專利名稱：新的禽類細(xì)胞因子及編碼其的遺傳序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及新的具有禽類細(xì)胞因子性質(zhì)的重組多肽以及編碼其的遺傳序列。 本發(fā)明具體涉及重組禽III型干擾素多肽及編碼其的遺傳序列，以及其細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng) 用。本發(fā)明更具體涉及禽類干擾素-λ (IFN-λ)及其功能衍生物、同系物和片段以及其使 用方法。本發(fā)明的分子和細(xì)胞具有廣泛應(yīng)用范圍，用于包括但不限于提供治療和預(yù)防疾病、 具體是禽類動(dòng)物疾病的手段和方法，或者用作免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還提供了篩選免疫 應(yīng)答的診斷手段及鑒別蛋白或核酸功能性的調(diào)節(jié)劑的篩選手段。
背景技術(shù)：
本說明書中由作者引用的出版物的目錄按字母順序列于本文描述結(jié)束處。說明書中對(duì)任何現(xiàn)有公開文獻(xiàn)(或來自其的信息)或任何已知事物的引用不是也 不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是以任何形式承認(rèn)或認(rèn)可所述現(xiàn)有公開文獻(xiàn)(或來源于其的信息)或已知事 物構(gòu)成本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的已知常識(shí)。重組DNA技術(shù)的快速完善(sophistication)極大地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的研 究。細(xì)胞因子研究特別重要，尤其是這些分子調(diào)節(jié)許多細(xì)胞如參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞的 增殖、分化和功能。給予重組細(xì)胞因子或者調(diào)解細(xì)胞因子功能和/或合成逐漸成為治療眾 多人和動(dòng)物疾病的醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)。干擾素(IFN)代表在脊椎動(dòng)物中通過調(diào)節(jié)已知稱作IFN刺激基因(ISG)的數(shù)百個(gè) 基因而產(chǎn)生不同細(xì)胞作用的一組細(xì)胞因子。IFN呈現(xiàn)出多功能作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期 以及誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答，其主要形成全部免疫應(yīng)答。IFN的最為公認(rèn)的特性之一是其誘導(dǎo) 細(xì)胞對(duì)病毒抗性的能力(Hwang et al 1995，PNAS)。脊椎動(dòng)物IFN由三種類型組成，基于其結(jié)構(gòu)、受體特異性以及其誘導(dǎo)的途徑而加 以分類(Smith et al.，2005 ；Theofilopoulos et al. ,2005)。I型IFN包括IFN α，其在脊椎動(dòng)物基因組中有許多表現(xiàn)形式(Meager，2002)；以 及包括IFNii，通常由單個(gè)基因表示(Schultz et al.，2004)。I型IFN在檢測(cè)許多病毒時(shí) 被激活(Jacobs and Langland 1996 ；Majde 2000)，且一旦激活則與其受體IFN α / β受體 (IFN α / β R)相互作用，從而誘導(dǎo)導(dǎo)致IFN-特異性抗病毒保護(hù)作用的ISG亞型(亞集)(de Veer et al. ,2001 ；Takaoka and Yanai2006)。I型IFN的治療應(yīng)用已經(jīng)成功用于保護(hù)哺 乳動(dòng)物免于病毒感染，所述病毒包括流感病毒(Beilharz et al. ,2007 ；Koerner et al.， 2007)、丙型肝炎病毒(Marcello et al.，2006)以及一些其它病毒(Kotenko et al.，2003 ； Sheppard etal. ,2003 ；Meager et al. ,2005)。II 型 IFN 組由一個(gè)成員 IFNy (Schroder et al.，2004)組成。IFNy 通過 IFNy 受體(IFNyR)激活抗病毒活性以及細(xì)胞免疫性(Kamijo et al.，1994 ；Schroder, et al.， 2004)。這個(gè)IFN還證實(shí)抗病毒活性，包括針對(duì)Foot and Mouth Disease (FMD)病毒(Moraes et al.，2007)、多瘤病毒(Abend et al.，2007)及其它病毒(Chesler et al.，2003)的抗 病毒活性，且已經(jīng)相似地用作針對(duì)多種病原體的治療劑(Schroder et al.，2004)。近年來報(bào)道了在哺乳動(dòng)物中的第三種IFN家族，III型IFN，目前其具有三個(gè)已知
