術(shù)語(yǔ)"Th2-類"相反，"Th2-類"意指具有如下所述的Th2免疫應(yīng)答的特性特征。Thl-類免疫應(yīng)答可以包括某些特征在于與Thl免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子中的任一種的表達(dá)，包括IFN-a，IFN-P，IFN-y,TNF-a,IL-12,IL-18，IP-10及其任何組合。認(rèn)為Thl免疫應(yīng)答和Th2免疫應(yīng)答為相反調(diào)節(jié)的。在某些實(shí)施方案中，Thl-類免疫應(yīng)答可以包括某些Th2相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-4，IL-5，IL-10和IL-13的抑制。Thl-類免疫應(yīng)答可以包括某些抗體同種型的表達(dá)，包括(在小鼠中)IgG2a，與或不與某些Th2相關(guān)抗體同種型的抑制，包括IgE和(在小鼠中)IgGl。在一個(gè)實(shí)施方案中，Thl-類免疫應(yīng)答為Thl應(yīng)答。Th2-類免疫應(yīng)答可以包括某些特征在于與Th2免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子中的任一種的表達(dá)，包括IL-4,IL-5，IL-IO，IL-13及其任何組合。在某些實(shí)施方案中，Th2-類免疫應(yīng)答可以包括某些Thl相關(guān)細(xì)胞因子的抑制。Th2-類免疫應(yīng)答可以包括某些抗體同種型的表達(dá)，包括IgE和(在小鼠中)IgGl，與或不與某些Thl相關(guān)抗體同種型的抑制，包括(在小鼠中)IgG2a，在一個(gè)實(shí)施方案中，Th2-類免疫應(yīng)答為Th2應(yīng)答。因此，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中提供了誘導(dǎo)受試者Thl-類免疫應(yīng)答的方法。誘導(dǎo)Thl-類免疫應(yīng)答包括增加或增強(qiáng)Thl-類免疫應(yīng)答。該方法包括對(duì)受試者給予有效量的本發(fā)明TLR7/8配體和連接寡核苷酸以便誘導(dǎo)受試者Thl-類免疫應(yīng)答的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者Th2-類免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對(duì)受試者給予有效量的本發(fā)明TLR7/8配體和連接寡核苷酸以便抑制受試者Th2-類免疫應(yīng)答的步驟。這類方法可以特別應(yīng)用于治療具有特征在于以Th2特性占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答的疾病或處于其風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。這類疾病包括，但不限于過(guò)敏反應(yīng)和津喘。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答包括免疫細(xì)胞活化的細(xì)胞表面標(biāo)記，諸如CD25，CD80，CD86和CD154的增量調(diào)節(jié)。用于測(cè)定這類標(biāo)記的細(xì)胞表面表達(dá)的方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括FACS分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了測(cè)定細(xì)胞或細(xì)胞群中的免疫應(yīng)答，細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)至少一種，并且在某些情況中，僅優(yōu)選TLR7，TLR8或TLR9中的一種。細(xì)胞天然表達(dá)TLR或可以操縱它以便通過(guò)將合適的TLR表達(dá)栽體導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)TLR。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群作為外周血單核細(xì)胞(PBMC)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群作為表達(dá)TLR的細(xì)胞系獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群作為使用TLR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群作為使用TLR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。此外，為了測(cè)定細(xì)胞或細(xì)胞群中的免疫應(yīng)答，可以便利地將對(duì)TLR的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有應(yīng)答的(即受其調(diào)節(jié)的)細(xì)胞報(bào)道構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，這類報(bào)道基因?yàn)樵贜F-KB啟動(dòng)子控制下配置的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該啟動(dòng)子控制下配置的基因?yàn)闊晒馑孛?，不過(guò)，可以使用其它報(bào)道基因，包括綠色熒光蛋白(GFP)，P-半乳糖苷酶，堿性磷酸酶等。在適當(dāng)活化的條件下，作為實(shí)例，表達(dá)焚光素酶報(bào)道構(gòu)建體并且它發(fā)射可以使用發(fā)光計(jì)定量測(cè)定的可檢測(cè)光信號(hào)。這些和其它報(bào)道構(gòu)建體為商購(gòu)的。在其它實(shí)施方案中，可以根據(jù)細(xì)胞因子，諸如IFN-a，TNF-a，IL-12，IFN，等的產(chǎn)生(mRNA或蛋白質(zhì))或分泌測(cè)定TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述的實(shí)例表示了這些測(cè)定類型。本發(fā)明還關(guān)注檢測(cè)TLR活化的不含細(xì)胞的方法的應(yīng)用。本發(fā)明還包括誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答(如本文更詳細(xì)描述)和非特異性先天免疫性活化和對(duì)感染性攻擊的廣譜耐受性的方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)抗原非特異性先天免疫性活化意指非B細(xì)胞的免疫細(xì)胞活化，包括NK細(xì)胞，T細(xì)胞或其它可以以不依賴抗原的方式起反應(yīng)的免疫細(xì)胞或這些細(xì)胞的某些組合。誘導(dǎo)對(duì)感染性攻擊的廣i普耐受性，因?yàn)槊庖呒?xì)胞為活性形式并且引起對(duì)任何侵入化合物或微生物的反應(yīng)。這些細(xì)胞不一定對(duì)特定抗原特異性觸發(fā)。這特別用于生物戰(zhàn)爭(zhēng)和其它上述環(huán)境，諸如旅行者。受試者本文所用的受試者意指人或非人的脊推動(dòng)物。非人脊推動(dòng)物包括家畜動(dòng)物，陪伴動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。非人受試者還特別包括非人的靈長(zhǎng)類以及嚙齒動(dòng)物。非人受試者還特別包括，但不限于雞，馬，牛，豬，山羊，狗，貓，豚鼠，倉(cāng)鼠，貂和兔。本文所用的處于發(fā)生疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試者意指已知或懷疑接觸病原體的受試者，已知所述的病原體導(dǎo)致疾病或與之相關(guān)，或已知或懷疑易感發(fā)生疾病(例如，疾病家族史的遺傳標(biāo)記或疾病家族史)。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了治療具有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者的方法。本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者給予有效量的本發(fā)明組合物以便治療該受試者。本文所用的免疫系統(tǒng)缺陷意指免疫系統(tǒng)支持對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的能力異常下降。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫系統(tǒng)缺陷為疾病或紊亂，其中受試者的免疫系統(tǒng)無(wú)法在正常能力范圍內(nèi)起作用，或其中它可以用于加強(qiáng)受試者的免疫應(yīng)答，例如消除受試者腫瘤或癌癥或感染。本文所用的具有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者意指存在受試者免疫系統(tǒng)支持例如對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的能力下降的受試者。具有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者包括獲得性免疫缺陷的受試者和具有先天性免疫缺陷的受試者。具有獲得性免疫缺陷的受試者包括，但不限于具有慢性炎性疾病的受試者，具有慢性腎功能不全或腎衰竭的受試者，具有感染的受試者，具有癌癥的受試者，接受免疫抑制藥的受試者，接受其它免疫抑制治療的受試者和具有營(yíng)養(yǎng)不良的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有抑制的CD4+T-細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有人免疫缺陷病毒(HIV)感染或具有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。本發(fā)明該方面的方法由此為有更劇烈免疫應(yīng)答需要的受試者提供了加強(qiáng)免疫應(yīng)答或加強(qiáng)支持免疫應(yīng)答的能力的方法本文所用的抑制應(yīng)指比正常情況下的結(jié)果或效果下降。本文所用的涉及疾病或疾患的治療應(yīng)指介入這類疾病或疾患以便預(yù)防或減緩疾病或疾患發(fā)生，預(yù)防或減緩起進(jìn)展，組織其進(jìn)展或消除它們。例如，治療癌癥包括預(yù)防癌癥發(fā)生(例如，預(yù)防癌前期狀態(tài))，減輕癌癥的癥狀和/或抑制建立的癌癥生長(zhǎng)。^^患本發(fā)明涉及治療得益于抑制和/或誘導(dǎo)某些TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病。本文所用的與TLR7介導(dǎo)的免疫刺激或免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病意指存在與TLR7信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的免疫活化和這類活化有害的受試者的任何疾病或其它疾患。這類疾患一般涉及TLR7信號(hào)傳導(dǎo)活化作為對(duì)接觸TLR7配體的應(yīng)答。本文所用的與TLR8介導(dǎo)的免疫刺激或免疫應(yīng)答相關(guān)的疾患意指存在與TLR8信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的免疫活化和這類活化有害的受試者的任何疾病或其它疾患。這類疾患一般涉及TLR8信號(hào)傳導(dǎo)活化作為對(duì)接觸TLR8配體的應(yīng)答。本文所用的與TLR9介導(dǎo)的免疫刺激或免疫應(yīng)答相關(guān)的疾患意指存在與TLR9信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的免疫活化和這類活化有害的受試者的任何疾病或其它疾患。這類疾患一般涉及TLR9信號(hào)傳導(dǎo)活化作為對(duì)接觸TLR9配體的應(yīng)答。感染本發(fā)明可以用于直治療諸如感染治療疾患。感染意指受試者存在活動(dòng)的胞內(nèi)或胞外微生物異常集合或群體的任何疾患。這類微生物對(duì)受試者而言可以為內(nèi)源性的，或它們對(duì)受試者而言可以為外源性的。具有感染的受試者為具有受試者因表淺，局部或全身受到感染性微生物侵入或受試者天然存在的內(nèi)源性微生物異常增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)產(chǎn)生的病癥。感染性微生物可以為如上所述的病毒，細(xì)菌，真菌或寄生蟲(chóng)。各種類型的微生物可以導(dǎo)致感染，包括為細(xì)菌的微生物，為病毒的微生物，為真菌的微生物和為寄生蟲(chóng)的微生物。細(xì)菌為通過(guò)二分裂無(wú)性繁殖的單細(xì)胞生物。它們基于其形態(tài)，染色反應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)和代謝要求，抗原結(jié)構(gòu)，化學(xué)組成和遺傳同源性分類和命名?？梢詫⒓?xì)菌基于其形態(tài)種型分類為三族:球形(球菌)，直-桿形(桿狀菌)和彎曲或螺旋桿形(弧菌屬(vibrio)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)，螺旋菌屬(spirillum)和螺旋體(spirochaete))。細(xì)菌還更通常基于其染色反應(yīng)分類為兩類生物，即革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏意指通常在微生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的染色方法。革蘭氏陽(yáng)性生物在染色操作后保持染色并且顯示出深紫色。革蘭氏陰性生物不保持染色，但吸收復(fù)染劑且由此顯示出粉紅色。感染性細(xì)菌包括，但不限于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。革蘭氏陽(yáng)性菌包括，但不限于巴斯德氏菌屬(Pasteurella)種類，葡萄球菌屬(Staphylococci)種類和鏈球菌屬(Streptococcus)種類。革蘭氏陰性菌包括，但不限于大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)，假單胞菌屬(Pseudomonas)種類和沙門菌屬(Salmonella)種類。感染性細(xì)菌的具體實(shí)例包括，但不限于幽門螺桿菌(Helicobacterpyloris)，布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)，侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophi1ia)，分枝桿菌(Mycobacteria)種類(例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，鳥(niǎo)分枝桿菌(M.avium)，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulars),堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)，戈登分枝桿菌(M.gordonae)),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae),腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，酉良酒膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(A族鏈球菌屬)，無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(B族鏈球菌屬)，鏈球菌屬(綠色鏈球菌族(viridansgroup))，糞腸球菌(Streptococcusfaecalis)，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)，鏈球菌屬(厭氧種類)，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，致病性彎曲桿菌屬的種類(Campylobactersp.)，腸球菌屬的種類(Enterococcussp.)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae),炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)，白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，棒桿菌屬的種類(Corynebacteriumsp.)，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae),產(chǎn)氣夾膜梭菌(Clostridiumperfringens),破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，多殺巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)，擬桿菌屬的種類(Bacteroidessp.)，具梭核桿菌(Fusobacteriumnucleatum),念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)，徹白螺旋體(Treponemapallidum),極細(xì)密螺旋體(Treponemapertenue)，鉤端螺旋體屬(Leptospira)，立克次體屬(Rickettsia)和衣氏放線菌(Actinomycesisraelii)。細(xì)菌包括，但不限于巴斯德氏菌屬種類，葡萄球菌種類，鏈球菌屬種類，大腸埃希氏桿菌，假單胞菌屬種類和沙門菌屬種類。感染性細(xì)菌的具體實(shí)例包括，但不限于幽門螺桿菌，布氏疏螺旋體，侵肺軍團(tuán)菌，分枝桿菌種類(例如結(jié)核分枝桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌，戈登分枝桿菌)，金黃色葡萄球菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，釀酒膿鏈球菌(A族鏈球菌屬)，無(wú)乳鏈球菌(B族鏈球菌屬)，鏈球菌屬(綠色鏈球菌族)，糞腸球菌，牛鏈球菌，鏈球菌屬(厭氧種類)，肺炎鏈球菌，致病性彎曲桿菌屬的種類，腸球菌屬的種類，流感嗜血菌，炭疽芽孢桿菌，白喉棒桿菌，棒桿菌屬的種類，豬紅斑丹毒絲菌，產(chǎn)氣夾膜梭菌，破傷風(fēng)梭菌，產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，多殺巴斯德氏菌，擬桿菌屬的種類，具梭核桿菌，念珠狀鏈桿菌，徹白螺旋體(Treponemapal1idum)，極細(xì)密螺旋體，鉤端螺旋體屬，立克次體屬和衣氏放線菌。病毒為一般包含核酸核心和蛋白質(zhì)外殼，但無(wú)法獨(dú)立生存的生物體的小感染病原體。病毒還可以釆取缺乏蛋白質(zhì)的感染性核酸的形式。病毒不能在沒(méi)有它可以在其中復(fù)制的活細(xì)胞存在下存活。病毒通過(guò)胞吞或DNA(噬菌體)直接注射和繁殖進(jìn)入特定活細(xì)胞而導(dǎo)致疾病。繁殖的病毒隨后可以釋放并且感染額外的細(xì)胞。某些病毒為含DNA的病毒，而其它病毒為含RNA的病毒。在某些方面中，本發(fā)明還涉及治療疾病，其中在疾病進(jìn)程中涉及阮病毒，諸如，例如牛海綿狀腦病(即瘋牛病，BSE)或動(dòng)物綿羊瘋癢病感染或人克-雅病。病毒包括，但不限于腸病毒(包括，但不限于細(xì)小RNA病毒科(picornaviridae)病毒,諸如脊號(hào)灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒，艾柯病毒)，輪狀病毒，腺病毒，肝炎病毒。