6亞型IFN λ 1 (也稱作 IL29)、IFN λ 2 (也稱作 IL28A)和 IFN λ 3 (也稱作 IL28B) (Sheppard, et al.，2003)。哺乳動(dòng)物IFNλ成員與獨(dú)特的受體復(fù)合物相互作用，所述受體復(fù)合物由 IFNA 受體 I(IFNXRl)和 ILlO 受體 β (ILlORP)組成(Donnelly et al. ,2004) 這些亞 單位受體在配體結(jié)合時(shí)二聚，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活物(STAT) (Kotenko et al.，2003 ；Donnelly et al.，2004)，使得 IFN λ -特異性基因集合活化(Ank et al.，2006 ； Marcello et al.，2006)。盡管其 ILlO-樣信號(hào)復(fù)合物(Sh印pard et al.，2003 ；Donnelly et al.，2004)，但是哺乳動(dòng)物IFN λ呈現(xiàn)出類似I型IFN的抗病毒性質(zhì)(Meager et al.， 2005).因此，看起來IFNX可以通過另一種受體復(fù)合物誘導(dǎo)I型IFN樣基因亞集(Marcello et al. ，2006)。對(duì)于人INF λ (HuIFNA)進(jìn)行的一些研究表明IFNX抑制病毒的潛力。例如已經(jīng)證 實(shí)HuIFNA II在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制丙型肝炎病毒(Robek etal.，2005 ；Marcello et al.，2006)。這種保護(hù)作用與I型IFN的作用相似，但是每種IFN啟動(dòng)不同基因亞集 (Marcello et al.，2006)。因此，病毒保護(hù)作用可以從不同陣列的受到刺激的基因中啟 云力(Rio et al. ,1998 ；Stohr and Esveld,2004 ；Meager et al. ,2005 ；Annibali et al.， 2007)。此外，IFNX和I型IFN的抗病毒保護(hù)作用對(duì)比證實(shí)這兩種類型IFN能抑制EMCV。 然而，作用級(jí)別明顯不同(Meager et al.，2005)。在包括VSV的研究中觀測(cè)到相似發(fā)現(xiàn) (Kotenkoet al.，2003)。這提示INF λ應(yīng)答途徑可能是在某些病毒感染中的特異功能作用 必需的。目前對(duì)于禽病毒予以密切關(guān)注，禽流感的爆發(fā)可以在禽類動(dòng)物和人群中迅速傳播 并導(dǎo)致高發(fā)病率(Stohr and Esveld 2004)。在家禽中處理問題病毒的艱巨任務(wù)組合使用I 型和II型IFN治療可觀測(cè)到相關(guān)的免疫毒性這個(gè)事實(shí)(Kotenko et al.，2003 ；Stohr and Esveld 2004 ；Meager et al.，2005)，迫使進(jìn)一步研究新的及另外的抗病毒策略。因此，需 要改善禽病毒的控制方法，以有益于家禽業(yè)以及幫助降低這些病毒傳播至人的危險(xiǎn)(Chen et al.，2007)。進(jìn)一步地，鑒于家禽業(yè)在全社會(huì)經(jīng)濟(jì)和食品供應(yīng)中的重要性，至關(guān)重要的是 開發(fā)調(diào)節(jié)和改良免疫調(diào)節(jié)作用的新手段。在本發(fā)明的研究工作中，分離并測(cè)序了編碼雞IFN-λ (后文稱作ChIFN-λ)的核 酸分子。包含本發(fā)明的分離的核酸分子的重組遺傳構(gòu)建體已經(jīng)在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中產(chǎn)生和表 達(dá)，從而可以分離和測(cè)序ChIFN-λ。這些發(fā)現(xiàn)提供了其它IFN治療的機(jī)會(huì)。發(fā)明概述在本說明書及權(quán)利要求書中，除非特別指出，則術(shù)語“包含”應(yīng)理解為包含所述的 元件或整數(shù)或者元件或整數(shù)組，但不排除任何其它元件或整數(shù)或者元件或整數(shù)組。在本說明書和權(quán)利要求書中，除非特別指出，則術(shù)語“包含”應(yīng)理解為包含所述的 元件或整數(shù)或者元件或整數(shù)組，但不排除任何其它所述的元件或整數(shù)或者元件或整數(shù)組。如本文所用，術(shù)語“衍生自，，是指所述整數(shù)或整數(shù)組源自所述種類，但是非必需直 接得自所述來源。再者，如本文所用，除非特別指出，則單數(shù)形式“一個(gè)”包括多個(gè)所指事物。除非特別指出，本文所用所有技術(shù)和學(xué)術(shù)用語均具有本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員通 常理解的含義。本說明書含有使用PatentIn Version 3. 1程序制作的氨基酸和核苷酸序列信息， 在后文參考文獻(xiàn)之后列出。每個(gè)氨基酸和核苷酸序列均在序列表中通過數(shù)字指示符<210>