已經(jīng)在人中發(fā)現(xiàn)的具體實(shí)例包括，但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，諸如HIV-1(也稱作HTLV-III,LAV或HTLV-ni/LAV或HIV-III;和其它分離物，諸如HIV-LP;細(xì)小RNA病毒科(例如，細(xì)小RNA病毒科，甲型肝炎病毒；腸病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒)；Calciviridae(例如，導(dǎo)致胃腸炎的菌林)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒，風(fēng)滲病毒)；黃病毒科(Flaviviridae)(例如，登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，皰滲性口腔炎病毒，狂犬病病毒)；纖絲病毒科(Filoviridae)(例如，埃波拉病毒)；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻滲病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼安病毒科(Bunyaviridae)(例如，漢坦病毒，布尼病毒，白蛉病毒和內(nèi)羅畢綿羊病毒(Nairoviruses));沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸孤病毒，環(huán)狀病毒(orbiviurses)和輪狀病毒)；雙RNA病毒科(Birnaviridae);嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(Parvoviridae)(細(xì)小病毒屬(parvoviruses))5乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；皰滲病毒科(Herpesviridae)(單純皰滲病毒(HSV)l和2，水痘帶狀皰滲病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV));痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬痘病毒)；和未分類病毒(例如，海綿樣腦病病原，5肝炎病原(認(rèn)為乙型肝炎病毒伴隨體)，非曱非乙型肝炎病原體(l類=體內(nèi)傳播；2類=非腸道傳播(即丙型肝炎)；諾瓦克病毒和相關(guān)病毒和星狀病毒)。已經(jīng)在人中發(fā)現(xiàn)的實(shí)例包括，但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，(例如，人免疫缺陷病毒，諸如HIV-1(也稱作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III;和其它分離物，諸如HIV-LP;細(xì)小RNA病毒科(例如，細(xì)小RNA病毒科，甲型肝炎病毒；腸病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒)；Calciviridae(例如，導(dǎo)致胃腸炎的菌林)；披膜病毒科(例如，馬腦炎病毒，風(fēng)滲病毒)；黃病毒科(例如，登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病病毒)；冠狀病毒科(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(例如，皰滲性口腔炎病毒，狂犬病病毒)；纖絲病毒科(例如，埃波拉病毒)；副粘液病毒科(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻滲病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼安病毒科(例如，漢坦病毒，布尼病毒，白蛉病毒和內(nèi)羅畢綿羊病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如，呼腸孤病毒，環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(細(xì)小病毒屬)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)1和2，水痘帶狀皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV));痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；虹膜病毒科(例如，非洲豬瘟病毒)；和未分類病毒(例如，海綿樣腦病病原，5肝炎病原(認(rèn)為乙型肝炎病毒伴隨體)，即丙型肝炎；諾瓦克病毒和相關(guān)病毒和星狀病毒)。真菌為真核生物體，其中僅少數(shù)導(dǎo)致脊推哺乳動(dòng)物感染。因?yàn)檎婢鸀檎婧松矬w，所以它們?cè)诖笮?，結(jié)構(gòu)組織，生命周期和繁殖基質(zhì)方面明顯不同于原核細(xì)菌。一般基于形態(tài)特征，繁殖方式和培養(yǎng)特征分類真菌。盡管真菌可以導(dǎo)致受試者不同類型的疾病，諸如吸入真菌抗原后的呼吸系統(tǒng)過(guò)敏反應(yīng)，因攝入毒性物質(zhì)，諸如毒傘(Amanitaphalloides)毒素和毒蘑菇產(chǎn)生的毒萆肽和曲霉菌屬(aspergillus)種類產(chǎn)生的黃曲霉毒素類導(dǎo)致的真菌中毒，但是并非所有的真菌均導(dǎo)致感染性疾病。感染性真菌可以導(dǎo)致全身或表淺感染。原發(fā)性全身感染可以發(fā)生在正常健康受試者中，而機(jī)會(huì)致病菌感染最常見(jiàn)于免疫受損受試者。導(dǎo)致原發(fā)性全身感染的最常見(jiàn)的真菌病原體包括芽生菌屬(Blastomyces)，球孢菌屬(Coccidioides)和組織胞漿菌屬(Histoplasma)。在免疫受損或免疫抑制受試者中導(dǎo)致機(jī)會(huì)致病菌感染的常見(jiàn)真菌包括，但不限于白色假絲酵母(Candidaalbicans)，新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)和各種曲霉菌屬的種類。全身真菌感染為內(nèi)臟器官的侵入性感染。生物體通常通過(guò)非，胃腸道或靜脈內(nèi)導(dǎo)管進(jìn)入體內(nèi)。這些類型的感染可以因原發(fā)性致病真菌或機(jī)會(huì)真菌導(dǎo)致。表淺真菌感染包括真菌在外表面上生長(zhǎng)，但不侵入體內(nèi)組織。典型的表淺真菌感染包括涉及皮膚，毛發(fā)或指甲的皮膚真菌感染。與真菌感染相關(guān)的疾病包括曲霉菌病，芽生菌病，念珠菌病，著色真菌病，球孢子菌病，隱球菌病，真菌性眼感染，真菌性毛發(fā)，指曱和皮膚感染，組織胞漿菌病，羅伯芽生菌病，馬杜拉分枝菌病，耳真菌病，副球孢子菌病，彌散性馬尼弗氏青霉(Penicilliummarneffei)，暗色絲狀菌病，鼻孢子菌病，孢子絲菌病和接合菌病。真菌包括酵母和霉菌。真菌的實(shí)例包括，但不限于曲霉菌屬的種類，包括煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)，假絲酵母屬的種類(Candidaspp,)，包括白色假絲酵母，粗球孢菌(Coccidioidesimmitis),新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)，夾膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatuffl)，卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystiscarinii)，根毛霉菌屬的種類(Rhizomucorspp.)和根霉菌屬的種類(Rhizopusspp.)。寄生蟲(chóng)為依賴于其它生物體以便存活的生物體，且由此必須進(jìn)入或感染另一種生物體以持續(xù)其生命周期。感染的生物體，即宿主為寄生蟲(chóng)提供營(yíng)養(yǎng)和棲息地。盡管在其最廣泛的含義上，術(shù)語(yǔ)寄生蟲(chóng)可以包括所有的病原體(即細(xì)菌，病毒，真菌，原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng))，但是一般而言，該術(shù)語(yǔ)用于僅指原生動(dòng)物，蠕蟲(chóng)和外寄生的節(jié)肢動(dòng)物(例如，蜱，蜱登)。原生動(dòng)物為可以在胞內(nèi)和胞外，特別是在血液，腸到或組織的胞外基質(zhì)中復(fù)制的單細(xì)胞生物體。蠕蟲(chóng)為幾乎始終在胞外的多細(xì)胞生物體(除外毛線蟲(chóng)屬的種類(Trichinellaspp.))。蠕蟲(chóng)一般需要從第一寄主脫離并且傳播入第二寄主以便復(fù)制。與上述這些類型相反，外寄生節(jié)肢動(dòng)物與宿主身體外表面形成寄生關(guān)系。寄生蟲(chóng)包括胞內(nèi)寄生蟲(chóng)和專門的胞內(nèi)寄生蟲(chóng)。寄生蟲(chóng)的實(shí)例包括，但不P艮于惡性癡原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)，卵形癡原蟲(chóng)(Plasmodiumovale),三日癡原蟲(chóng)(Plasmodiummalariae)，間曰癡原蟲(chóng)(Plasmdodiumvivax)，Plasmodiumknowlesi,果氏巴貝蟲(chóng)(Babesiamicroti)，Babesiadivergens，克魯斯錐蟲(chóng)(Trypanosomacruzi)，鼠弓形體(Toxoplasmagondii)，Trichinellaspiralis,Leishmaniamajor,杜氏利什更原蟲(chóng)(Leishmaniadonovani)，巴西利什曼原、蟲(chóng)(Leishmaniabraziliensis)，熱帶矛J什曼原、蟲(chóng)(Leishmaniatropica),岡比亞錐蟲(chóng)(Trypanosomagambiense)，羅德西亞錐蟲(chóng)(Trypanosomarhodesiense)和曼森血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni)。其它感染性生物體(即原生生物)包括瘧原蟲(chóng)屬的種類(Plasmodiumspp.)，諸如惡性癡原蟲(chóng)，三日癡原蟲(chóng)，卵形瘧原蟲(chóng)和間日痗原蟲(chóng)；和鼠弓形體。血液傳染的和/或血液傳染包括瘧原蟲(chóng)屬的種類，果氏巴貝蟲(chóng)(Babesiamicroti)，Babesiadivergens，Chlamydiatrachomatis,熱帶利什曼原蟲(chóng)，利什曼原蟲(chóng)屬的種類(Leishmaniaspp.)，巴西利什曼原蟲(chóng)，杜氏利什曼原蟲(chóng)，岡比亞錐蟲(chóng)和羅德西亞錐蟲(chóng)(非洲昏睡病)，克魯斯錐蟲(chóng)(恰加斯病)和鼠弓形蟲(chóng)。文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛描述了其它醫(yī)學(xué)上相關(guān)的微生物，例如，參見(jiàn)C.G.AThomas,#/cro6/o/o^r,BailliereTindall,GreatBritain1983，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。癌癥本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了治療具有癌癥的受試者的方法。具有癌癥的受試者為具有可檢測(cè)到的癌細(xì)胞的受試者。癌癥可以為惡性或非惡性癌癥。本文所用的"癌癥"意指干擾身體器官和系統(tǒng)的正常功能作用的細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)。從其原始位置遷移并且種植在重要器官的癌癥最終可以通過(guò)使受侵害器官功能退化導(dǎo)致受試者死亡。血癌，諸如白血病能夠過(guò)度竟?fàn)幨茉囌叩恼Ｔ煅?，由此造成造血衰?貧血，血小板減少和嗜中性白血球減少癥的形式)而最終導(dǎo)致死亡。不同于原發(fā)性腫瘤位置，轉(zhuǎn)移為因癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散至身體其它部分產(chǎn)生的癌細(xì)胞區(qū)。在診斷原發(fā)性腫瘤塊時(shí)，可以監(jiān)測(cè)受試者的轉(zhuǎn)移灶的存在。通常可以通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)用核磁共振成像(MRI)掃描，計(jì)算機(jī)X線斷層攝影(CT)掃描，血液和血小板計(jì)數(shù)，肝功能研究，胸透和固掃描以及監(jiān)測(cè)特定癥狀來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶。癌癥包括，但不限于基底細(xì)胞癌，膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌癥；乳腺癌；乳腺癌；絨毛膜癌；結(jié)腸和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌；子宮內(nèi)膜癌；食管癌；眼癌；頭頸癌；上皮內(nèi)腫瘤；腎癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌(例如，小細(xì)胞和非小細(xì)胞)；淋巴瘤，包括何杰金和非何杰金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌(例如，唇，舌，口腔和咽)；卵巢癌；胰腺癌；胰腺癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；曱狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌以及其它癌，腺癌和肉瘤。自身免疫疾患涉及先天性免疫應(yīng)答或Thl-類免疫應(yīng)答的疾患包括炎癥，急性和慢性同種異體移植排斥，移植物抗宿主病(GvHD)，某些自身免疫疾病和膿毒病?？紤]到本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)的對(duì)TLR信號(hào)傳導(dǎo)的選擇性抑制，本發(fā)明可以用于治療這類疾患。自身免疫疾病一般可以分類為抗體介導(dǎo)的，T-細(xì)胞介導(dǎo)的或抗體介導(dǎo)的和T-細(xì)胞介導(dǎo)的組合。認(rèn)為本發(fā)明的連接0DN和TLR配體的組合用于治療涉及抗體介導(dǎo)的或T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的各種類型的自身免疫性，包括胰島素依賴性(I型)糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和炎性腸病(即克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)。可利用這些自身免疫疾病的動(dòng)物模型并且將它們用于評(píng)價(jià)本發(fā)明組合在這些疾病中的功效。其它自身免疫疾病包括，但不限于斑禿，獲得性血友病，強(qiáng)直性脊柱炎，抗磷脂綜合征，自身免疫性肝炎，自身免疫性溶血性貧血，貝切特綜合征，心肌病，口炎性腹瀉性皮炎，慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)，慢性炎癥性脫髄鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，丘斯綜合征，瘢痕性類天皰瘡，CREST綜合征，冷凝集素疾病，盤狀狼瘡，特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥，纖維肌痛，纖維肌炎，格-巴綜合征，特發(fā)性肺纖維化，特發(fā)性血小板減少性紫癜，IgA腎病，青少年關(guān)節(jié)炎，扁平苔癬，重癥肌無(wú)力，多動(dòng)脈炎，多軟骨炎，多腺體綜合征，皮肌炎，原發(fā)性丙種球蛋白缺乏血癥，原發(fā)性膽汁肝硬化，銀屑病，雷諾現(xiàn)象，賴特綜合征，結(jié)節(jié)病，僵人綜合征，高安關(guān)節(jié)炎(Takayasuarthritis)，顳颥動(dòng)脈/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，眼色素層炎，血管炎和白癲風(fēng)。在幾種自身免疫疾病中，通常觀察到針對(duì)自身抗原的抗體。例如，就系統(tǒng)性紅斑狼掩而言，描述了單鏈和雙鏈DNA或RNA的自身抗體。VallinH等(1999)//邊邁""o/163:6306-13;HoetRM等(1999)//邊層0/163:3304-12;venVenrooij(1990)JClinInvest86:2154-60。在自身免疫患者血清中發(fā)現(xiàn)的自身抗體水平與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。例如，在人SLE中產(chǎn)生的自身抗體的模式提示完整大分子顆粒，諸如含RNA-或DNA的復(fù)合物自身可以為免疫原性的，并且抗核酸抗體可以由此產(chǎn)生。LotzM等(1992)A/o/ie;16:127;MohanC等(1993)/177:1367-81。例如，這類從細(xì)胞凋王細(xì)胞或存在于自身免疫患者血清中的含DNA或RM的微生物中釋放的DM或RM可以導(dǎo)致促成自身免疫疾病的炎癥。FatenejadS(1994)///mzzu/zo/152:5523-31;MalmegrimKC等(2002)"rAsoc/4:706-12;Newkirk匪等(200DJ"力r"/"es3:253-8。實(shí)際上，可以從誘導(dǎo)通過(guò)認(rèn)為促成組審免疫疾病發(fā)生的IFN-a分泌控制的有效免疫應(yīng)答的SLE血清中鑒定含CpG的序列。MagnussonM等(2001)Sca/zf////n肌/力o/54:543-50;R6nnblomL等(2001)/加層194:F59-63。此外，可以鑒定的抗RNA抗體表位并且其由富含G，U的序列組成。TsaiDE等(1992)Jcfld美萄89:8864-8;TsaiDE等(1993)J/膽加/150:1137-45,過(guò)敏反應(yīng)"過(guò)敏性疾患"或"過(guò)敏反應(yīng)"意指對(duì)物質(zhì)(過(guò)敏原)的獲得性超敏反應(yīng)。"具有過(guò)敏性疾患的受試者"應(yīng)指目前發(fā)生或預(yù)先已經(jīng)發(fā)生作為對(duì)過(guò)敏原應(yīng)答的過(guò)敏反應(yīng)的受試者。過(guò)敏性疾患包括，但不限于濕療，過(guò)敏性鼻炎或鼻炎，花粉癥，過(guò)敏性結(jié)膜炎，支氣管哮喘，蕁麻滲(urticaria)(蕁麻滲(hives))和食物過(guò)敏，其它特應(yīng)性疾患，包括特應(yīng)性皮炎；過(guò)敏反應(yīng)；藥物過(guò)敏；和血管性水腫。過(guò)敏反應(yīng)一般為從對(duì)過(guò)敏原的特定類免疫球蛋白IgE產(chǎn)生抗體相關(guān)的發(fā)作性疾患。IgE介導(dǎo)的對(duì)產(chǎn)花粉植物發(fā)生應(yīng)答也為表現(xiàn)出易感發(fā)生哮喘的因素。如果過(guò)敏原遇到與嗜堿細(xì)胞(血液中循環(huán)的)或肥大細(xì)胞(分散遍在于實(shí)體組織中的)表面上的IgEFc受體(FcsR)結(jié)合的特異性IgE，那么細(xì)胞被活化，導(dǎo)致介體諸如組胺，5-羥色胺和脂質(zhì)介體產(chǎn)生和釋放。過(guò)敏反應(yīng)在IgE類組織致敏性免疫球蛋白與外源性過(guò)敏原反應(yīng)時(shí)發(fā)生。IgE抗體與肥大細(xì)胞和/或嗜堿細(xì)胞結(jié)合且這些專門的細(xì)胞在受到橋連抗體分子末端的過(guò)敏原如此刺激時(shí)釋放過(guò)敏反應(yīng)的化學(xué)介體(血管活性胺類)。組胺，血小板活化因子，花生四烯酸代謝物和5-羥色胺為其中已知的人的最佳過(guò)敏反應(yīng)介體。組胺和其它血管活性胺類一般儲(chǔ)存在肥大細(xì)胞和嗜堿性白細(xì)胞中。這些肥大細(xì)胞分散遍在于動(dòng)物組織中，且嗜堿細(xì)胞在血管系統(tǒng)中循環(huán)。這些細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)并且儲(chǔ)存組胺，否則涉及引起其釋放的IgE結(jié)合的后果專用序列出現(xiàn)。過(guò)敏反應(yīng)的癥狀根據(jù)體內(nèi)位置的不同而改變，其中IgE與抗原反應(yīng)。如果反應(yīng)沿呼吸上皮發(fā)生，那么癥狀一般為打噴嚏，咳嗽和哮喘反應(yīng)。就食物過(guò)敏而言，如果在消化道中發(fā)生相互作用，那么常見(jiàn)異常疼痛和腹瀉。例如，在蜂螯傷或?qū)^(guò)敏性受試者給予青霉素后，全身過(guò)敏反應(yīng)系統(tǒng)可能嚴(yán)重并且通常威脅生命。過(guò)敏反應(yīng)與Th2-類免疫應(yīng)答相關(guān)，其特征至少部分在于Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-5以及對(duì)IgE的抗體同種異型轉(zhuǎn)換。