7及隨后的序列標(biāo)識(shí)符(例如<210>1、<210>2等)示出。序列的長度、類型(氨基酸、DNA 等)以及每個(gè)序列的來源生物體分別以數(shù)域指示符<211>、<212>和<213>提供的信息標(biāo) 示。本說明書中提及的氨基酸和核苷酸序列通過指示符SEQ ID NO:及隨后的標(biāo)識(shí)符識(shí)別 (例如SEQ IDNO=U SEQ ID NO :2等)。本說明書中提及的序列標(biāo)識(shí)符與序列表中數(shù)域指 示符<400>提供的信息相關(guān)，其隨后是序列標(biāo)識(shí)符(例如<400>1、<400>2等)。也就是說 本說明書中描述的SEQ ID NO 1與序列表中<400>1標(biāo)示的序列相關(guān)。本說明書中使用的單字母和三字母縮寫在表1中示出。本發(fā)明一方面涉及核酸分子，其編碼禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或者衍生 物或者互補(bǔ)于編碼禽細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽 是III型干擾素。本發(fā)明另一方面提供了核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其編碼禽類細(xì)胞因 子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互補(bǔ)于編碼禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或 者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干擾素，其中所述禽類動(dòng)物是選自雞、鴨、鵝、 火雞、矮腳雞、鵪鶉或者珍珠雞的家禽。另一方面，所述III型干擾素多肽是雞IFN-λ (ChIFNA)多肽或者包含其或者其 功能片段、衍生物或者禽類同系物的融合分子。再一方面，本發(fā)明提供了核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其編碼雞IFN-λ 多肽或者其功能片段或者衍生物或者互補(bǔ)于編碼雞IFN-λ多肽或者其功能片段或者衍生 物的核酸分子。本發(fā)明再一方面涉及選自如下的分離的核酸(i)分離的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽類同系物，其包含這樣的核苷 酸序列，所述核苷酸序列編碼或者互補(bǔ)于編碼基本如SEQ IDNO :2或4所示氨基酸序列的序 列，或者編碼與SEQ ID N0:2或4所示序列在序列長度上具有至少大約50%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的序 列，或者在低嚴(yán)格條件下能與所述核酸分子雜交的核酸序列。(ii)分離的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽類同系物，其包含核苷酸序 列或者互補(bǔ)于所述序列，其中所述核苷酸序列基本如SEQ ID NO :1或3所示，或者是與所 述序列在全長上具有至少大約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%相同性的核苷酸序列，或者是能與SEQ ID NO 1或3所示序列或者其 互補(bǔ)形式在低嚴(yán)格條件下能雜交的核苷酸序列。(iii)分離的核酸分子或者其功能衍生物、片段或者禽類同系物，其包含SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列。本發(fā)明另一方面提供了禽類干擾素III型多肽或者其功能片段或者衍生物。本發(fā)明再一方面涉及如SEQ ID NO :2或4所示或者與SEQ ID NO :2或4所示序列 在序列長度上具有至少大約60%、65%、75%、80%或者更高相同性的分離的蛋白質(zhì)，或者 其功能衍生物、片段或者禽類同系物。本發(fā)明另一方面涉及由SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列或者能在低嚴(yán)格條件下 與SEQ ID NO :1或3雜交的序列編碼的蛋白質(zhì)，且其編碼SEQID NO :2或4所示氨基酸序 列，或者與SEQ ID NO :2或4在序列長度上具有至少大約60%、65%、70%、75%、80%或者
8更高相同性。本發(fā)明另一方面提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)重組禽III型干擾素分子的方法，所述方法 包括在所述細(xì)胞中表達(dá)核酸分子，所述核酸分子編碼所述禽III型干擾素或者互補(bǔ)于編碼 所述禽III型干擾素的核酸分子。本發(fā)明再一方面提供了分離的細(xì)胞，其表達(dá)內(nèi)源或者重組禽III型干擾素或者其 功能片段、衍生物或者同系物。一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)重組禽III型干擾素的方法，所述方法包括 如下步驟(i)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，所述核酸分子編碼所述禽 III型干擾素或者互補(bǔ)于編碼所述禽III型干擾素的核酸分子，置于合適的啟動(dòng)子序列控 制下；(ii)將所述細(xì)胞在足以使得所述核酸分子表達(dá)的時(shí)間和條件下培養(yǎng)；(iii)分離所述表達(dá)產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中產(chǎn)生禽III型干擾素融合分子的方法，所述方 法包括在所述細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，所述核酸分子編碼禽III型干擾素 多肽或者其功能片段、衍生物或者禽類同系物或者互補(bǔ)于編碼禽III型干擾素多肽或者其 功能片段、衍生物或者禽類同系物的核酸分子，其中所述多肽是第一種III型干擾素與第 二種III型干擾素或者第一種III型干擾素與第二種I型或II型干擾素之間的融合多肽， 所述 I 型或 II 型干擾素選自 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β 或者 Ch IFN-γ寸。再一方面，本發(fā)明提供了第一種III型干擾素與第二種III型干擾素或者第一種 III型干擾素與第二種I型或II型干擾素之間的重組融合多肽，所述I型或II型干擾素選 自 IFN- α、IFN- β、IFN- γ、ChIFN- α、ChIFN- β 或者 ChIFN- γ 等。本發(fā)明再一方面提供了包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，所述核酸分子編碼禽III型 干擾素融合多肽或者其功能片段或者衍生物或者互補(bǔ)于編碼禽III型干擾素融合多肽或 者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干擾素與第二種III型干擾 素或者第一種III型干擾素和第二種I型或II型干擾素之間的融合多肽，所述I型或II 型干擾素選自 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β 或者 Ch IFN-γ 等。本發(fā)明另一方面提供了鑒別禽III型干擾素遺傳序列或者其功能片段或者衍生 物的方法。本發(fā)明再一方面提供了檢測(cè)III型干擾素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系 物存在的方法。本發(fā)明另一方面提供了治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的方法，所述方法包括在足以 保持、刺激或者增強(qiáng)所述禽類動(dòng)物免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的禽 III型干擾素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物。本發(fā)明再一方面提供了治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的方法，所述禽類動(dòng)物已經(jīng)暴 露于或者感染病原性生物體，所述方法包括給予所述禽類動(dòng)物有效量的禽III型干擾素多 肽或者其功能片段、衍生物或者同系物。本發(fā)明再一方面涉及禽類干擾素III多肽用于治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病。
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本發(fā)明再一方面涉及禽III型干擾素多肽在生產(chǎn)調(diào)節(jié)禽類動(dòng)物免疫應(yīng)答和/或治 療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面提供了包含禽類細(xì)胞因子分子的佐劑，其中所述細(xì)胞因子是III 型干擾素或者是所述III型干擾素分子與第二種細(xì)胞因子分子及任選藥物可接受的載體、 賦形劑或者稀釋劑的融合分子。本發(fā)明再一方面提供了獸用藥物組合物，其包含免疫調(diào)節(jié)有效量的禽III型干擾 素或者禽III型干擾素與第二種細(xì)胞因子之間的融合分子或者能表達(dá)其的遺傳序列，以及 獸用可接受的一或多種載體和/或稀釋劑。表1 單字母和三個(gè)字母的氨基酸縮寫 附圖簡述