Thl和Th2免疫應(yīng)答彼此為反向調(diào)節(jié)的，使得對(duì)免疫應(yīng)答對(duì)Thl-類免疫應(yīng)答的偏移可以防止或改善Th2-類免疫應(yīng)答，包括過(guò)敏反應(yīng)。哞喘本文所用的"哮喘"意指呼吸系統(tǒng)病癥，其特征在于氣道炎癥和狹窄以及氣道對(duì)吸入病原體的反應(yīng)性增加。哞喘通常與特應(yīng)性或過(guò)敏性疾患相關(guān)，但并不是唯一的。哮喘的癥狀包括因氣道阻塞導(dǎo)致的哮鳴，氣絕，胸部緊迫感和咳嗽反復(fù)發(fā)作。可以通過(guò)觀察許多生理改變檢測(cè)與哮喘相關(guān)的氣道炎癥，諸如，氣道上皮剝脫，基底膜下膠原蛋白沉積，水腫，肥大細(xì)胞活化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括中性白細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。作為氣道炎癥的結(jié)果，津喘患者通常發(fā)生氣道高反應(yīng)性，氣流受限，呼吸道癥狀和疾病長(zhǎng)期性。氣流受限包括急性支氣管收縮，氣道水紳，粘液塞形成和氣道重塑，這些特征通常導(dǎo)致支氣管梗阻。在哞喘的某些情況中，可能發(fā)生基底膜下纖維化，導(dǎo)致肺功能持續(xù)異常。在過(guò)去幾年中的研究已經(jīng)揭示出哮喘可能因氣道居留的炎性細(xì)胞，介體和其它細(xì)胞和組織中的復(fù)雜相互作用所導(dǎo)致。肥大細(xì)胞，嗜酸細(xì)胞，上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞均可以在與譯喘相關(guān)的炎性過(guò)程中起重要作用。DjukanovicR等(1990)J邁7erie^/rZ/s142:434-457。認(rèn)為這些細(xì)胞可以通過(guò)分泌形成和新近合成的可能直接或間接對(duì)局部組織起作用的介體影響氣道功能。還認(rèn)識(shí)到T淋巴細(xì)胞亞群(Th2)在通過(guò)釋放選擇性細(xì)胞因子和建立疾病長(zhǎng)期性調(diào)節(jié)氣道中的過(guò)敏性炎癥方面起重要作用。RobinsonDS等(1992)iV/326:298-304。哞喘為在發(fā)生不同階段產(chǎn)生的復(fù)雜病癥，并且可以基于癥狀程度分類為急性，亞急性或慢性。急性炎癥反應(yīng)與細(xì)胞早期募集入氣道相關(guān)。亞急性炎癥反應(yīng)涉及細(xì)胞募集以及導(dǎo)致持久性炎癥模式的居留細(xì)胞活化。慢性炎癥反應(yīng)的特征在于持續(xù)水平的細(xì)胞損害和進(jìn)行性修復(fù)過(guò)程，可能導(dǎo)致氣道中的持久性異常。"具有哞喘的受試者"為具有呼吸系統(tǒng)病癥的受試者，其特征在于氣道炎癥和狹窄以及對(duì)吸入病原體的氣道反應(yīng)性增加。與哮喘發(fā)生相關(guān)的因素包括，但不限于過(guò)敏原，冷溫度，鍛煉，病毒感染和S02。本文所迷的哞喘可以與Th2-類免疫應(yīng)答相關(guān)，其特征至少部分在于Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-5以及對(duì)IgE的抗體同種異型轉(zhuǎn)換。Thl和Th2免疫應(yīng)答彼此為反向調(diào)節(jié)的，使得對(duì)免疫應(yīng)答對(duì)Thl-類免疫應(yīng)答的偏移可以防止或改善Th2-類免疫應(yīng)答，包括過(guò)敏反應(yīng)。本發(fā)明TLR7/8配體和連接寡核苷酸的組合還用于改善樹(shù)突細(xì)胞存活，分化和成熟。在本發(fā)明的某些方面中提供了增強(qiáng)表位擴(kuò)散的方法。本文所用的"表位擴(kuò)散，，意指從最初集中的定向于自身或外源性蛋白的優(yōu)勢(shì)表位優(yōu)勢(shì)和/或隱:k位的表位特異性多樣4;表位擴(kuò)散產(chǎn)生/種表位特異性免疫應(yīng)答。抗微生物劑TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合可以與一種或多種抗微生物劑共同使用?？刮⑸飫┗蛩幬锇?，但不限于抗菌劑，抗病毒劑，抗真菌劑和抗寄生蟲(chóng)劑。術(shù)語(yǔ)，諸如"抗感染劑"，"抗生素"，"抗細(xì)菌劑"，"抗病毒劑"，"抗真菌劑"，"抗寄生蟲(chóng)劑"和"殺寄生蟲(chóng)藥劑"基于本領(lǐng)域技術(shù)人員充分確立的含義并且定義在標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)教科書中。簡(jiǎn)言之，抗細(xì)菌劑殺傷細(xì)菌并且包括抗生素以及其它具有類似功能的合成或天然化合物?？共《緞┛梢苑蛛x自天然來(lái)源或合成并且用于殺傷或抑制病毒?？拐婢鷦┯糜谥委煴頊\真菌感染和機(jī)會(huì)和原發(fā)性全身真菌感染。抗寄生蟲(chóng)劑殺傷或抑制寄生蟲(chóng)。許多抗生素為作為次級(jí)代謝產(chǎn)物由細(xì)胞，諸如微生物產(chǎn)生的低分子量分子。一般而言，抗生素干擾對(duì)微生物具有特異性并且不存在于宿主細(xì)胞中的一種或多種功能或結(jié)構(gòu)。與抗感染療法相關(guān)的問(wèn)題之一在于在用抗感染劑治療的宿主中發(fā)生的副作用。例如，許多抗感染劑可以殺傷或抑制廣譜微生物并且對(duì)特定類型的種類無(wú)特異性。使用這些類型的抗感染劑治療導(dǎo)致殺傷生活在宿主中的正常菌叢和感染性微生物。所述的菌叢缺失可以導(dǎo)致疾病并發(fā)癥并且使宿主易感其它病原體，因?yàn)樵摼鷧才c感染性病原體竟?fàn)幉⑶易鳛槠琳掀鹱饔?。其它副作用可能作為這些化學(xué)本體對(duì)宿主的非微生物細(xì)胞或組織的特異性或非特異性在于的結(jié)果產(chǎn)生。與廣泛使用抗感染劑的另一個(gè)問(wèn)題在于發(fā)生微生物的抗生素抗性林。已經(jīng)出現(xiàn)了萬(wàn)古霉素抗性腸球菌，青霉素抗性肺炎球菌，多重耐藥的金黃色葡萄球菌和多重耐藥的肺結(jié)核菌林，并且成為臨床主要問(wèn)題。廣泛使用抗感染劑能夠產(chǎn)生許多細(xì)菌的抗生素抗性菌林。作為結(jié)果，需要新的抗感染策略來(lái)抗擊這些微生物。有效殺傷或抑制廣泛細(xì)菌的抗細(xì)菌抗生素稱作廣鐠抗生素。其它類型的抗細(xì)菌抗生素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陽(yáng)性類細(xì)菌有效。這些類型的抗生素稱作窄鐠抗生素。有效對(duì)抗單一生物或疾病，但對(duì)其它類型細(xì)菌無(wú)效的其它抗生素稱作有限鐠抗生素?？辜?xì)菌劑有時(shí)基于其主要作用方式分類。一般而言，抗細(xì)菌劑為細(xì)胞壁合成抑制劑，細(xì)胞膜抑制劑，蛋白質(zhì)合成抑制劑，核酸合成或功能抑制劑和竟?fàn)幮砸种苿?。?xì)胞壁合成抑制劑抑制細(xì)胞壁合成過(guò)程且一般為細(xì)菌肽聚糖合成中的步驟。細(xì)胞壁合成抑制劑包括P-內(nèi)酰胺抗生素，天然青霉素，半合成青霉素，氨節(jié)西林，克拉維酸，頭孢菌素類和桿菌肽。P-內(nèi)酰胺抗生素為包含4-元P-內(nèi)酰胺環(huán)的抑制肽聚糖合成的最終步驟的抗生素，內(nèi)酰胺抗生素可以為合成的或天然的。由青霉屬(penicillium)產(chǎn)生的P-內(nèi)酰胺抗生素為天然抗生素，諸如青霉素G或青霉素V。它們通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)黃青霉(Penici11iumchrysogenum)產(chǎn)生。天然青霉素具有窄譜活性并且一般對(duì)鏈球菌屬(Streptococcus)，淋球菌(Gonococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)有效。還對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效的其它類型的天然青霉素包括青霉素F，X，K和0。半合成青霉素類一般為霉菌產(chǎn)生的分子6-氨基青霉烷酸的修飾物。可以通過(guò)添加側(cè)鏈修飾6-氨基青霉烷酸，所述的側(cè)鏈產(chǎn)生具有比天然青霉素更為廣譜活性或各種其它有利特性的青霉素。某些類型的半合成青霉素具有對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜，但被青霉素酶失活。這些半合成青霉素包括氨節(jié)西林，羧節(jié)西林，苯唑西林，阿洛西林，美洛西林和哌拉西林。其它類型的半合成青霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較窄的活性，但已經(jīng)出現(xiàn)了不被青霉素酶失活的特性，它們包括，例如甲氧西林，雙氯西林和萘夫西林。某些廣譜半合成青霉素可以與p-內(nèi)酰胺酶抑制劑，諸克拉維酸和舒巴克坦聯(lián)用。內(nèi)酰胺酶抑制劑不具有抗微生物作用，但它們起抑制青霉素酶的作用，由此防止半合成青霉素降解。另一種類型的P-內(nèi)酰胺抗生素為頭孢菌素類。它們對(duì)細(xì)菌P-內(nèi)酰胺酶的降解敏感，且因此單獨(dú)使用總是無(wú)效。然而，頭孢菌素類耐受青霉素酶。它們對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有效。頭孢菌素類包括，但不限于頭孢瘞吩，頭孢匹林，頭孢氨千，頭孢孟多，頭孢克洛，頭孢唑林，頭孢呋辛，頭孢西丁，頭孢噻肟，頭孢磺啶，頭孢他美，頭孢克肝，頭孢曲松，頭孢哌酮，頭孢吡咬和拉氧頭孢。桿菌肽為通過(guò)抑制胞壁肽亞單位或肽聚糖從遞送該亞動(dòng)物的分子釋放至膜外部抑制細(xì)胞壁合成的另一類抗生素。盡管桿菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效，但其應(yīng)用因其高毒性而一般限于局部給藥。碳青霉烯為另一種能夠抑制細(xì)胞壁合成的廣譜P-內(nèi)酰胺抗生素。碳青霉烯的實(shí)例包括，但不限于亞胺培南。單菌胺類也為廣鐠P-內(nèi)酰胺抗生素，并且包括euztreonam。鏈霉菌屬(Streptomyces)產(chǎn)生的抗生素萬(wàn)古霉素通過(guò)抑制細(xì)胞膜合成也對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效。另一類抗細(xì)菌劑為細(xì)胞膜抑制劑的抗細(xì)菌劑。這些化合物破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)或抑制其功能。使用為細(xì)胞膜抑制劑的抗細(xì)菌劑的一個(gè)問(wèn)題在于它們因在細(xì)菌和真核細(xì)胞膜中的磷脂類中的相似性而可以在原核細(xì)胞和細(xì)菌中產(chǎn)生作用。因此，這些化合物幾乎沒(méi)有足以允許這些化合物全身使用特異性并且防止使用高劑量局部給藥。一種臨床有用的細(xì)胞膜抑制劑為多粘菌素。多粘菌素通過(guò)結(jié)合膜磷脂類干擾膜功能。多粘菌素主要對(duì)革蘭氏陰性菌有效并且一般用于嚴(yán)重的假單胞菌屬感染或耐受較低毒性抗生素的假單胞菌屬感染。這些與全身給予該化合物相關(guān)的副作用包括對(duì)腎和其它器官的損害。其它細(xì)胞膜抑制劑包括兩性霉素B和制霉菌素，它們?yōu)橹饕糜谥委熑碚婢腥竞图俳z酵母屬酵母感染的抗真菌劑。咪唑類為另一類為細(xì)胞膜抑制劑的抗生素。咪唑類用作抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，用于治療酵母感染，皮膚寄生蟲(chóng)感染和全身真菌感染.咪唑類包括，但不限于克霉唑，咪康唑，酮康唑，伊曲康唑和伊曲康唑。許多抗細(xì)菌劑為蛋白質(zhì)合成抑制劑。這些化合物防止細(xì)菌合成結(jié)構(gòu)蛋白和酶且由此導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)或功能抑制或細(xì)胞死亡。一般而言，這些化合物干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程。阻斷轉(zhuǎn)錄的抗細(xì)菌劑包括，但不限于利福平和乙胺丁醇。抑制酶RNA聚合酶的利福平具有廣譜活性并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)有效。乙胺丁醇對(duì)結(jié)核分枝桿菌有效。阻斷翻譯的抗細(xì)菌劑干擾細(xì)菌核糖體以防止mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。一般而言，這種類型的化合物包括，但不限于四環(huán)素類，氯霉素，大環(huán)內(nèi)酯類(例如紅霉素)和氨基糖苷類(例如鏈霉素).氨基糖苷類為由細(xì)菌鏈霉菌屬(Streptomyces),諸如，例如鏈霉素，卡那霉素，卡那霉素，阿米卡星和慶大霉素產(chǎn)生一類抗生素。氨基糖苷類對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的細(xì)菌感染有用。鏈霉素廣泛用作治療肺結(jié)核的主要藥物。慶大霉素對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌菌株有用，包括假單胞菌屬感染，尤其是與妥布霉素聯(lián)用。卡那霉素對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌有用，包括青霉素抗性葡萄球菌。限制其在臨床上應(yīng)用的氨基糖苷類的一種副作用在于已經(jīng)證實(shí)在對(duì)功效而言必不可少的劑量下，延長(zhǎng)應(yīng)用損害腎功能并且導(dǎo)致對(duì)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)損害，從而導(dǎo)致耳聾。另一種類型的翻譯抑制劑抗細(xì)菌劑為四環(huán)素類。四環(huán)素類為一類抗生素，它們?yōu)閺V譜的并且對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有效。四環(huán)素類的實(shí)例包括四環(huán)素，米諾環(huán)素，多西環(huán)素和金霉素。它們對(duì)治療許多類型的細(xì)菌是重要的，但在治療萊姆病中特別重要。作為其低毒性和最低直接副作用的結(jié)果，醫(yī)學(xué)團(tuán)體超量使用和誤用四環(huán)素類產(chǎn)生問(wèn)題。例如，超量使用廣泛發(fā)生耐藥性?？辜?xì)菌劑，諸如大環(huán)內(nèi)酯類可逆結(jié)合50S核糖體亞單位并且通過(guò)肽基轉(zhuǎn)移酶抑制蛋白質(zhì)延長(zhǎng)或防止不帶電tRNA從細(xì)菌核糖體中釋放或它們兩者。這些化合物包括紅霉素，羅紅霉素，克拉霉素，竹桃霉素和阿奇霉素。紅霉素對(duì)大部分革蘭氏陽(yáng)性菌具有活性，奈瑟球菌屬(Neisseria)，軍團(tuán)菌屬(Legionella)和嗜血菌屬(Haemophilus)，但對(duì)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)無(wú)效。阻斷蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的肽鍵形成的林可霉素和克林霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有用。另一種類型的翻譯抑制劑為氯霉素。氯霉素結(jié)合抑制細(xì)菌酶肽基轉(zhuǎn)移酶的70S核糖體，由此防止蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的多肽鏈生長(zhǎng)。與氯霉素相關(guān)的一種嚴(yán)重副作用為再生障礙性貧血。再生障礙性貧血在小比例(1/50，000)患者中有效治療細(xì)菌的鏈霉素劑量下發(fā)生。一旦開(kāi)據(jù)目前很少較高劑量處方的抗生素，那么因死于貧血的后果而幾乎不使用氯霉素。它因其有效性而仍然應(yīng)用于威脅生命的情況(例如，傷寒)。某些抗細(xì)菌劑破壞核酸合成或功能，例如結(jié)合DNA或RNA，使得其信息不能讀取。它們包括，但不限于喹諾酮類和復(fù)方新諾明，既包括合成的化學(xué)品，又包括利福霉素類，即天然或半合成化學(xué)品。喹諾酮類通過(guò)抑制DNA促旋酶阻斷細(xì)菌DNA復(fù)制，而細(xì)菌需要這種酶產(chǎn)生其循環(huán)DNA。它們?yōu)閺V鐠的且實(shí)例包括諾氟沙星，環(huán)丙沙星，依諾沙星，萘啶酸和替馬氟沙星。萘啶酸為結(jié)合DNA促旋酶(拓樸異構(gòu)酶)的殺菌劑，所述的酶為DM復(fù)制必需的且允許超螺旋松弛和重新形成，從而抑制DM促旋酶活性。萘啶酸的主要應(yīng)用在于治療下泌尿道感染(UTI)，因?yàn)樗鼘?duì)幾種類型的革蘭氏陰性菌，諸如大腸桿菌(E.coli)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和變形桿菌屬(Proteus)的種類有效，而這些菌為UTI的常見(jiàn)原因。復(fù)方新諾明為磺胺曱喁唑與曱氧節(jié)啶的聯(lián)合用藥，它阻斷構(gòu)成DNA核苷酸所需葉酸的細(xì)菌合。利福平為利福霉素衍生物，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(包括結(jié)核分枝桿菌和腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)導(dǎo)致的腦膜炎)和某些革蘭氏陰性菌具有活性。利福平結(jié)合聚合酶的p-亞單位并且阻斷對(duì)活化聚合酶必不可少的一級(jí)核苷酸添加，由此阻斷mRNA合成。另一類抗細(xì)菌劑為作為細(xì)菌酶竟?fàn)幮砸种苿┑幕衔?。竟?fàn)幮砸种苿┰诮Y(jié)構(gòu)上幾乎均與細(xì)菌生長(zhǎng)因子類似并且竟?fàn)幮越Y(jié)合，但無(wú)法完成細(xì)胞中的代謝功能。這些化合物包括磺胺類和甚至具有更高和更廣鐠抗菌活性的磺胺化學(xué)修飾形式?；前奉?例如磺胺異噁唑和甲氧芐咬)用于治療肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，p-溶血性鏈球菌和大腸桿菌并且用于治療因大腸桿菌導(dǎo)致的不復(fù)雜的UTI和治療腦膜炎球菌性腦膜炎?？共《緞榉乐共《靖腥炯?xì)胞或細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的化合物。存在的抗病毒藥遠(yuǎn)少于抗菌藥，因?yàn)椴《緩?fù)制過(guò)程與宿主細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制極為相關(guān)，使得非特異性抗病毒劑通常對(duì)宿主有毒性。在病毒感染過(guò)程中存在幾個(gè)可以被抗病毒劑阻斷或抑制的階段。這些階段包括病毒(免疫球蛋白或結(jié)合肽類)與宿主細(xì)胞附著，病毒脫殼(例如，脫殼)，病毒mRNA合成或翻譯(例如，干擾素)，病毒RNA或DNA復(fù)制(例如，核苷類似物)，新病毒蛋白成熟(例如，蛋白酶抑制劑)和病毒萌發(fā)和釋放。另一類抗病毒劑為核苷類似物。核苷類似物為與核苷類似，但具有不完全或異常脫氧核糖或核糖基團(tuán)的合成化合物。一旦核苷類似物在細(xì)胞中，它們就被磷酸化，從而產(chǎn)生與正常核苷酸竟?fàn)帗饺氩《綝NA或RNA的三磷酸形式。一旦核苷類似物的三磷酸形式被摻入生長(zhǎng)的核酸鏈，那么它就導(dǎo)致與病毒聚合酶不可逆地結(jié)合且由此發(fā)生鏈終止。核苷類似物包括，但不限于阿昔洛韋(用于治療單純皰滲病毒和水痘帶狀皰滲病毒)，更昔洛韋(用于巨細(xì)胞病毒)，碘苷，利巴韋林(用于治療呼吸道合胞病毒)，雙脫氧肌苷，雙脫氧胞苷和齊多夫定(疊氮胸腺嘧咬)。另一類抗病毒劑包括細(xì)胞因子，諸如干擾素。干擾素為病毒感染的細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。千擾素通過(guò)結(jié)合與感染細(xì)胞相鄰的細(xì)胞上的特異性身體起作用，導(dǎo)致防止其被病毒感染的細(xì)胞中的改變，a和p-干擾素還誘導(dǎo)感染細(xì)胞上的I類和II類MHC分子表達(dá)，導(dǎo)致將增加的抗原呈遞以便宿主免疫細(xì)胞識(shí)別，可利用作為重組形式的a和p-干擾素將已經(jīng)用于治疔慢性乙型肝炎和丙型肝炎。在有效用于抗病毒療法的劑量下，干擾素具有嚴(yán)重副作用，諸如發(fā)熱，不適感和體重減輕。免疫球蛋白療法用于預(yù)防病毒感染。用于病毒感染的免疫球蛋白療法不同于細(xì)菌感染，因?yàn)樗皇强乖禺愋缘?，免疫球蛋白療法通過(guò)結(jié)合胞外病毒體并且防止其附著和進(jìn)入對(duì)病毒感染敏感的細(xì)胞起作用。該療法用于預(yù)防病毒感染抗體存在于宿主中的時(shí)間期限，一般而言，存在兩種類型的免疫球蛋白療法，即一般的免疫球蛋白療法和超免疫球蛋白療法。一般免疫清蛋白療法使用由正常血液供體血清制備和采集的抗體產(chǎn)品。這種采集的產(chǎn)品包含對(duì)廣泛人病毒，諸如甲型肝炎，細(xì)小病毒，腸病毒(尤其是在新生嬰兒中)而言低滴度的抗體。超免疫球蛋白療法使用由對(duì)特定病毒具有高抗體的滴度的個(gè)體血清制備的抗體。那些抗體隨后對(duì)特定病毒有用。超免疫球蛋白的實(shí)例包括帶狀皰滲免疫球蛋白(用于預(yù)防免疫受損兒童和新生嬰兒的水痘)，人狂犬病免疫球蛋白(用于被患狂犬病的動(dòng)物咬傷的受試者的咬傷后預(yù)防)，乙型肝炎免疫球蛋白(用于預(yù)防乙型肝炎，尤其是接觸病毒的受試者)和RSV免疫球蛋白(用于治療呼吸道合胞病毒感染)?？拐婢鷦┯糜谥委熀皖A(yù)防感染性真菌。抗真菌劑有時(shí)根據(jù)其作用機(jī)制分類。某些抗真菌劑作為細(xì)胞壁抑制劑通過(guò)抑制葡萄糖合酶起作用。它們包括，但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌劑通過(guò)使膜完整性失穩(wěn)起作用。它們包括，但不限于咪唑類，諸如克霉唑，絲他康唑，氟康唑，伊曲康唑，酮康唑，咪康唑和優(yōu)立康唑以及FK463，兩性霉素B，BAY38-9502，MK991，普拉米星，UK292,布替那非和特比萘芬。其它抗真菌劑通過(guò)分解殼多糖(例如，殼多糖酶)或免疫抑制(501霜)起作用。殺寄生蟲(chóng)藥為直接殺傷寄生蟲(chóng)的活性劑。這類化合物為本領(lǐng)域中公知的并且一般商購(gòu)獲得。用于人體給藥的殺寄生蟲(chóng)藥的實(shí)例包括，但不限于阿苯達(dá)唑，兩性霉素B，千硝唑，硫氯酚，氯喹HC1，磷酸氯喹，克林霉素，去氫依米丁，乙胺嗪，糠酸二氯尼特，依氟鳥(niǎo)氨酸，呋喃唑酮，糖皮質(zhì)激素類，卣泛群，雙碘喹啉，伊維菌素，甲苯達(dá)唑，甲氟喹，銻酸葡甲胺，美拉胂醇，美曲膦酯，甲硝唑，氯硝柳胺，硝呋莫司，奧沙尼喹，巴龍霉素，羥乙基磺酸噴他脒，哌嗪，吡喹酮，磷酸伯氨喹，氯胍，雙鞋萘酸噢嘧啶，乙胺嘧啶-磺胺類，乙胺嘧咬-磺胺多辛，奎納克林HC1,硫酸奎寧，葡糖酸奎尼丁，螺旋霉素，葡萄糖酸銻鈉(葡糖酸銻鈉)，舒拉明，四環(huán)素，多西環(huán)素，塞苯噠唑，替硝唑，甲氧節(jié)啶-磺胺甲喝唑和錐蟲(chóng)胂胺。抗癌療法本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合可以與抗癌療法聯(lián)用?？拱┋煼òò┌Y用藥，放射和外科手術(shù)。本文所用的"癌癥用藥，，意指對(duì)受試者給藥以便治療癌癥的活性劑。本文描述了用于治療癌癥的各種類型的藥物。就本說(shuō)明書的目的而言，將癌癥用藥分類為化療劑，免疫治療劑，癌癥疫苗，激素療法和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑?；焺┛梢赃x自甲氨蝶呤(methotrexate)，長(zhǎng)春新堿，阿霉素，順鉑，不含糖的氯乙基亞硝基脲類，5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，博來(lái)霉素，多柔比星，達(dá)卡巴噢，泰素，fragyline,MeglamineGLA，戊柔比星，卡莫司汀(ca簡(jiǎn)staine)和poliferposan，MMI270,BAY12-9566，RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，醒P，MTA/LY231514,力比泰，LY264618/lometexo1，Glamolec，CI—994，TNP-470，和美新/托泊替康，PKC412，伐司樸達(dá)/PSC833，諾肖林/米托蒽醌(Mitroxantrone)，Metaret/舒拉明，巴馬司他，E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC,AG3340,AG3433,Incel/VX-710，VX-853，ZD0101,ISI641,ODN698,TA2516/Marmistat，BB2516/Marmistat，CDP845,D2163,PD183805，DX8951f，乳桿菌制劑DP2202，F(xiàn)K317，溶鏈菌制劑/OK-432，AD32/戊柔比星，氯化鍶/鍶衍生物，Temodal/替莫唑胺，阿霉素脂質(zhì)體/多柔比星脂質(zhì)體，Yewtaxan/紫杉醇，泰素/紫杉醇，Xeload/卡培他濱，氟鐵龍/去氧氟尿苷，Cyclopax/口服紫杉醇，口服紫杉烷，SPU-077/順鉑，HMR1275/Flavopiridol，CP-358(774)/EGFR,CP-609(754)/RAS癌基因抑制劑，BMS-182751/口服賴，UFT(替加氟/尿嘧啶)，左旋咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑(Levamisole)，恩尿嘧啶/776C85/5FU增強(qiáng)劑，開(kāi)普拓/左旋咪唑，鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑/伊立替康，Tumodex/Ralitrexed，克拉立平/克拉屈濱，Paxex/紫杉醇，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體/多柔比星脂質(zhì)體，楷萊/多柔比星脂質(zhì)體，福達(dá)華/氟達(dá)拉濱，Pharmarubicin/表柔比星，DepoCyt，ZD1839，LU79553/Bis-Naphtalimide，LU103793/Dolastain，Caetyx/多柔比星脂質(zhì)體，健擇/吉西他濱，ZD0473/Anormed,YM116,碘源，CDK4和CDK2抑制劑，PARP抑制劑，D4809/Dexifosamide，Ifes/美鈉針劑/Ifosamide，威猛/替尼泊苷，伯爾定/卡鉑，順鉑(Plantinol)/順鉑(cisplatin),依托泊苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)，ZD9331，泰素帝/多西他賽，鳥(niǎo)嘌呤阿糖胞苷前體藥物，紫杉烷類似物，亞硝基脲，烷化劑，諸如美法侖(melphelan)和環(huán)磷酰胺，氨魯米特，天冬酰胺酶，白消安，卡賴，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷HC1，放線菌素D，柔紅霉素HC1，磷酸雌莫司汀鈉，依托泊苷(VP16-213)，氟尿苷，氟尿嘧啶(5-FU),氟他胺，幾基脲(Hydroxyurea)(羥基脲(hydroxycarbamide))，異環(huán)磷酰胺，干擾素a-2a,a-2b，醋酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類似物)，洛莫司汀(CCNU)，氮芥HC1(氮芥)，巰基嘌呤，美司鈉，米托坦(o.p'-DDD)，米托蒽醌HC1，奧曲肽，普卡霉素，丙卡巴肼HC1，鏈佐星，枸櫞酸他莫昔芬，硫鳥(niǎo)噤呤，塞替派，硫酸長(zhǎng)春堿，安吖啶(m-AMSA)，阿扎胞苷，紅細(xì)胞生成素(Erthropoietin),六甲蜜胺(H醒)，白細(xì)胞介素2，米托胍腙(甲基-GAG;甲基乙二醛雙-丙咪腙；MGBG),噴司他丁(2'噴司他丁)，司莫司汀(曱基-CCNU)，替尼泊苷(VM-26)和硫酸長(zhǎng)春地辛，但不限于此。免疫治療劑可以選自3622W94,4B5,ANAAb,抗FLK-2,抗VEGF，ATRAGEN，AVASTIN(貝伐珠單抗;Genentech)，BABS，BEC2,BEXXAR(托西莫單抗；GlaxoSmithKline)，C225,CAMPATH(阿侖珠單抗;GenzymeCorp.)，CEACIDE，CMA676，EMD-72000,ERBITUX(西妥昔單抗;ImClone系統(tǒng)，Inc.),Gliomab-H，GNI-250,HERCEPTIN(曲妥珠單抗；Ge謹(jǐn)tech),IDEC-Y2B8，ImmuRAIT-CEA,iorc5,ioregf.r3，ior16，LDP-03,LymphoCide，MDX-11，MDX-22，MDX-210，MDX-220,MDX-260,MDX-447，MEL麗UNE-1，MEL麗腿-2，Monopharm-C，NovoMAb-G2，0ncolym，0V103，0varex，Panorex，Pretarget，Quadramet，Ributaxin，RITUXAN(利妥昔單抗;Genentech)，SMART1D10Ab，SMARTABL364Ab，SMARTM195,TNT和ZENAPAX(達(dá)克珠單抗；Roche)，但不限于此。癌癥疫苗可以選自EGF抗獨(dú)特型癌癥疫苗，Gp75抗原，GMK黑素瘤疫苗，MGV神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合疫苗，Her2/neu，Ovarex，M-Vax，0-Vax，L-Vax，STn-KHL癌疫苗，BLP25(MUC-1)，脂質(zhì)體獨(dú)特型疫苗，黑素瘤疫苗，肽抗原疫苗，毒素/抗原疫苗，基于MVA的疫苗，PACIS，BCG疫苗，TA-HPV，TA-CIN，DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但不限于此?？惯^(guò)敏反應(yīng)藥本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸可以與抗過(guò)敏反應(yīng)藥聯(lián)用。用于治療或預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的常用方法包括使用過(guò)敏反應(yīng)用藥或脫敏療法。用于治療或預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的某些進(jìn)化療法包括使用中和抗IgE抗體?？菇M胺類和其它阻斷過(guò)敏反應(yīng)化學(xué)介體作用的藥物有助于調(diào)節(jié)過(guò)敏癥狀的嚴(yán)重性，但無(wú)法預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)并且對(duì)隨后的過(guò)敏應(yīng)答無(wú)作用。脫敏療法通過(guò)指定小劑量的過(guò)敏原，通常通過(guò)在皮下注射，以便誘導(dǎo)對(duì)該過(guò)敏原的IgG-類應(yīng)答來(lái)進(jìn)行。認(rèn)為存在IgG抗體有助于中和因誘導(dǎo)IgE抗體產(chǎn)生的介體產(chǎn)生。最初使用極低劑量的過(guò)敏原治療受試者以避免誘導(dǎo)嚴(yán)重反應(yīng)并且緩慢增加該劑量。這種類型的療法是危險(xiǎn)的，因?yàn)閷?duì)受試者實(shí)際給予了導(dǎo)致可能產(chǎn)生過(guò)敏應(yīng)答和嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的化合物。過(guò)敏反應(yīng)用藥包括，但不限于抗組胺類，皮質(zhì)類固醇和前列腺素誘導(dǎo)物。抗組胺類為抵消取大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞釋放的組胺的化合物。這些化合物為本領(lǐng)域眾所周知的并且常用于治療過(guò)敏反應(yīng)?？菇M胺類包括，但不限于阿伐斯汀，阿司咪唑，阿扎他定，氮卓斯汀，betatastine，溴苯那敏，布克力溱，西替利漆，西替利喚類似物，樸爾敏，氯馬斯汀，CS560，賽庚啶，地氯雷他定，右氯苯那敏，依巴斯汀，依匹斯汀，非索非那定，HSR609，羥嗪，左卡巴斯汀，氯雷他定，甲東^菪堿，咪唑斯汀，去甲阿司咪唑，苯茚胺，異丙嗪，美吡拉敏，特非那定和曲尼司特。皮質(zhì)類固醇包括，但不限于甲潑尼龍，潑尼松龍，潑尼松，倍氯米松，布地奈德，地塞米松，氟尼縮松，丙酸氟替卡松和曲安西龍。盡管地塞米松為具有抗炎作用的皮質(zhì)類固醇，但是它并不定期以吸入形式用于治療過(guò)敏反應(yīng)或譯喘，因?yàn)樗诊@著并且在有效劑量下具有長(zhǎng)期抑制性副作用。然而，可以按照本發(fā)明使用地塞米松治療過(guò)敏反應(yīng)或哞喘，因?yàn)楫?dāng)將其與本發(fā)明的組合物聯(lián)用時(shí)，可以將其以低劑量給藥以便減輕副作用。與皮質(zhì)類固醇使用相關(guān)的某些副作用包括咳嗽，發(fā)聲困難，鵝口瘡(假絲酵母病)，并且在較高劑量下，為全身作用，諸如腎上腺抑制，葡萄糖耐受不良，骨質(zhì)疏松癥，骨無(wú)菌性壞死，白內(nèi)障形成，生長(zhǎng)抑制，高血壓，肌肉虛弱，皮膚細(xì)線化和易擦傷。Barnes&Peterson(1993)j邊細(xì)p!'rZ/"48:S1-S26;和KamadaAK等(1996)J邊/Aes;72'rCr"Care#ed153:1739-48?？棺g喘藥本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合可以與抗哞喘藥聯(lián)用。用于治療哮喘的藥物(即抗哞喘藥)一般分成兩類，即速釋藥劑和長(zhǎng)效控制藥劑。哮喘患者以每日為基礎(chǔ)服用長(zhǎng)效控制藥劑，以便實(shí)現(xiàn)和維持對(duì)持久性哞喘的控制。長(zhǎng)效控制藥劑包括抗炎劑，諸如皮質(zhì)類固醇，chromolynsodium和奈多羅米；長(zhǎng)效支氣管擴(kuò)張藥，諸如長(zhǎng)效P廣激動(dòng)劑和甲基黃嘌呤類；和白細(xì)胞三烯調(diào)節(jié)劑。速釋藥物包括短效P2激動(dòng)劑，抗膽堿能藥和全身用皮質(zhì)類固醇。存在與這些藥物各自相關(guān)的許多副作用，并且化學(xué)藥物中沒(méi)有一種藥物單獨(dú)或以組合方式能夠預(yù)防或完全治療哞喘。哞喘用藥包括，但不限于PDE-4抑制劑，支氣管擴(kuò)張藥/p-2激動(dòng)劑，K+通道開(kāi)放劑，VLA-4拮抗劑，烯丙異戊酰脲拮抗劑，血栓烷A2(TXA2)合成抑制劑，黃噪呤類，花生四烯酸拮抗劑，5脂氧合酶抑制劑，TXA2受體拮抗劑，TXA2拮抗劑，5-lipox活化蛋白抑制劑和蛋白酶抑制劑。支氣管擴(kuò)張藥/P2激動(dòng)劑為一類導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張或平滑肌松弛的化合物。支氣管擴(kuò)張藥/p2激動(dòng)劑包括，但不限于沙美特羅，舒喘靈，沙丁胺醇，特布他林，D2522/福莫特羅，非諾特羅，比托特羅，吡布特羅，曱基黃嘌呤類和奧西那林。長(zhǎng)效P2激動(dòng)劑和支氣管擴(kuò)張藥為除用于抗炎療法外還用于長(zhǎng)期預(yù)防癥狀的化合物。長(zhǎng)效Pr激動(dòng)劑包括，但不限于沙美特羅和沙丁胺醇。這些化合物常與皮質(zhì)類固醇聯(lián)用并且如果不使用任何抗炎療法，一般就不使用它們。它們?cè)诔瑒┝肯屡c副作用相關(guān)，諸如心動(dòng)過(guò)速，骨骼肌顫動(dòng)，低鉀血癥和QTc間隔延長(zhǎng)。甲基黃嘌呤類，包括，例如茶堿已經(jīng)用于長(zhǎng)期控制和預(yù)防癥狀。這些化合物因磷酸二酯酶抑制和可能的腺苷拮抗作用而導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張。劑量相關(guān)急性毒性為使用這些類型化合物的具體問(wèn)題。作為結(jié)果，:窄治療范圍。副作用包括心動(dòng)過(guò)速，快速性二律^^常，惡心和嘔吐，中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激，頭痛，癲癇發(fā)作，嘔血，高血糖癥和低鉀血癥。短效Pr激動(dòng)劑包括，但不限于沙丁胺醇，比托特羅，吡布特羅和特布他林。與給予短效P2激動(dòng)劑相關(guān)的某些不良作用包括心動(dòng)過(guò)速，骨骼肌顫動(dòng)，低鉀血癥，乳酸增加，疼痛和高血糖癥。Chromolynsodium和奈多羅米用作主要預(yù)防因鍛煉導(dǎo)致的譯喘癥狀或因過(guò)敏原產(chǎn)生的過(guò)敏癥狀的長(zhǎng)效控制藥物。認(rèn)為這些化合物可以阻斷因感染氯化物通道功能對(duì)過(guò)敏原的早期和晚期反應(yīng)。它們還穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜并且抑制活化和介體活化和從inosineophil和上皮細(xì)胞中釋放。一般需要給藥4—6周期限以便獲得最大有益性?？鼓憠A能藥一般用于緩解急性支氣管痙攣，認(rèn)為這些化合物通過(guò)竟?fàn)幮砸种贫据蓧A性膽堿能受體起作用。抗膽堿能藥包括，但不限于異丙托溴銨。這些化合物僅逆轉(zhuǎn)膽堿能介導(dǎo)的支氣管痙享，但不改變?nèi)魏螌?duì)抗原的反。副作用包括口干和呼吸分泌物，在某些個(gè)體中喘鳴增加，如果噴眼則導(dǎo)致視力模糊。本發(fā)明的組合物還可以用于治療氣道重塑。氣道重塑因平滑肌細(xì)胞增殖和/或氣道中粘膜下層增厚導(dǎo)致且最終導(dǎo)致造成氣流受限的氣道狹窄。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步預(yù)防重塑且甚至進(jìn)一步減少因重塑過(guò)程產(chǎn)生的組織疊加。佐劑本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸可以與其它試劑聯(lián)用，諸如佐劑。本文所用的佐劑意指非抗原，TLR7/8配體和連接寡核苷酸的增強(qiáng)對(duì)抗原應(yīng)答，例如，體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞活化的物質(zhì)。佐劑促進(jìn)輔助細(xì)胞累積和/或活化以便增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。佐劑用于增強(qiáng)疫苗功效，即含抗原的用于應(yīng)答對(duì)抗原的保護(hù)性免疫的組合物。佐劑一般包括產(chǎn)生長(zhǎng)效作用的佐劑，免疫刺激佐劑和產(chǎn)生長(zhǎng)效作用和刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。本文所用的產(chǎn)生長(zhǎng)效作用的佐劑為導(dǎo)致可以在體內(nèi)緩慢釋放的佐劑，由此延長(zhǎng)免疫細(xì)胞與抗原的接觸。這種類型的佐劑包括，但不限于鋁(例如，氫氧化鋁，磷酸鋁)；基于乳劑的制劑，包括礦物油，非礦物油，油包水型或水包油型乳劑，水包油型溶劑，諸如SeppicISA系列Montanide佐劑(例如，MontanideISA720;AirLiquide，Paris,France);MF-59(用Span85和Tween80穩(wěn)定的7K包角鯊烯乳劑；ChironCorporation,Emeryville,Calif.);和PROVAX(包含穩(wěn)定洗滌劑和膠束成形劑的水包油型溶劑；IDECPharmaceuticalsCorporation,SanDiego,Calif.)。免疫-刺激劑為導(dǎo)致免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化的佐劑。例如，它可以導(dǎo)致免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌細(xì)胞因子。這種類型的佐劑包括，但不限于純化自Q.saponaria樹(shù)的樹(shù)皮的皂苷類，諸如QS21(使用HPLC分級(jí)分離在笫21個(gè)峰上洗脫的糖月旨；AquilaBiopharmaceuticals，Inc.,Worcester,Mass.);聚[二(羧酸苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；VirusResearchInstitute,美國(guó))；脂多糖類的衍生物，諸如一磷?；|(zhì)A(MPL;RibiI咖unoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)，胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和蘇氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);0M-174(與月旨質(zhì)A相關(guān)的葡糖胺二糖；0MPharmaSA，Meyrin，Switzerland);和利什曼原蟲(chóng)屬伸長(zhǎng)因子(純化的利什曼原蟲(chóng)屬蛋白；CorixaCorporation,Seattle,Wash.)。這種類型的佐劑還包括CpGDNA。產(chǎn)生長(zhǎng)效作用和刺激免疫系統(tǒng)的佐劑為那些基于上述確定的功能的兩者的化合物。