圖1是對(duì)得自用Poly (I:C) (50 μ g/ml)處理2小時(shí)的雞脾細(xì)胞的ChIFN轉(zhuǎn)錄物的 RT-PCR表達(dá)分析圖。ChIFNa、β或者λ通過使用IFN特異性測(cè)序引物擴(kuò)增并在1 %瓊脂 糖凝膠上電泳。水作為陰性對(duì)照。GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)部對(duì)照。圖2是使用ClustalW(BioManager)產(chǎn)生的ChIFN λ和各種脊椎動(dòng)物物種 的IFNXII的推導(dǎo)的氨基酸序列對(duì)比示意圖。將ChIFNX的預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列與 HuIFNA 11(登記號(hào) NM_172138)、mIFNA II(登記號(hào) AY869695)和 fishIFNA (登記號(hào) AB093588)對(duì)比。相同的氨基酸殘基以‘*’標(biāo)示，保守的和半保守的殘基分別以‘’和‘.， 標(biāo)示。短線指出為了優(yōu)化該對(duì)比而導(dǎo)入序列中的缺口(gap)。信號(hào)肽被鑒別并以方框示出，但是fishIFNX未能預(yù)測(cè)信號(hào)肽。圖3是ChIFN λ核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸翻譯的示意圖。對(duì)ChIFN λ的ORF進(jìn) 行序列分析，示出預(yù)測(cè)的氨基酸翻譯。預(yù)測(cè)的信號(hào)肽以下劃線標(biāo)示，內(nèi)含子位置以箭頭標(biāo)
7J\ ο圖4是使用完整編碼序列示出ChIFNX的氨基酸序列、一些其它脊椎動(dòng)物IFNX 以及選擇的其它雞細(xì)胞因子關(guān)系的無根系統(tǒng)發(fā)生樹示意圖。每個(gè)基因的Genebank登記號(hào) 可見于表4。圖5是大腸桿菌表達(dá)的重組雞IFN的SDS-PAGE分析圖。大腸桿菌表達(dá)的重組 ChIFNa , ChIFN^和ChIFNA蛋白在IPTG誘導(dǎo)之后通過Ni-NTA金屬-親和性層析純化。 然后將這些重組蛋白質(zhì)在12% SDS-PAGE上電泳，以及通過考馬斯亮藍(lán)染色分析。包含較寬 范圍的分子量標(biāo)記(Markers)作參考。圖6是雞IFN刺激的亞硝酸鹽產(chǎn)生圖示。將HDll雞巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與ChIFNX 和ChIFNii —起培養(yǎng)24小時(shí)，然后檢測(cè)上清中誘導(dǎo)的亞硝酸鹽產(chǎn)生情況。所示數(shù)值是一式 三份進(jìn)行的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果是2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖7是示出在用IFN處理后CEF細(xì)胞中免于SFV感染的保護(hù)作用圖示。將CEF細(xì) 胞與各種ChIFN —起培養(yǎng)18小時(shí)，然后感染SFV。然后通過用中性紅染色測(cè)量細(xì)胞裂解情 況，以及在感染后24小時(shí)測(cè)量吸光度(OD540)。所示數(shù)值是一式三份進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的平均值。 結(jié)果是2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖8是示出在IFN預(yù)處理之后在HDll雞巨噬細(xì)胞中流感減少示意圖。將HDll細(xì) 胞用ChIFNa、ChIFNi3 XhIFNA或者單獨(dú)培養(yǎng)基處理6小時(shí)，然后用流感病毒(PR8)感染。 通過HA試驗(yàn)在感染后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量病毒效價(jià)。所示數(shù)值是一式四份進(jìn)行的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的 平均值。結(jié)果是2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖9是示出Poly (I:C)誘導(dǎo)IFN mRNA表達(dá)的示意圖。將雞脾單核細(xì)胞與30 μ g/ ml Poly(I:C)培養(yǎng)2和4小時(shí)。隨后，收獲細(xì)胞，使用qRT-PCR測(cè)量ChIFN α、ChIFN β和 ChIFN λ mRNA水平。數(shù)據(jù)表示各種IFN相對(duì)于未刺激對(duì)照物的表達(dá)。GAPDH用作管家基因 以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。數(shù)值是平均值士SE。一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖10是示出IFN誘導(dǎo)TLR3 mRNA表達(dá)的示意圖。