這種類型的佐劑包括，但不限于ISCOMS(包含混合的皂苷類，脂質(zhì)并且形成具有可以保持可以的孔病毒大小的顆粒免疫刺激復(fù)合物；CSL，Melbourne,Australia);SB-AS2(SmithKlineBeecham佐劑系統(tǒng)#2，其為包含MPL和QS21的水包油型乳劑SmithKlineBeechamBiologicals[SBB]，Rixensart，Belgium);SB-AS4(包含鋁和MPL的SmithKlineBeecham佐劑系統(tǒng)#4;SBB，Belgium);形成膠束的非離子型嵌段共聚物，諸如CRL1005(它們包含位于聚氧乙烯鏈側(cè)翼的疏水性聚氧丙烯直鏈；Vaxcel，Inc.,Norcross,Ga.);和Syntex佐劑制品(SAF，包含Tween80和非離子型嵌段共聚物的水包油型乳劑；SyntexChemicals,Inc.,Boulder,Colo.)。佐劑還與可以為脂肽，諸如Pam3Cys;陽(yáng)離子型多糖，諸如脫乙酰殼多糖；或陽(yáng)離子肽，如魚(yú)精蛋白。細(xì)胞因子本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合還可以與細(xì)胞因子聯(lián)用。細(xì)胞因子是由介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的許多類型細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性蛋白和糖蛋白。細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間的通信，在局部和全身起作用以便募集細(xì)胞和調(diào)節(jié)其功能和增殖。細(xì)胞因子類別包括先天免疫性的介體和調(diào)節(jié)劑，適應(yīng)性免疫的介體和調(diào)節(jié)劑和造血刺激劑。細(xì)胞因子中包括白細(xì)胞介素(例如，IL-1，IL-2,IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8,IL-9，IL-IO，IL-ll，IL-12,IL-13,IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18和白細(xì)胞介素19-32(IL-19-IL-32)等),趨化因子(例如，IP-IO，RANTES，MIP-la，MIP-lj3，MlP-3a，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，I-TAC和BCA-1等)和其它細(xì)胞因子，包括l型千擾素(例如，IFN-a和IFN-13)，2型干擾素(例如，IFN-y)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p(TGF-j3)和各種集落刺激因子(CSFs)，包括GM-CSF，G-CSF和M-CSF。抗原本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合可以任選在疫苗制品中與抗原聯(lián)用。本文所用的"抗原"意指能夠被T-細(xì)胞抗原受體或B-細(xì)胞抗原受體識(shí)別的任何分子。該術(shù)語(yǔ)廣泛包括被作為異物被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的任何類型的分子?？乖话惆?，但不限于細(xì)胞，細(xì)胞提取物，蛋白質(zhì)，多肽類，肽類，多糖類，多糖綴合物，多糖類和其它分子的肽和非肽模擬物，小分子，脂質(zhì)，脂蛋白，糖脂類，多糖類，碳水化合物，病毒和病毒提取物和多細(xì)胞生物，諸如寄生蟲(chóng)和過(guò)敏原。就為蛋白質(zhì)，多肽類或肽類的抗原而言，這類抗原可以包括編碼這類抗原的核酸分子。更具體地說(shuō)，抗原包括，但不限于癌抗原，包括癌細(xì)胞和在癌細(xì)胞內(nèi)或其上表達(dá)的分子；微生物抗原，包括微生物和在微生物內(nèi)或其上表達(dá)的分子；和過(guò)敏原。因此，本發(fā)明在某些實(shí)施方案中提供了用于癌癥，病原體和過(guò)敏原的疫苗。在各種實(shí)施方案中，抗原為微生物抗原，癌抗原或過(guò)敏原。本文所用的"微生物抗原"為微生物的抗原，并且包括，但不限于病毒，細(xì)菌，寄生蟲(chóng)和真菌。這類抗原包括完整微生物及其天然分離物和片有^異性的免疫;答的合成化合^。J^誘導(dǎo)(體液和/或細(xì)胞)對(duì)天然微生物抗原的免疫應(yīng)答，化合物與天然微生物抗原類似。這類抗原在本領(lǐng)域中常用并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。本發(fā)明指定包括來(lái)源于本文所述的病原體中的任一種的抗原。本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌抗原"和"胂瘤抗原"可以互換使用，其指的是化合物，諸如肽，蛋白質(zhì)，脂蛋白或糖蛋白，它在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子環(huán)境下在抗原-呈遞細(xì)胞上表達(dá)時(shí)與腫瘤或癌細(xì)胞結(jié)合并且能夠引起免疫應(yīng)答。癌抗原由癌細(xì)胞差別表達(dá)且由此可以利用靶向癌細(xì)胞。癌抗原為能夠刺激明顯的腫瘤特異性免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原中的某些由正常細(xì)胞編碼，但不一定由其表達(dá)。這些抗原的特征在于在正常細(xì)胞中通常為靜息的(即不被表達(dá))，僅在分化的某些階段被表達(dá)和暫時(shí)表達(dá)，諸如胚胎抗原和胎兒抗原。其它癌抗原由突變細(xì)胞基因編碼，諸如癌基因(例如，活化的ras癌基因)，抑制基因(例如，突變體p53)，因內(nèi)在缺失或染色體易位產(chǎn)生的融合蛋白。其它癌抗原可以由病毒基因，諸如RNA和DM腫瘤病毒上攜帶的那些基因編碼。例如，可以如CohenPA等(1994)Ca/3C"b54:1055-8中所述通過(guò)制備癌細(xì)胞的粗提取物，通過(guò)部分純化抗原，通過(guò)重組技術(shù)或通過(guò)從頭合成已知抗原由癌細(xì)胞制備癌抗原。癌抗原包括，但不限于重組表達(dá)的抗原，完整胂瘤或癌或其細(xì)胞的免疫原性部分。這類抗原可以通過(guò)重組方式或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其它方式分類或制備。腫瘤抗原的實(shí)例包括MAGE，MART-1/Melan-A，gp100,二肽基肽酶IV(DPPIV)，腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白(ADAbp),親環(huán)蛋白b，結(jié)腸直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733，癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-l和CAP-2，etv6，amll，前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1，PSA-2和PSA-3，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，T-細(xì)胞受體/CD3-^鏈，MAGE家族胂瘤抗原(例如，MAGE-Al,MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-AIO，MAGE-All，MAGE-A12，MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3),MAGE-Xp4(MAGE-B4)，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3,MAGE-C4，MAGE-C5)，GAGE家族腫瘤抗原(例如，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)，BAGE，RAGE，LAGE-1，NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，酪氨酸酶，p53，MUC家族，HER2/neu，p21ras，RCAS1，a-甲胎蛋白，E-鈣粘蛋白，a-連環(huán)蛋白，P-連環(huán)蛋白和廠連環(huán)蛋白，pl20ctn，gpl00pme1117，PRAME，M-ES0-1，cdc27，腺瘤結(jié)腸息肉蛋白(APC)，胞襯蛋白，連接蛋白37，Ig-獨(dú)特型，p15，gp75，GM2和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂類，病毒產(chǎn)品，諸如人乳頭瘤病毒蛋白，Smad族腫瘤抗原，lmp-l，PU,EBV-編碼的抗原(EBNA)-1，腦糖原磷酸化酶，SSX-l,SSX-2(H0M-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7和c-erbB-2。該目錄并非意味著起限定作用。本文所用的"過(guò)敏原"為能夠引起特征在于IgE產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的分子。過(guò)敏原還為可以在易感受試者中誘導(dǎo)過(guò)敏性或哮喘性反應(yīng)的物質(zhì)。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)過(guò)敏原意指可以引起由IgE抗體介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的具體類型的抗原。過(guò)敏原的目錄為大量的并且可以包括花粉，昆蟲(chóng)毒液類，動(dòng)物毛皮垢屑粉塵，真菌孢子和藥物(例如，青霉素)。天然動(dòng)物和植物過(guò)敏原的實(shí)例包括對(duì)下列屬具有特異性的蛋白質(zhì)犬屬(Canis)(家犬(Canisfamiliaris));表皮螨屬(Dermatophagoides)(例如，粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae));貓屬(Felis)(Felisdomesticus);豚草屬(Ambrosia)(豚草(Ambrosiaartemisiifolia));黑麥草屬(Lolium)(例如，黑麥草(Loliumperenne)和多花黑麥草(Loliummultiflorum));柳杉屬(Cryptomeria)(曰本柳杉(Cryptomeriajaponica));鏈格孢屬(Alternaria)(互格鏈格孢(Alternariaalternata));Aider,榿木屬(Alnus)(歐洲榿木(Almisgultinosa));樺木屬(Betula)(祝皮樺(Betulaverrucosa));櫟屬(Quercus)(白櫟(Quercusalba));洋橄欖屬(Olea)(油橄欖(Oleaeuropa));蒿屬(Artemisia)(艾萬(wàn)(Artemisiavulgaris));車前屬(Plantago)(例如,長(zhǎng)葉車前(Plantagolanceolata));薔草屬(Parietaria)(例如，Parietariaofficinalis和Parietariajudaica);蜚蠊(Blattella)(例如，德國(guó)小蠊(Blattellagermanica));蜜蜂屬(Apis)(例如，Apismultiflorum);柏屬(Cupressus)(例如,地中海柏木(Cupressussempervirens)，綠干^白(Cupressusarizonica)和大果柏木(Cupressusmacrocarpa));刺柏屬(Jimiperus)(例如，Jimiperussabinoides，Juniperusvirginiana，歐洲刺柏(Juniperuscommunis)和阿希刺柏(Juniperusashei));Thuya(例如，Thuyaorientalis);扁柏屬(Chamaecyparis)(例如，曰本扁柏(Chamaecyparisobt美國(guó)))；大嫌屬(Periplaneta)(例如，美洲大蠊(Periplanetaamericana));冰草屬(Agropyron)(例如，偃麥草(Agropyronrepens));黑麥屬(Secale)(例如，黑麥(Secalecereale));小麥屬(Triticum)(例如，小麥(Triticumaestivum));鴨茅屬(Dactylis)(例如，鴨茅(Dactylisglomerata));羊茅屬(Festuca)(例如，牛尾草(Festucaelatior));早熟禾屬(Poa)(例如，草地早熟禾(Poapratensis)和加拿大早熟禾(Poacompressa));燕麥屬(Avena)(例如，燕麥(Avenasativa));絨毛草屬(Holcus)(例如，絨毛草(Holcuslanatus));黃花茅屬(Anthoxanthum)(例如，黃花茅(Anthoxanthumodoratum));燕麥草屬(Arrhenatherum)(例如，燕麥草(Arrhenatherumelatius));剪股草屬(Agrostis)(例如，小糠草(Agrostisalba));梯牧草屬(Phleum)(例如，梯牧草(Phleumpratense));錄草屬(Phalaris)(侈寸:i口，箱草(Phalarisarundinacea));雀稗屬(Paspalum)(命J:fi口，Paspalumnotatum);高粱屬(Sorghum)(例如，Sorghumhalepensis);和雀麥屬(Bromus)(例如，無(wú)芒雀麥(Bromusinermis))?？贵w和ADCC本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合還增加天然殺傷細(xì)胞裂解活性和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)?？梢允褂脤?duì)細(xì)胞靶，諸如癌細(xì)胞具有特異性的抗體的組合進(jìn)行ADCC，使得受試者免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞。用于ADCC操作的抗體包括與體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生相互作用的抗體。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多這類對(duì)細(xì)胞靶具有特異性的抗體并且許多為商購(gòu)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為IgG抗體。用于本發(fā)明的治療抗體可以對(duì)抗原(例如，細(xì)菌，病毒，寄生蟲(chóng)或真菌抗原)，癌或腫瘤相關(guān)抗原和自身抗原具有特異性。優(yōu)選的抗體為那些識(shí)別和結(jié)合存在于細(xì)胞上或其中的抗原的那些。合適的抗體的實(shí)例包括，但不限于RituxanTM(利妥昔單抗，抗CD20抗體)，赫賽汀(曲妥珠單抗)，Quadramet，Panorex，IDEC-Y2B8，BEC2，C225，Oncolym，SMARTM195，ATRAGEN，Ovarex，Bexxar，LDP-03,iort6，MDX-210，MDX-11，MDX-22，OV103，3622W94,抗VEGF,Zenapax，MDX-220，MDX-447，MELMMUNE-2，MELI腿UNE-1，CEACIDE，Pretarget，NovoMAb-G2，TNT，Gliomab-H，GNI-250，EMD-72000,LymphoCide,CMA676，Monopharm-C,4B5，ioregf.r3，iorc5，BABS，抗FLK-2，MDX-260,ANAAb，SMART1D10Ab,SMARTABL364Ab，CC49(mAbB72.3)，ImmuRAIT-CEA，抗IL-4抗體，抗IL-5抗體，抗IL-9抗體，抗Ig抗體，抗IgE抗體，血清-衍生的乙型肝炎抗體，重組乙型肝炎抗體等。類似地可用于本發(fā)明的其它抗體包括阿侖珠單抗(B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病)，吉妥珠單抗奧佐米星(CD33+急性髓性白血病，)，hP67.6(CD33+急性髄性白血病，)，英夫利西單抗(炎性腸病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，依那西普(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，依那西普，MDX-210，oregovomab，抗EGF受體mAb，MDX-447，抗組織因子蛋白(TF)，(Sunol);ior-c5,c5，依決洛單抗，替伊莫單抗，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3表位的抗獨(dú)特型mAb模擬物，抗HLA-DrlOmAb,抗CD33人源化mAb，抗CD52humAb，抗CDlmAb(iort6)，MDX-22，西洛果瓦，抗17-lAmAb，貝伐珠單抗，達(dá)克珠單抗，抗TAG-72(MDX-220)，高分子量蛋白聚糖抗獨(dú)特型mAb模擬物(I-Mel-1)，高分子量蛋白聚糖抗獨(dú)特型mAb模擬物(I-Mel-2)，抗CEAAb，hmAbHll，抗DNA或DNA相關(guān)蛋白(組蛋白)mAb，Gliomab-HmAb,GNI-250mAb，抗CD22，CMA676)，GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的抗獨(dú)特型人mAb，ioregf/r3，抗iorc2糖蛋白mAb，iorc5，抗FLK-2/FLT-3mAb，抗GD-2雙特異性mAb,抗細(xì)胞核的自身抗體，抗HLA-DRAb，抗CEAmAb，帕利珠單抗，貝伐珠單抗，阿侖珠單抗，BLyS-mAb,抗VEGF2,抗Trail受體；B3mAb,mAbBR96,乳腺癌;和Abx-Cbl邁Ab。免疫球蛋白療法本發(fā)明的活性劑還可以與標(biāo)準(zhǔn)和超免疫球蛋白療法聯(lián)用。標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白療法使用由正常血液供體血清制備和采集的抗體產(chǎn)品。這種采集的產(chǎn)品包含對(duì)廣泛抗原，諸如感染性病原體中的那些(例如，細(xì)菌，病毒，諸如甲型肝炎，細(xì)小病毒，腸病毒，真菌和寄生蟲(chóng))的低滴度的抗體。超免疫球蛋白療法使用由對(duì)特定病毒具有高抗體的滴度的個(gè)體血清制備的抗體。超免疫球蛋白的實(shí)例包括帶狀皰滲免疫球蛋白(用于預(yù)防免疫受損兒童和新生嬰兒的水痘)，人狂犬病免疫球蛋白(用于被患狂犬病的動(dòng)物咬傷的受試者的咬傷后預(yù)防)，乙型肝炎免疫球蛋白(用于預(yù)防乙型肝炎，尤其是接觸病毒的受試者)和RSV免疫球蛋白(用于治療呼吸道合胞病毒感染)。給藥劑量和給藥合物中。例如，可以將連接寡核苷酸和TLR7/8配體彼此混合并且對(duì)受試者給藥或保持作為組合基本上同時(shí)接觸細(xì)胞。作為另一個(gè)實(shí)例，可以將連接寡核苷酸和TLR7/8配體在不同時(shí)間對(duì)受試者給藥或保持與細(xì)胞接觸。作為另一個(gè)實(shí)例，可以對(duì)受試者的不同部位給予連接寡核苷酸和TLR7/8配體。如上所述，術(shù)語(yǔ)"有效量"一般指的是必需或足以實(shí)現(xiàn)所需生物作用的用量。通過(guò)在各種活性化令物和加權(quán)因素，諸如功效，相對(duì)生物利用度，患者體重，不良副作用的嚴(yán)重性和優(yōu)選的給藥方式中進(jìn)行選擇，可以結(jié)合本文提供的教導(dǎo)計(jì)劃有效預(yù)防或治療方案，它不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性并且完全有效地治療特定受試者。用于任何特定應(yīng)用的有效量根據(jù)諸如所治療的疾病或疾患，給予的特定寡核苷酸，受試者的大小或所治療疾病或疾患的嚴(yán)重性這類因素的不同而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而不必使用過(guò)度實(shí)驗(yàn)確定特定連接寡核苷酸和TLR7/8配體和/或抗原和/或其它治療劑的有效量。用于全身或局部遞送本文所述化合物的受試者劑量一般在每次給藥約10ng-10mg,這取決于是每日，每周，還是每個(gè)月和它們之間的任何其它時(shí)間給予施用，否則就根據(jù)需要進(jìn)行。更一般的是，全身或局部劑量范圍在每次給藥約1mg，且最一般的是在約10pg-IOOng，其中間隔幾天或幾周給藥2-4次。高劑量可能是非腸道給藥所需的。然而，在某些實(shí)施方案中，可以使用高于上述典型劑量5-10，OOO倍范圍的用于這些目的的非腸道劑量。就本文所述的任何化合物而言，最初可以根據(jù)動(dòng)物模型測(cè)定治療有效量?？梢曰谙鄬?duì)生物利用度和給予化合物的功效調(diào)整所施用的劑量?