將雞脾單核細(xì)胞與不同濃度的 ChIFNa、ChIFNP和ChIFNA 一起培養(yǎng)3小時(shí)，然后使用qRT-PCR測(cè)量TLR3水平。GAPDH 用作管家基因以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。相對(duì)于未受刺激的對(duì)照物示出表達(dá)。數(shù)值是平均值士SE。一 式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖11是示出在H5N1(禽流感病毒)感染期間IFNX被誘導(dǎo)的示意圖。在 H5N1 (V/1203)感染后，在雞肺、脾和腦中通過qRT-PCR測(cè)量細(xì)胞因子IFNλ。數(shù)據(jù)示出與未 感染對(duì)照禽類動(dòng)物相比成倍改變。數(shù)據(jù)代表平均值(η = 7) 士 SE。圖12是示出IFNX在感染前和感染后起保護(hù)作用免于流感感染示意圖。將HDll 細(xì)胞用三個(gè)濃度的chIFN-α、β和λ預(yù)處理(B)或者后處理(A)，然后用流感病毒(PR8) 攻擊。條柱示出在第24、40、48、60和72小時(shí)通過HA測(cè)量的病毒相對(duì)水平。在24小時(shí)和 40小時(shí)無病毒可被檢測(cè)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得多個(gè)樣品。圖13是示出IFNX抗體對(duì)于IFNX活性的抑制作用示意圖。通過HA效價(jià)確定 抗-chIFN-λ抗體與流感疫苗病毒在卵內(nèi)共接種增加流感病毒效價(jià)。數(shù)據(jù)代表直至7個(gè)
11實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由一個(gè)星號(hào)(*)表示ρ < 0.05，兩個(gè)星號(hào)(**)表示ρ < 0. 005，三個(gè)星號(hào)(***)表示 p = 0. 0001。圖14是示出在免疫后IFNX提高抗體應(yīng)答示意圖。用0. 2ml包裝的綿羊紅細(xì)胞 (SRBC)在存在或者不存在細(xì)胞因子的條件下經(jīng)腹部內(nèi)注射接種無特定病原體的雞(SPF) (η = 7)。在免疫后第15天用單獨(dú)的SRBC對(duì)該禽類動(dòng)物再次免疫。每周取所有該禽類動(dòng) 物的血樣，測(cè)量HA效價(jià)。通過完全凝血確定的血清抗體效價(jià)以每組的平均值表示。圖15是示出RchIFN-λ抑制脾細(xì)胞中Con A誘導(dǎo)的增殖示意圖。將脾細(xì)胞與系 列稀釋的大腸桿菌表達(dá)的rchIFN- α、β和λ以及次最佳Con Α(5μ g/mL) 一起培養(yǎng)48小 時(shí)。然后加入胸苷H3T，將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)量放射性以確定細(xì)胞增殖，以一式四份樣 品的平均值士SE表示。單獨(dú)用ConA處理的細(xì)胞以一式四份平均值表示。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于相應(yīng)于新的禽III型干擾素基因、特別是雞IFN- λ基因的核酸分 子的分離和測(cè)序。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了用于免疫調(diào)節(jié)的新的蛋白質(zhì)和核酸分子。在用病毒攻擊 的細(xì)胞中，當(dāng)將該細(xì)胞在存在雞IFN-λ基因表達(dá)產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)時(shí)觀測(cè)到病毒誘導(dǎo)的 細(xì)胞裂解的保護(hù)作用。因此，這個(gè)新的禽類細(xì)胞因子基因的鑒別特別促進(jìn)用于治療、預(yù)防和 診斷/監(jiān)測(cè)與暴露于或者感染病原性生物體的禽類動(dòng)物疾病的產(chǎn)品和方法的開發(fā)。因此，本發(fā)明一方面涉及核酸分子，其編碼禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或 者衍生物或者互補(bǔ)于編碼禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中 所述多肽是III型干擾素。術(shù)語“禽類”應(yīng)理解為包含通常稱作鳥類動(dòng)物的脊椎動(dòng)物綱的成員。應(yīng)理解如 本文所用，術(shù)語“禽類”包括兩種性別和所有發(fā)育階段的家禽(poultry)、家禽(domestic bird)和獵禽(game bird)，選自雞、火雞(turkey)、矮腳雞(bantam)、鵪鶉(quail)、珍珠雞 (guinea fowl)、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋(emu)、鴿子、金絲雀(canary)、虎皮鸚鵡(budgerigar)、 鸚鵡(parrot)及雀(finch)等。