；谏鲜龇椒ê推渌鳛楸绢I(lǐng)域眾所周知的方法將劑量調(diào)整至最大功效充分屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。給藥途徑就臨床應(yīng)用而言，可以將本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合單獨(dú)給予或?qū)⑵渑渲瞥赏ㄟ^(guò)任何合適的有效性實(shí)現(xiàn)所需治療效果的給藥途徑的遞送復(fù)合物。給藥途徑包括腸道和非腸道給藥途徑。腸道給藥途徑的實(shí)例包括口腔，胃，腸和直腸。非腸道給藥途徑的限制性實(shí)例包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，局部注射，局部，鼻部，粘膜和肺。遞送栽體可以單獨(dú)(例如，在鹽水或緩沖液中)或使用本領(lǐng)域中公知的任何遞送載體給予所述的接寡核苷酸和TLR7/8配體和/或抗原和/或其它治療劑。例如，可以將本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合直接給予受試者或與核酸遞送復(fù)合物一起給予。核酸遞送復(fù)合物應(yīng)指使用靶向方式結(jié)合(例如，離子或共價(jià)結(jié)合；或包嚢在其中)的核酸分子(例如，導(dǎo)致對(duì)乾細(xì)胞較高的親和結(jié)合。核酸遞送載體的實(shí)例包括與固醇(例如，膽固醇)，脂質(zhì)(例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)，病毒體或脂質(zhì)體)或靶細(xì)胞特異性結(jié)合劑(例如，靶細(xì)胞特異性身體識(shí)別的配體)結(jié)合的核酸。優(yōu)選的復(fù)合物在體內(nèi)可以保持充分穩(wěn)定以防止在靶細(xì)胞攝入前的顯著解偶聯(lián)。然而，該復(fù)合物可以在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)條件下裂解，以便以功能形式釋放寡核苷酸。本發(fā)明已經(jīng)描述并且可以使用的其它遞送載體包括螺旋狀物(Gould-Fogerite等，1994，1996);emulsomes(Vancott等，1998,Lowell等，1997);ISCOMs(Mowat等，1993，Carlsson等，1991，Hu等，1998,Morein等，1999);脂質(zhì)體(Childers等，1999，Michalek等，1989，1992，deHaan1995a，1995b);活細(xì)菌栽體(例如，沙門菌屬，大腸埃希氏桿菌，卡介苗，埃希氏桿菌(Shigella)，乳桿菌屬(Lactobacillus))(Hone等，1996，Pouwels等，1998，Chatfield等，1993，Stover等，1991，Nugent等，1998);肝病毒載體(例如，牛痘，腺病毒，單純皰滲)(Gallichan等，1993，1995，Moss等，1996，Nugent等，1998，F(xiàn)lexner等，1988，Morrow等，1999);微球(Gupta等，1998，Jones等，1996，Maloy等，1994，Moore等，1995，O'Hagan等，1994，Eldridge等，1989);核酸疫苗(Fynan等，1993，Kuklin等，1997，Sasaki等，1998,Okada等，1997，Ishii等，1997);聚合物(例如，羧甲基纖維素，脫乙酰殼多糖)(Hamajima等，1998，Jabbal-Gill等，1998);聚合物環(huán)(Wyatt等，1998);蛋白體(Vancott等，1998，Lowell等，1988，1996,1997);氟化鈉(Hashi等，1998);轉(zhuǎn)基因植物(Tacket等，1998，Mason等，1998，Haq等，1995);病毒體(Gluck等，1992，Mengiardi等，1995,Cryz等，1998);病毒樣顆粒(Jiang等，1999，Leibl等，1998)。其它遞送栽體為本領(lǐng)域中藥物組合物可以將本發(fā)明的TLR7/8配體和連接寡核苷酸組合配制成還包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體意指一種或多種相容性固體或液體填充劑，稀釋劑或包囊物質(zhì)，它們適合于對(duì)人或其它脊推動(dòng)物給予。載體為天然或合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)組分，將它們與活性組分合并有利于所需作用。以一種方式共同混合藥物組合物的成分，使得不存在明顯損害所需藥物功效的相互作用。就口服給藥而言，易于通過(guò)將活性化合物與本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體合并配制化合物(即連接寡核苷酸和TLR7/8配體，抗原和/或其它治療劑)。這類載體能夠?qū)⒈景l(fā)明的化合物配制成由所治療的受試者口服攝取的片劑，丸劑，錠劑，膠嚢，液體，凝膠，糖漿劑，骨劑，混懸液等?？梢垣@得作為固體賦形劑的藥物制劑，任選研磨所得混合物并且如果需要，在加入合適的助劑后加工顆?；旌衔锒玫狡净蝈V芯。合適的賦形劑特別為填充劑，諸如糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨醇；纖維素制品，諸如，例如，玉米淀粉，小麥淀粉，稻米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍樹(shù)膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，諸如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂或藻酸或其鹽，諸如藻酸鈉。任選還可以在鹽水或緩沖液中配制口服制劑，以便中和內(nèi)部酸性條件，或可以在不使用任何載體的情況下給藥。給錠芯包合適的包衣層。為了這一目的，可以使用濃糖溶液，它可以任選包含阿拉伯樹(shù)膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？梢詫⑷玖匣蛏丶尤氲狡瑒┗蝈V劑包衣層中以便鑒定或表征不同活性化合物劑量的組合?？梢钥诜褂玫乃幬镏苿┌ㄓ擅髂z制成的推入-配合式膠囊以及由明膠和增塑劑，諸如甘油或山梨醇制成的軟密封膠囊。推入-配合式膠嚢可以包含活性組分與填充劑，諸如乳糖，粘合劑，諸如淀粉和/或潤(rùn)滑劑，諸如滑石粉或硬脂酸，鎂和任選的穩(wěn)定劑的混合物。在軟膠嚢中，可以將活性化合物溶于或懸浮于合適的液體，諸如脂肪酸，液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可以加入穩(wěn)定劑。還可以使用為口服給藥配制的微球。這類微球?yàn)楸绢I(lǐng)域中充分定義的。所有口服給藥用制劑在劑量上均應(yīng)適合于這類給藥。就口含給藥而言，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)吸入裝置吸入肺道，尤其是支氣管，且更具體地說(shuō)是吸入深部肺的肺泡給予所述的化合物?？梢詠?lái)自加壓藥包或噴霧器的氣霧劑形式，借助于使用合適的拋射劑遞送化合物，所述的拋射劑，例如，二氯二氟曱烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體。就加壓氣溶膠而言，可以通過(guò)配備遞送經(jīng)計(jì)量用量的閥門測(cè)定劑量單位。本文所用的吸入裝置為給藥氣溶膠，諸如干粉形式的化合物的任何裝置。這種類型的設(shè)備為本領(lǐng)域眾所周知的并且在諸如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thEdition,1995，MacPublishingCompany,Easton，Pennsylvania,1676-1692頁(yè)中找到的描述中詳細(xì)描述。許多美國(guó)專利中也描述了吸入裝置，諸如美國(guó)專利US6,116,237。本文所用的"粉末"意指由細(xì)分散固體顆粒組成的組合物。優(yōu)選化合物可相對(duì)自由流動(dòng)并且能夠分散于吸入裝置中和隨后倍受試者吸入，使得化合物達(dá)到肺以便能夠透入肺泡。"干粉"意指具有含濕量的粉末組合物，使得顆粒易于分散于吸入裝置中而形成氣溶膠。含濕量一般低于約10y。重量(。/flW)水，并且在某些實(shí)施方案中為低于約5%w和優(yōu)選低于約3%w?？梢允褂镁酆衔锱渲品勰┗蚩梢匀芜x使用其它材料，諸如脂質(zhì)體，清蛋白和/或其它載體配制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以為具體治療應(yīng)用選擇氣溶膠劑量和遞送系統(tǒng)，諸如在下歹ij文獻(xiàn)中所述，例如Gonda,I."Aerosolsfordeliveryoftherapeuticanddiagnosticagenttotherespiratorytract,"CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems，6:273-313(1990);和Moren，"Aerosoldosageformsandformulations,"AerosolsinMedicine.Principles,DiagnosisandTherapy,Moren等,Eds.，Elsevier,Amsterdam,1985。當(dāng)需要全身遞送時(shí)，可以為通過(guò)注射，例如通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注進(jìn)行非腸道給藥配制化合物?？梢詫⒆⑸溆弥苿┲瞥蓡挝粍┬?，例如，添加了防腐劑的安瓿或多劑量容器形式。這些組合物可以采用諸如在油或含水載體中的混懸液，溶液或乳劑形式并且可以包含配制助劑，諸如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于非腸道給藥的藥物制劑包括在水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以將活性化合物的混懸液制備成適當(dāng)?shù)挠妥⑸浠鞈乙?。合適的其中溶劑或載體包括脂肪油，諸如芝麻油或合成脂肪酸酯類，諸如油酸乙酯或甘油三酯類或脂質(zhì)體。含水注射混懸液可以包含增加混懸液粘度的物質(zhì)，諸如羧曱基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖。任選該混懸液還可以包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑以便制備高濃縮溶液。可選擇地，活性化合物可以為在使用前用合適的載體，例如無(wú)菌無(wú)熱原水溶解的粉末形式。還可以將化合物配制成直腸或陰道用組合物，諸如栓劑或保留灌腸劑，例如，其包含常用栓劑基質(zhì)，諸如可可脂或其它甘油酯類。除上述制劑外，還可以將化合物配制成長(zhǎng)效制劑。可以使用合適的聚合物或疏水性材料(例如配制成在可接受油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂或?yàn)殡y溶性衍生物，例如，作為難溶性鹽配制這類長(zhǎng)效制劑。藥物組合物還可以包括合適的固體或凝膠相栽體或賦形劑。這類載體或賦形劑的實(shí)例包括，但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖類，淀粉，纖維素衍生物，明膠和聚合物，諸如聚乙二醇類。合適的液體或固體藥物劑型為例如，吸入用含水或鹽水溶液，將其微嚢化，內(nèi)螺旋化，包衣在微觀金顆粒上，包含在脂質(zhì)體上，霧化；氣溶膠；用于植入皮膚的顆?；蚴蛊湓阡h利的物體上干燥以劃入皮膚中。藥物組合物還包括顆粒，粉末，片劑，包衣片，(微)膠嚢，栓劑，糖漿劑，乳劑，混懸液，霜?jiǎng)?，滴加或具有延長(zhǎng)釋放活性化合物的制劑，在該制劑中通常如上所述使用制備賦形劑和添加劑和/或助劑，諸如崩解劑，粘合劑，包衣劑，溶脹劑，潤(rùn)滑劑，矯味劑，甜味劑或增溶劑。藥物組合物適用于各種遞藥系統(tǒng)。就遞藥方法的簡(jiǎn)單綜述，參見(jiàn)LangerR(1990)Science249:1527-33，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考?？梢詫⒈景l(fā)明的活性劑和任選的其它治療劑和/或抗原本身(凈)或以藥學(xué)上可接受的鹽的形式給予。當(dāng)用于藥物中時(shí)，這些鹽應(yīng)為藥學(xué)上可接受的，但非藥學(xué)上可接受的鹽也可以便利性地用于制備其藥學(xué)上可接受的鹽。這類鹽包括，但不限于由下列酸制備的那些鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，馬來(lái)酸，乙酸，水楊酸，對(duì)-甲苯磺酸，酒石酸，檸檬酸，曱磺酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，可以將這類鹽制備成堿金屬或堿土金屬鹽，諸如羧酸基團(tuán)的鈉，甲或鉀鹽。合適的緩沖劑包括乙酸和鹽(1-2%w/v);檸檬酸和鹽(1-3%w/v);硼酸和鹽(O.5-2.5%w/v);和磷酸和鹽(0.8-2%w/v)。合適的防腐劑包括苯扎氯銨(O.003-0.03%w/v);三氯叔丁醇(0.3-0.9%w/v);對(duì)羥基苯甲酸酯類(0.01-0.25%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。本發(fā)明的藥物組合物包含任選在藥學(xué)上可接受的栽體中包括的有效量的本發(fā)明活性劑和任選的抗原和/或其它治療劑。術(shù)語(yǔ)藥學(xué)上可接受的載體意指一種或多種相容性固體或液體填充劑，稀釋劑或包囊物質(zhì)，它們適合于對(duì)人或其它脊推動(dòng)物給藥。術(shù)語(yǔ)載體表示天然或合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)組分，將它們與活性組分合并以便有利于施用。以一種方式將藥物組合物的成分與本發(fā)明的化合物摻合并且彼此混合，使得不存在明顯損害所需藥物功效的相互作用。篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明在其它粉末中提供了鑒定TLR7/8配體和/或連接寡核苷酸的方法。該方法的步驟根據(jù)鑒定的活性劑(即配體與寡核苷酸)的不同而改變，無(wú)論配體為TLR7，TLR8或TLR7/8配體，還是用于該方法的細(xì)胞類型等。基于本文所述的教導(dǎo)，TLR7配體可以根據(jù)其刺激單獨(dú)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)，在有連接寡核苷酸存在下刺激TL8信號(hào)傳導(dǎo)(從本底水平開(kāi)始)和/或在有連接寡核苷酸存在下TLR7刺激抑制來(lái)鑒定。TLR8配體可以根據(jù)在與為連接寡核苷酸聯(lián)用時(shí)增強(qiáng)(從高于本底水平開(kāi)始)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)鑒定。配體TLR7和8(在單獨(dú)使用時(shí))的刺激可以根據(jù)這些活性的任何組合來(lái)鑒定。連接寡核苷酸可以根據(jù)其通過(guò)TLR7配體抑制TLR7，通過(guò)TLR7配體誘導(dǎo)TLR8刺激和/或增強(qiáng)來(lái)自TLR8配體的TLR8刺激的能力來(lái)鑒定。這些方法可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。體外測(cè)定記錄在實(shí)施例中。合適的讀出結(jié)果包括，但不限于用于TLR8刺激的IL-12，TNF-a和/或ifn-y和用于TLR7刺激的ifn-a。這些測(cè)定法可選擇地使用具有^l道基因的報(bào)道構(gòu)建體，所述的報(bào)道基因與對(duì)TLR7和/或TLR8信號(hào)傳導(dǎo)有應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如，NF-kB應(yīng)答元件)連接。這些構(gòu)建體描述在實(shí)施例中。這些測(cè)定法可以測(cè)定轉(zhuǎn)錄增量或減量調(diào)節(jié)，翻譯增量或減量調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)表達(dá)和/或分泌等。作為實(shí)例，TLR8配體測(cè)定法可以包括使表達(dá)TLR8的細(xì)胞(或細(xì)胞群)在有或沒(méi)有連接寡核苷酸存在下接觸測(cè)試配體。細(xì)胞優(yōu)選為表達(dá)TLR8，但不表達(dá)TLR7或TLR9的細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞對(duì)測(cè)試配體在有或免疫寡核苷酸存在下的應(yīng)答測(cè)定TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。然后將具有與沒(méi)有寡核苷酸存在下相比在有寡核苷酸存在下增強(qiáng)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)特性的測(cè)試配體鑒定為TLR8配體。該測(cè)定法還包括使用不表達(dá)TLR8或TLR9的表達(dá)TLR7的細(xì)胞分析TLR7信號(hào)傳導(dǎo)。后一種分析可以用于排除配體為在有寡核苷酸存在下轉(zhuǎn)換成TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的TLR7配體的可能性。來(lái)自使用已知配體的類似測(cè)定結(jié)果如圖12中所示。洛索立賓和immunosine(TLR7特異性配體)在有0DN6056存在下刺激TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。可以預(yù)計(jì)推定的TLR7特異性配體具有定性的類似特性。R-848(TLR7和TLR8配體)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)在有0DN6056存在下得到增強(qiáng)?？梢灶A(yù)計(jì)推定的TLR8配體具有定性的類似特性。既非TLR7，又非TLR8配體的利巴韋林在有或沒(méi)有0DN6056存在下均不會(huì)刺激TLR8信號(hào)傳導(dǎo)，表示所述測(cè)定法對(duì)TLR7/8配體的特異性。連接寡核苷酸測(cè)定法包括以包括使表達(dá)TLR8的細(xì)胞(或細(xì)胞群)在有或沒(méi)有TLR7，TLR8或TLR7/8配體存在下接觸測(cè)試寡核苷酸。如果配體為TLR7配體(單獨(dú)使用時(shí))，那么該測(cè)定法可以測(cè)定TLR7信號(hào)傳導(dǎo)抑制和/或在寡核苷酸與配體聯(lián)用時(shí)誘導(dǎo)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。如果配體為TLR8配體(單獨(dú)使用時(shí))，那么該測(cè)定法可以測(cè)定在寡核苷酸與配體聯(lián)用時(shí)與單獨(dú)使用配體時(shí)的作用相比增強(qiáng)的TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。如果配體刺激TLR7和TLR8(單獨(dú)使用時(shí))，那么該測(cè)定法測(cè)定上述讀出結(jié)果中的一種或多種?？梢詫⒃摐y(cè)定結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定比較(例如使用已知連接寡核苷酸的測(cè)定法)等。該方法還可以包括用于測(cè)定寡核苷酸自身是否為TLR7和/或TLR8配體的測(cè)定法。這些方法可以用于鑒定配體，其在單獨(dú)使用時(shí)為弱刺激性的，但在與寡核苷酸聯(lián)用時(shí)具有新的和/或增強(qiáng)的信號(hào)傳導(dǎo)特性。通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但這些實(shí)施例決不應(yīng)被視為進(jìn)一步的限定。實(shí)施例材料和方法寡核苷酸和試劑所有的寡核苷酸均購(gòu)自Biospring(Frankfurt,德國(guó))或由ColeyPharmaceuticalGmbH(Langenfeld，德國(guó))提供，鑒定和純度由ColeyPharmaceuticalGmbH控制并且具有通過(guò)鱟試驗(yàn)測(cè)定的不可檢測(cè)到的內(nèi)毒素水平(<0.lEU/ml)(BioWhittaker,Verviers，比利時(shí))。將寡核苷酸懸浮于無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的Tris-EDTA(Sigma,Deisenhofen，德國(guó))中并且在無(wú)菌條件下儲(chǔ)存和操作，以防止微生物和內(nèi)毒素污染。使用不含內(nèi)毒素Tris-EDTA進(jìn)行所有稀釋。將寡核苷酸序列列在表1和2。首先將洛索立賓(7-烯丙基-7，8-二氫-8-氧代-鳥(niǎo)苷)(Sigma)溶于INNaOH，在RPMI-培養(yǎng)基中稀釋并且使用INHC1將pH調(diào)整至7.4(19)。R-848(1-(2-羥基2-甲基丙基)-2-甲基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)在商業(yè)上由GLSynthesis(Worcester,MA，美國(guó))合成并且溶于10%DMS0。將7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷(ChemGenes，Wilmington,MA，美國(guó))以在INNa0H中1M溶解。將肌苷(Sigma)溶于H20。在不含內(nèi)毒素的Tris-EDTA中進(jìn)行所有稀釋。TLR測(cè)定表達(dá)人TLR9,TLR8或TLR7的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞如上所述(16，20)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)使用表達(dá)相應(yīng)人TLR和6xNF-kb-熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒的載體電穿孔轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體(3xl(^個(gè)細(xì)胞/孔)與洛索立賓或R-848在沒(méi)有或有ODN存在下在37X:下和加濕孵育箱中孵育16小時(shí)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)按一式三份進(jìn)行。裂解細(xì)胞并且測(cè)定熒光素酶基因活性(使用來(lái)自Perkin-Elmer,Zaventem，Belgium的BriteLite試劑盒)。參比不添加寡核普酸的培養(yǎng)基的報(bào)道基因活性計(jì)算刺激指數(shù)。細(xì)胞增殖來(lái)自健康人供體的外周血血沉棕黃層制品獲自BloodBankoftheUniversityofDiisseldorf(德國(guó))并且通過(guò)用Fico11-Hypaque(Sigma)離心純化PBMC。將細(xì)胞在371C下的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了5。/。(v/v)加熱滅活的人AB血清(BioWhittaker)或10Uv/v)加熱滅活的FCS，2mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100ng/ml鏈霉素(均來(lái)自Sigma)。細(xì)胞因子檢測(cè)和流式細(xì)胞測(cè)定分析以5xl(^個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮PBMC并且加入到96孔圓底平板中(250nl/孔)。將PBMC與不同ODN和/或洛索立賓濃度一起孵育并且在所示時(shí)間點(diǎn)采集培養(yǎng)物上清液(SN)。如果不即刻使用，那么將SN儲(chǔ)存在-20"C下，直到需要為止。使用商購(gòu)ELISA試劑盒(就IL-12p40而言，來(lái)自BDBiosciences,Heidelberg,德國(guó))，IFN-y和TNF-a(來(lái)自Diaclone，Besancon，F(xiàn)rance)或使用商購(gòu)抗體(PBL，NewBrunswick,NJ，美國(guó))研發(fā)的IFN-y的內(nèi)部ELISA評(píng)價(jià)SN中的細(xì)胞因子的量。就胞內(nèi)染色而言，在含有所示量寡核苷酸和/或洛索立賓濃度的96孔圓底平板(250jil/孔)中以5xl()S個(gè)細(xì)胞/ml孵育PBMC并且加入布雷菲德菌素A溶液(BDBiosciences),將PBMC孵育6小時(shí)。就胞內(nèi)IFN"7染色而言，將細(xì)胞與寡核苷酸和/或洛索立賓一起孵育16小時(shí)，此后添加布雷菲德菌素A溶液。采集細(xì)胞并且使用Intraprep試劑，按照制造商方案(Beckman-Coulter，Neuss，德國(guó))進(jìn)行胞內(nèi)染色。用鑒定單核細(xì)胞(CD14+)，B細(xì)胞(CD19+)和NK細(xì)胞(CD56+，CD3—)的合適抗體染色細(xì)胞。使用FACSCalibur獲取流式細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)并且使用計(jì)算機(jī)程序CellQuest分析(均來(lái)自BDBiosciences)。用于流式細(xì)胞檢測(cè)分析的所有單克隆抗體(mAb)均購(gòu)自BDBiosciences,除外來(lái)自Diaclone的CDllc，來(lái)自Immunotech(Marsei1le，F(xiàn)rance)的CD14和來(lái)自Miltenyi(BergischGladbach，德國(guó))的CD123。使用CD14細(xì)胞分離試劑盒如制造商(Miltenyi)所述從完整的PBMC中分離人單核細(xì)胞。為了測(cè)定純度，使用對(duì)CDllc和CD14的mAb染色細(xì)胞并且通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)鑒定。在所有實(shí)驗(yàn)中，單核細(xì)胞純度超過(guò)95%。將純化的單核細(xì)胞(4xl(^個(gè)細(xì)胞/ml)與增加濃度的0DN—起孵育24小時(shí)。使用BDCA-4pDC分離試劑盒如制造商(Miltenyi)所述富集PDC。通過(guò)用對(duì)CD123(來(lái)自Miltenyi)，HLA-DR和CDllc(來(lái)自BDBiosciences)的mAb染色證實(shí)PDC純化。純度約為85%。將細(xì)胞(5xl05個(gè)細(xì)胞/ml,250pl/孔)與或不與寡核苷酸和洛索立賓一起培養(yǎng)24小時(shí)。如上所述測(cè)定SN中的IFN-a或IL-12p40。結(jié)果通過(guò)與均聚物寡核苷酸共孵育對(duì)TLR8介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的序列選擇性強(qiáng)化將穩(wěn)定表達(dá)hTLR8和NF-kb-熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞與R-848(1-(2-羥基-2-曱基丙基)-2-甲基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺)在有或沒(méi)有寡核普酸存在下孵育。然后分析與不同寡核苷酸共孵育對(duì)TLR8介導(dǎo)的NF-kB活化的影響。鑒定了含有硫代磷酸主鏈的寡(dT)n均聚物0DN，即ODN6056，其顯著增加R-848刺激的NF-kB活化水平(圖1B)。單獨(dú)的0DN6056在達(dá)25jiM濃度下不會(huì)在表達(dá)TLR8的細(xì)胞中刺激明顯的NF-kB活化(不超過(guò)本底2.5倍)(未公布的數(shù)據(jù))。作用表現(xiàn)為寡核苷酸依賴性的，因?yàn)椴⒎撬袦y(cè)試的寡核苷酸均同樣充分增強(qiáng)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(例如，不相關(guān)的雜聚物(0DN1982)不會(huì)強(qiáng)烈影響R-848的NF-kB活化)。R-848與ODN6056共孵育不僅增加了TLR8功效，而且顯著提高了TLR8活化效能。R-848的EC50在有0.1ODN6056(0.1ODN6056:EC50(R-848)=4.9jiM，即來(lái)自三次實(shí)驗(yàn)的平均值；單獨(dú)的EC50(R-848)>3(VM)存在下已經(jīng)顯著下降。然而，高濃度的ODN6056更加降低了EC50(1jaMODN6056:EC50(R-848)=1.4juM;5一ODN:EC50(R-848)=0.4^M)。這種作用對(duì)ODN6056為特異性的，因?yàn)閷?duì)ODN1982而言EC50下降得相當(dāng)?shù)?5jiM1982:EC50(R-848)=19.0jiM)。與對(duì)TLR8的刺激作用相反，ODN6056(或ODN1982)與表達(dá)hTLR9的HEK293細(xì)胞上的TLR9配體CpGODN2006共孵育不會(huì)影響CpG介導(dǎo)的NF-kB刺激(未公布的數(shù)據(jù))。研究了用于觀察到的增強(qiáng)作用的可能的序列要求并且測(cè)試了幾種不同的硫代磷酸酯均聚物(表1)。寡(dT)(ODN6056)具有最強(qiáng)的促進(jìn)特性，隨后是寡(dU)n(SEQIDNO:11)和寡(dA)17(SEQIDNO:12)。對(duì)寡(dC)n(SEQIDNO:13)和隨機(jī)化寡(dN)15檢測(cè)到了顯著性的增強(qiáng)下降。雜聚物ODN1982僅表現(xiàn)出最低的活性增強(qiáng)，而寡(dG)"(SEQIDNO:14)不具有增強(qiáng)活性，而是抑制R-848介導(dǎo)的NF-kB刺激。具有磷酸二酯主鏈的ODN6056的序列不影響TLR8介導(dǎo)的刺激。寡核苷酸的長(zhǎng)度也表現(xiàn)出具有影響寡(dA)"(SEQIDNO:15)與R-848表現(xiàn)出的協(xié)同作用低于寡(dA)n(SEQIDNO:12)。在有均聚物T寡核苷酸存在下TLR7特異性配體對(duì)表達(dá)TLR8的細(xì)胞的刺激作用R-848為hTLR7和hTLR8的配體(16)，而將洛索立賓(7-烯丙基-7，8-二氫-8氧代-鳥(niǎo)苷)描述為TLR7特異性配體(18)。濃度達(dá)10mM的洛索立賓不會(huì)活化用hTLR8或hTLR9轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)，但活化hTLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)(圖2A)。盡管為TLR7配體，但是將表達(dá)hTLR8的HEK293細(xì)胞與洛索立賓和寡核苷酸共孵育活化了NF-kb信號(hào)傳導(dǎo)(圖2B)。這種濃度依賴性作用僅在有ODN6056，而非ODN1982存在下觀察到(圖2B)。使用另一種TLR7配體，7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷進(jìn)行類似的觀察(18)。單獨(dú)的7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷在達(dá)5mM濃度和沒(méi)有ODN6056存在下對(duì)表達(dá)hTLR8的細(xì)胞無(wú)活性，但在有ODN6056存在下刺激TLR8介導(dǎo)的NF-kB活化。還將表現(xiàn)出以非特異性方式活化HEK293細(xì)胞中的NF-kb信號(hào)傳導(dǎo)的化合物肌苷(未公布的數(shù)據(jù))與表達(dá)的hTLR8的HEK293細(xì)胞上的ODN6056共孵育(圖2C)。肌苷在有ODN6056存在下對(duì)NF-kB的活化與達(dá)10mM濃度的肌苷的非特異性活化相比未改變。使用基于腺苷的化合物6-氨基-9-節(jié)基-2-丁氧基-9H-嘌呤-8-醇觀察到了類似的作用。在單獨(dú)使用時(shí)，該化合物為TLR7配體，但不是TLR8配體(圖9A和9B)。在有聚(dT)17連接寡核苷酸存在下使用時(shí)，它濃度刺激TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(圖9B)。TLR7信號(hào)傳導(dǎo)的序列依賴性抑制這些數(shù)據(jù)表示小分子TLR7配體在有某些寡核苷酸存在下誘導(dǎo)TLR8依賴性NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)。盡管如此，但是在表達(dá)TLR7的HEK293細(xì)胞中，作用相反。寡核苷酸實(shí)際上如圖1A，3和9A中所示抑制通過(guò)TLR7特異性配體和TLR7/8配體的TLR7介導(dǎo)的NF-kB活化。這種作用表現(xiàn)為序列-非特異性，因?yàn)槠駷橹顾袦y(cè)試的硫代磷酸寡核苷酸內(nèi)抑制hTLR7活化(未公布的數(shù)據(jù))。使用RNA連接寡核苷酸的TLR8配體信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)使用R-848為TLR7/8配體和基于RNA的連接寡核苷酸進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。圖10表示混合的序列寡核苷酸和聚(rUK寡核苷酸對(duì)hTLR8-LUC-293細(xì)胞中，NF-kB刺激的作用。聚(rU)u寡核苷酸(rU'rU*rU'rU.rirrU'rU*rlTrU.rU*rU*rU*rU.rU.rU.rU.rU*rU;SEQIDNO:5)在單獨(dú)使用時(shí)通過(guò)TLR8傳導(dǎo)信號(hào)，正如使用該寡核苷酸使NF-kB輕度活化所證實(shí)的(圖10)。混合的序列RNA寡核苷酸(rG*rC*rC*rA.rC.rC.rG.rA'rG'rC'rC*rG.rA.rA'rG'rG*r(TrA.rC.rC;SEQIDNO:16)在單獨(dú)使用時(shí)不會(huì)通過(guò)TLR8傳導(dǎo)信號(hào)。在圖11中，將hTLR8-LUC-HEK293細(xì)胞與增加量的R-848在有如下物質(zhì)存在下孵育(a)TE和50pg/mlD0TAP，或(b)5所示ORN，在有50ng/mlD0TAP存在下。在16小時(shí)后通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性確定NF-kB的刺激。參比僅有培養(yǎng)基存在下的本底計(jì)算刺激指數(shù)。該圖表示聚(rll)is寡核苷酸對(duì)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的作用在該寡核苷酸與R-848聯(lián)用時(shí)得到顯著增強(qiáng)(圖11)。既非TLR7，又非TLR8配體的混合的序列RNA寡核苷酸也如圖11中所示通過(guò)R-848增強(qiáng)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。數(shù)據(jù)表明基于RNA的寡核苷酸也可以作為連接物起作用。洛索立賓與寡(dT)170DN共孵育改變?nèi)薖BMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子特性研究了洛索立賓與ODN6056和1982共孵育對(duì)人免疫細(xì)胞的作用。與單獨(dú)的洛索立賓孵育刺激了人PBMC產(chǎn)生IFN-a(圖4A)。然而，在有增加濃度的ODN存在下，洛索立賓誘導(dǎo)的IFN-a降至本底水平。盡管使用ODN均觀察到了這種作用，但是ODN6056看起來(lái)基于更強(qiáng)的抑制作用。還研究了其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生。單獨(dú)的洛索立賓僅誘導(dǎo)最少量的IL-12p40從人PBMC中分泌(圖4B)。相反，在有ODN6056存在下，IL-12p40大量產(chǎn)生，而相同濃度的ODN1982與洛索立賓不會(huì)誘導(dǎo)高于使用單獨(dú)培養(yǎng)基的本底的IL-12p40。對(duì)IL-12p70(未公布的數(shù)據(jù))和IFN-Y獲得了類似的結(jié)果(圖4C)。在將洛索立賓和ODN6056共孵育時(shí)也刺激了TNF-a產(chǎn)生。然而，當(dāng)將ODN1982與洛索立賓共孵育時(shí)觀察到了TNF-a產(chǎn)生，不過(guò)，明顯低于與ODN6056共孵育獲得的結(jié)果。單獨(dú)的ODN和洛索立賓中沒(méi)有一種可誘導(dǎo)顯著水平的TNF-a分泌(圖4D)。在使用洛索立賓和寡(dTLODN共刺激時(shí)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p40和TNF-a洛索立賓與0DN的組合活化了表達(dá)TLR8的HEK293細(xì)胞，但抑制了TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。據(jù)推定人TLR8-陽(yáng)性免疫細(xì)胞為IL-12和TNF-a的主要來(lái)源并且TLR7-陽(yáng)性pDCs為IFN-a的主要來(lái)源。不胞內(nèi)FACS染色揭示出大部分CD14+細(xì)胞在人PBMC與洛索立賓和ODN6056共孵育時(shí)產(chǎn)生TNF-a(圖5A)。單獨(dú)的洛索立賓或與ODN1982組合僅產(chǎn)生少量TNF-陽(yáng)性單核細(xì)胞。IL-12-陽(yáng)性單核細(xì)胞的百分比低于TNF-a的百分比。然而，洛索立賓與ODN6056組合的協(xié)同作用對(duì)胞內(nèi)IL-12而言可明顯檢測(cè)到(圖5B)。在使用ODN和洛索立賓刺激時(shí)，三次實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有一次可以在CD19+B細(xì)胞中檢測(cè)到胞內(nèi)IL-12或TNF-a(未公布的數(shù)據(jù))。還研究了IFN-Y的細(xì)胞來(lái)源。洛索立賓與ODN組合刺激了高IL-12水平，并且在先研究證實(shí)IL-12誘導(dǎo)NK細(xì)胞中的IFN"Y分泌(21-23)。因此，在人NK細(xì)胞中評(píng)價(jià)IFN，產(chǎn)生(圖6)。實(shí)際上，NK細(xì)胞中的IFN-"/產(chǎn)生可以在人PBMC與洛索立賓和ODN6056共孵育時(shí)觀察到，不過(guò)，單獨(dú)的刺激不會(huì)誘導(dǎo)如通過(guò)來(lái)自人PBMC上清液的IFN-y蛋白質(zhì)ELISA的所證實(shí)的明顯IFN-y產(chǎn)生。為了證實(shí)作為對(duì)洛索立賓和ODN6056應(yīng)答的單核細(xì)胞的直接TLR介導(dǎo)的刺激，純化來(lái)自人PBMC的單核細(xì)胞并且與洛索立賓在有或沒(méi)有ODN6056或1982存在下孵育。分離的單核細(xì)胞僅產(chǎn)生IL-12p40(圖7A)或TNF-a(未^^布的數(shù)據(jù))作為對(duì)兩種刺激物洛索立賓和ODN6056組合的應(yīng)答。人PBMC與小免疫調(diào)節(jié)化合物類R-848或洛索立孵育誘導(dǎo)pDCs的IFN-a產(chǎn)生(圖7B和(24，25))。因此，ODN6056由洛索立賓刺激的對(duì)IFN-a產(chǎn)生的抑制作用已經(jīng)成為pDCs中TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)抑制的直接結(jié)果。為了研究這種可能性，分離人pDCs并且使用洛索立賓在有寡(dT)n均聚物或雜聚物ODN(圖7B)存在下刺激。富集的人pDC在與但的洛索立賓孵育時(shí)產(chǎn)生大量IFN-a。相反，在與ODN6056或ODN1982共孵育時(shí)消除了IFN-a產(chǎn)生。此外，ODN6056的抑制作用表現(xiàn)為強(qiáng)于ODN1982的抑制作用，因?yàn)橄齀FN-a產(chǎn)生所需的0DN濃度較低。圖8表示使用TLR8-LUC-293細(xì)胞生成的數(shù)據(jù)。使用恒定濃度的R-848(50微摩爾)和增加量的指定ODN。將單獨(dú)的R-848的焚光素酶讀出結(jié)果設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)化的100%。結(jié)果如左側(cè)組所示。圖8右側(cè)組表示增加的T含量在有增加量的R-848存在下的l微摩爾17mer聚C寡核苷酸中的作用。甚至使用兩種胸苷均增強(qiáng)了活性并且使用6種或6種以上胸苷活性顯著增加。討論本發(fā)明的數(shù)據(jù)證實(shí)可以在有某些硫代砩酸ODN存在下調(diào)節(jié)hTLR8的能力。hTLR8最接近與hTLR7(26)相關(guān)，正如小免疫刺激化合物R-848活化hTLR7和hTLR8的能力所反映出的(16)。然而，hTLR7對(duì)R-848的刺激比hTLR8更為敏感，因?yàn)門LR7活化需要的R-848濃度較低。R848與硫代磷酸寡(dT)n共孵育使得TLR8對(duì)R848的刺激更敏感并且抑制TLR7活化，不過(guò)這種單獨(dú)的T均聚物對(duì)這些TLR中任一種沒(méi)有明顯的作用。為了測(cè)定T均聚物是否可以影響其它刺激物的TLR活化，研究了其對(duì)兩種TLR7配體，即洛索立賓和7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷的作用，它們不刺激TLR8(18)。令人意外的是，就兩種配體而言，寡(dT)"的存在導(dǎo)致從TLR7-完全轉(zhuǎn)換成TLR8依賴性NF-KB活化，其中寡(dT)n抑制TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)?？赡艿那闆r是，人TLR8可以基因?qū)β逅髁①e的弱親和結(jié)合，它可能無(wú)法在可利用的生物測(cè)定法中檢測(cè)到。某些寡核苷酸的存在可以通過(guò)未知的機(jī)制增強(qiáng)洛索立賓對(duì)TLR8的親和力，使得可以檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的洛索立賓介導(dǎo)的TLR8刺激。不能排除寡核苷酸對(duì)一般信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)或攝取機(jī)制影響的可能性。然而，寡(dT)n對(duì)使用hTLR7(NF-KB信號(hào)傳導(dǎo)抑制)，hTLR9(無(wú)作用)或hTLR8(信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)烈增強(qiáng))轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞具有不同作用方式這一事實(shí)強(qiáng)烈反對(duì)了這一可能性。觀察到的協(xié)同作用并不限于異常表達(dá)TLR8的細(xì)胞。人TLR7主要在pDCs和B細(xì)胞中表達(dá)。這些細(xì)胞不表達(dá)TLR8，而TLR8在骨髓細(xì)胞中表達(dá)(27-30)。實(shí)際上，測(cè)定具有內(nèi)源性TLR8表達(dá)的人免疫細(xì)胞，諸如單核細(xì)胞中洛索立賓和ODN對(duì)細(xì)胞因子(IL-12和TNF-a)產(chǎn)生的協(xié)同作用。相反，大部分洛索立賓和R-848誘導(dǎo)的IFN-a通過(guò)人pDC中的TLR7活化產(chǎn)生(我們的數(shù)據(jù)和(4，24,25))。這些TLR7刺激物活化pDC中的IFN-a產(chǎn)生因與硫代磷酸0DN孵育而受到完全抑制，這與在TLR7-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的抑制作用一致。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞或pDC中硫代磷酸ODN抑制TLR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中不存在明顯的序列依賴性，這與對(duì)TLR8觀察到的序列-選擇性刺激作用相反。ODN與洛索立賓的組合不僅導(dǎo)致從pDC-衍生的IFN-a轉(zhuǎn)換成單核細(xì)胞-衍生的IL-12和TNF-a，而且導(dǎo)致IFN，從NK細(xì)胞中分泌。人NK細(xì)胞缺乏TLR7和TLR8表達(dá)(31),使得NK細(xì)胞-衍生的IFN，的刺激表現(xiàn)為可能由IL-12介導(dǎo)的間接作用(32)。在簡(jiǎn)單添加某些寡核苷酸時(shí)共同觀察到了洛索立賓介導(dǎo)的免疫作用特性的完全改變。此外，這些數(shù)據(jù)指出了使用為最有效的ODN的富含硫代磷酸T的ODN的一定序列依賴性作用，所述的ODN可以與TLR7特異性配體聯(lián)用以便活化TLR8。一些報(bào)道表明骨髄樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)mRNA水平上的TLR7和TLR8(27-29)。沒(méi)有可利用的表示在這些細(xì)胞中實(shí)際TLR蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)。在這些實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到洛索立賓對(duì)單核細(xì)胞的直接刺激。相反，僅洛索立賓與寡核苷酸的組合誘導(dǎo)單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞因子產(chǎn)生。這些結(jié)果反對(duì)了TLR7在單核細(xì)胞中的功能性表達(dá)將指出TLR8作為由寡核苷酸和洛索立賓靶向的受體。此外，單獨(dú)的洛索立賓不會(huì)誘導(dǎo)大量的IL-12,但報(bào)道了R-848誘導(dǎo)的人PBMC中產(chǎn)生IL-12(29)，這與R-848刺激TLR的能力一致(16)。使用刺激兩種身體的化合物在可以表達(dá)TLR7和TLR8的細(xì)胞中活化TLR至明顯差異極為困難。Ito等(33)報(bào)道了在使用R-848刺激時(shí)，mDC產(chǎn)生IL-12,但不產(chǎn)生IFN-a。相反，在使用R-848或其它TLR配體刺激時(shí)，pDC不產(chǎn)生IL-12,但不產(chǎn)生IFN-a(25)，表明了TLR8介導(dǎo)的IL-12在mDC中的誘導(dǎo)和TLR7介導(dǎo)的在pDCs中的IFN-a誘導(dǎo)。甚至R-848或洛索立賓與寡(dT)nODN共孵育也不會(huì)導(dǎo)致人pDC產(chǎn)生IL-12,這提示這種信號(hào)不足以活化pDC中的適當(dāng)途經(jīng)。引起關(guān)注的是推定模型，其中某些TLR可以具有(可能為變構(gòu)的)寡核苷酸可以結(jié)合并且作為效應(yīng)分子起作用的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。就TLR7而言，硫代磷酸寡核苷酸表現(xiàn)出作為拮抗劑起作用。因此結(jié)合寡核苷酸的TLR7可以抑制TLR7配體與其結(jié)合囊結(jié)合或例如，通過(guò)加劇受體內(nèi)的正確構(gòu)象改變校正下游信號(hào)傳導(dǎo)。另一方面，富含T的寡核苷酸與TLR8結(jié)合可以作為能夠增加R-848或其它小分子配體類洛索立賓與活性TLR8結(jié)合嚢結(jié)合或增加下游信號(hào)傳導(dǎo)的(變構(gòu))活化劑起作用。目前不能確定是存在涉及的兩種結(jié)合域，還是在相同位點(diǎn)上出現(xiàn)小分子配體結(jié)合和效應(yīng)0DN結(jié)合。已知來(lái)自幾種不同家族的受體的變構(gòu)增強(qiáng)子。例如，Knoflach等(34)報(bào)道了作為親代謝性谷氨酸鹽受體，即大量G蛋白偶聯(lián)身體家族的變構(gòu)促進(jìn)劑起作用的兩類小分子的鑒定。對(duì)受體結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析定位于跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的促進(jìn)劑結(jié)合位點(diǎn)。其它研究表明小分子可以作為覃毒堿性乙酰膽堿受體的變構(gòu)促進(jìn)劑起作用(35)。某些2-氨基噻吩類作為腺苷受體Al變構(gòu)促進(jìn)劑通過(guò)穩(wěn)定配體-受體-G-蛋白三元復(fù)合物和增加空受體與G-蛋白結(jié)合(38)起作用(36，37)。令人感興趣的是，Gao等(39)發(fā)現(xiàn)一系列咪唑并喹啉衍生以便作為結(jié)合在人A3腺苷受體上的激動(dòng)劑的變構(gòu)促進(jìn)劑起作用。近來(lái)Rutz等(40)使用SPR生物傳感器分析證實(shí)用小分子直接阻斷CpG0DN與純化的TLR9蛋白結(jié)合。他們的發(fā)現(xiàn)表明這些分子與TLR9胞外域直接結(jié)合，從而作為TLR9介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑起作用。因此，所述的寡核苷酸和小分子可以直接結(jié)合TLR7和8。使用分離的蛋白質(zhì)和相應(yīng)受體配體的結(jié)合研究可以進(jìn)一步洞察到小分子TLR配體與寡核苷酸的組合對(duì)TLR7或TLR8的確切作用機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)理解TLR的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制以及藥物研究和藥物研發(fā)具有重要意義。本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)TLR家族的兩個(gè)成員TLR8和TLR7的信號(hào)傳導(dǎo)活性可以由存在或不存在的某些寡核苷酸操縱。這些結(jié)果共同提示了使用洛索立賓(或其它小分子)與某些寡核苷酸的組合改變免疫應(yīng)答的新方式。通過(guò)這些分子的組合能夠通過(guò)使其信號(hào)傳導(dǎo)再定向于不同TLR來(lái)改變TLR小分子配體的細(xì)胞因子特性。改變或加強(qiáng)的免疫應(yīng)答對(duì)治療各種疾病可能是有益的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表l:不同ODN對(duì)R-848活性的協(xié)同作用的比較將表達(dá)hTLR8和NF-KB報(bào)道構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞與50jiM的R-848在沒(méi)有或有5jiM所示ODN存在下孵育。將在沒(méi)有ODN存在下R-848引起的NF-kB刺激設(shè)定為100%并且由此計(jì)算對(duì)R-848活性的作用。數(shù)值代表2-4次實(shí)驗(yàn)的平均值(土SD)。"N"表示隨機(jī)順序的A，C，G或T,""表示硫代磷酸酯主鏈，"-"表示磷酸二酯主鏈。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.Schetter,C.andJ.Vollmer.2004.ToU-likerecq)toisinvolvedintheresponsetomicrobialpathogens:DevelopmentofagonistsfortoMkereceptor9.C"rm"C(pz'm'oMf"Drug2.KriegA-M.2003.CpGraotifi:theactiveingredientinbacterialextracts淑,A/ed.肌3.AkirajS.2003.MammalianToll-likereceptors.Cwr.Qpi'n,/附/wwMo/.4.H喊F.，P.Ahmad-Nej喊H.Henra^ELHochrei^RAmpaiberger,T.GellettH.DidrichGLipfoi^KTalced^S.Akira^tLWagner,andS.Bauer.2003.TheToll-likerccq)tor7(ILR7>specificstimulusloxoribineuncoversastrongreMond^pwithintheTLR7，8and9subfk^ily.5.DieboldjS.S.，T.KashajHHarani,S.AJdr^andReiseSousa2004.IhnateantiviralreqxosesbymeansofTLR7-mediatedrecognitionofsingb^strandedRNA-5We"ce鄉(xiāng)""-/5>/.6.LundjJ.M，L.Alexopoulou^Sato，M.Karow，N.C.Adams,N,W.Gal&人IwasakijaodlL人Flavell.2004.RecogDitionofsin^strandedKNAvirusesbyToll-likereceptor7.7.Matsumoto,]VL，ICFunam^M.Tanabe，HOshiuni^MShingai^Y.Seto,人Yamaraoto，andT.Seya2003.Subcellularlocalizationoftoll陽(yáng)likereceptor3inhumandendriticcells.JJ)n附Mwoi8.Lafc^E,人Schoenaneyer,A.Vis5ntii^ICA>Fitzgeral4B,G.Morik^C.F.Knetter,E.Ii叫N.J.Nil^T.EspevflgandD.T.Golenboclc2鵬.TLR9signalsaftertranslocatingfitxntheERtoCpGDNAin1helysosome./"wm""oA9.Ahmad-Ngad^P.，ILHadoer，M.RutZjS.Baua;R1VLVabulas,andHWagner.2002.BacterialPpG-DNAaiidipopolysaccharidesactivateToll-likereceptorsatdistinctcellularconqjartments.10.Aldi^S.andKTakedjL2004.TolHikeieceptorsignaDin各胸Jev.J雨ww/.(柳J".11.Kob6jB.andAV.Kajava2001.Theleucin&ridhiqjeatasaproteinrecognitionmotif.12.BeltJ.K,G.E.Mull叫C.人Leifer，AMazzoiiD.RDavies，andD.MSegal2003.Loicin"ridhiq)eatsandpafliogenrecognitioninToll-likerecqjtors.!>ed!s加/mm"o/.13.UhlmannjE.andJ,Vollmer.2003.Recoitadvancesinfliedevdcpmentofinmiunostiraulatotyoliganucleotides.Owrr.q3z'".i>MgZtocov.Z>eve/.<U(W-2/7.14.HeiljF.,IlHeraraijIIHochrdnjF.Ampenberga，C.101801111^S.Akin^G.Upfo喊H.Wagner,andS,Bauer.2004.Species-specificrecognitionofsdn^strandedRNAviatoll-likerecqptor7and8.iSfcie"ce303:"26-"".15.UlevitohjRJ.2004.Tteeqjeuticstargetingfeeinnateimmunesystem.16.J昧M.,F.HeM.Vollmer，C.Schetter,A_M.Rrie&KLWagner,G.Iipfoidj3ndS.B加er,2002.:HumanTLR7orTLR8independentlyconferresponsivenessto1heantivirkcompomd848.軀/畫""o/.丄'柳.17.Hemmi，II,T.Kaidio，O.TakeucliS.Sato，HSanjo,KHoshino,T.Horiudii,HLTomizawa^BCTalced^andS.Akiia2002.Smallanti-viralcompoundsactivateimmunecellsviatheTLR7MyD88"dependentsignalingpathway.胸./顧m'i。/.18.Lee，J.，T.KChuan&V.Redecke，L.She,P.M.Pith^D,ACarson^E.Ra^andH.B.Cottana2003.Molecularbasisfortheimmunoslimulatoryactivityofguaninenucleosideanalogs:activationofToll-likereceptor7.尸rac,A^/.^carf,Sd.C/S.AJ00,.6似tf-(56J/.19.GoodmanMG，久B.Reilz^RCh叫M.D.BobaidtJ.H.GoodmanandB.LPope.1995.Selectivemodulationofelementsoftheimmunesystembylowmoleciilarweightnucleosides.20.Bauer,S.,C.J.Kiredhnin&H.Hadcer，V.Redecke,S.Hausmara^S.Akira^ELWagner,andG,B.IJpfont2001.Humantlr9confersresponsivenesstobacterialDNA_viaspecies-specificQjGmotifrecognition.P,.oc,油f"c。dL敗P27-P2C21.MagramJ.,S.E>Conoau幽toi^RRWarrier，D.IV!Carvaj"C.Y.Ferrante，C.Stewai^U.Sarmiento，D.入F必erty，andMICGately.1996.IL"12"deficientniicearedefectiveinIFNgammaproductionandtypelcytokinere^jonses.J"wnw"^.4:47J柳.22.Thierfelder,W,E.，J.M.vanDeuis叫ICYamamoto,ItA<Tripp,S.ItSarawar，ItT.Careoi^M，Y.Sangter,D.Vignali，P.C.Ddi^ty,G.CGrosvel4andlN.Me.1996.ReqviirenaentforStat4ininterleukiivl2-mediate^regx>nsesofnaturdkillerandtcells.mm/*e23.Trinchieri,G2003.toterieukin-12and&eregulationofinnateresistanceandadaptiveinraiunity,24.LorejKL,:MRBettsJ.M.Brenchley,J.Kurt^S.KhojastelwS.Perfetto,M.Roederei，RASedo;andR人Roup.2003.Toll-likeReceptorLig91iisModulateDewiriticCellstoAugmentCytomegalovirus"andHTV-l"SpecificTCellRfisprases.J./m附tmo/.■/72:4320-25.Qibsoi^S.J.，J.MIindl^T.RJRiter,RMGkasouLM.Ro鵬AEJUUer,J.LOesterid^KB.Gordet^X.QM.W.McKane，RJ,Noefl&RK繊er，RMKedl^P-Fitegeral(i-Bocarsly,MAToma^andJ.P.Vasiiakos^2002.flasroacytoiddendriticcellsproducecytoldnesandmatureintesponsetotheTLR7agonist^JmiquimodandiesiquimodCe〃加柳"o/.26.Du^5C，A^Po加喊Y.We^andB.Beufler.2000.TTireenovelmammaKantol國(guó)Ukereceptors:genestractoe，esqMessi叫andevoluli(Mi五MrQ^o/ri"eJVe/)v.".'362-37_/27.Jarrossay，D.，G.Napolitani，M,ColoimajF.Sallusto,andA-Lanzavecchia.2001.Slpedali^ationandocaiplQiientatityinmicrobialmoleculerecogniiionbytxum処myeloidandplasmacytoidd^idriticcells.jEw/".XTm鵬'!0/.3/，'33S5-3393.28.Kru&A^，ATowarowskiS.Bri喊S.Roflieo&sser,V.Ho放un&ILBals，T.Giese，H.EngdmaraijS.EndreSjA.M.Kiieg，and(3.HartmaraL2001.Toll-likereceptoreaqwes^onrevealsC^)GDNAasBuaiqueniictDhia]stimulusforplasmacytoiddendriticcdlsw^ichsynei^zeswiftiCD401igandtoinducehi^bamounteofIL-12.五wj;/卿""o/.3/,.鄉(xiāng)<5-柳7.29.Ito,T，RAraatew^T.Kaisho,HLHanmijJCTq'ima^K.Uehira^Y.OzaH，H.Toraizawa^S.Xkir^andS.FWcuhaiu2002.foterfeton-a]phaandinterieukin-2areinduceddiflfeenliallybyToll-likereceptor7ligandsinhumanblooddendriticcellsubsets./9J:/iW-30.IwasaH人andRMedzhitov.2004.ToMkerecq3tar咖trooftheadaptiveimmuneresponses,艦/m加"加/.工請(qǐng)-鄉(xiāng)31.HomungV>S.Roflieo&ssa",S.Britschj人Krug,B,Jahrsdorfer,T.Giese,S,Bn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