本文所用術(shù)語“細(xì)胞因子多肽”應(yīng)理解為是指這樣的多肽分子，其包含生物學(xué)活性 蛋白質(zhì)的至少一個(gè)亞基，具有III型干擾素的一或多種特征性生物學(xué)特征，特別是具有調(diào) 節(jié)禽免疫細(xì)胞功能性的能力，所述禽免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞(B或T細(xì)胞)、粒細(xì)胞(嗜酸性粒 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或者中性粒細(xì)胞)或者其它非特異性免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、單核細(xì) 胞、NK細(xì)胞等)。不將本發(fā)明限于任一理論或者作用模式，已經(jīng)確定III性干擾素呈現(xiàn)出與I型干 擾素類似的生物學(xué)性質(zhì)。因此，提及III型干擾素的生物學(xué)活性時(shí)應(yīng)理解為包括但不限于 抗病毒和免疫刺激活性，如病毒誘導(dǎo)的表達(dá)導(dǎo)致通過Janus激酶(Jak) -STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 產(chǎn)生信號(hào)及IFN刺激的調(diào)節(jié)基因表達(dá)(ISRE)的激活，主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I型抗 原表達(dá)的正調(diào)節(jié)，以及針對(duì)病毒感染誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明另一方面提供了這樣的核酸分子或者其功能片段或者衍生物，其編 碼禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物或者互補(bǔ)于編碼禽類細(xì)胞因子多肽或者 其功能片段或者衍生物的核酸分子，其中所述多肽是III型干擾素，且其中所述禽類動(dòng)物 是雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀寸。
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最優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子衍生自雞。不將本發(fā)明限于任一理論或者作用模式以及如前文所述，IFN基于分子結(jié)構(gòu)、受體 類型及其誘導(dǎo)的功能途徑而被分為三個(gè)家族。這三個(gè)家族是IFN-I、IFN-II和IFN-III。III 型IFN包含IFNA ,IFNA在哺乳動(dòng)物中具有三個(gè)亞型，即IFNA 1 (IL29)、IFN λ 2 (IL28A)和 IFNX3(IL28B)。雖然在雞中INF-λ僅包含一個(gè)成員，但是應(yīng)理解提及禽IFN-λ時(shí)包含所 有形式的這些分子以及其功能片段、衍生物和禽類同系物，包括可以從IFN-XmRNA可變剪 接中產(chǎn)生的異構(gòu)體形式、多聚體形式、等位基因形式以及以二聚體、多聚體和融合蛋白存在 的形式。不將本發(fā)明限于任一理論或者作用模式，IFN-λ基因優(yōu)選包含在染色體7上的 5個(gè)外顯子區(qū)域，其編碼分子量為21kDa的具有186個(gè)氨基酸的多肽，其在核苷酸水平與 HuIFNX II僅具有36%相同性。如前文所述，IFN-λ基因的表達(dá)產(chǎn)物優(yōu)選呈現(xiàn)出抗病毒和 免疫刺激活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述III型干擾素多肽是雞IFN-λ (ChIFNA)多肽或 者包含所述多肽或者其功能片段、衍生物或者禽類同系物的融合分子。根據(jù)這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了這樣的核酸分子或者其功能片段或者衍 生物，其編碼雞IFN-λ多肽或者其功能片段、禽類同系物或者衍生物或者互補(bǔ)于編碼雞 IFN-λ多肽或者其功能片段、禽類同系物或者衍生物的核酸分子。本發(fā)明再一方面涉及分離的核酸，所述核酸選自(i)包含這樣的核苷酸序列的分離的核酸分子或者其功能片段、衍生物或者禽類 同系物，所述核苷酸序列編碼或者互補(bǔ)于編碼基本如SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列或 者與SEQ ID NO :2或4在序列長度上具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的序 列，或者能在低嚴(yán)格條件下雨所述核酸分子雜交的核酸序列。(ii)包含核苷酸序列或者與所述序列互補(bǔ)的分離的核酸分子，其中所述核苷酸 序列是基本如SEQ ID NO :1或3所示序列，或者是與所述序列在序列長度上具有至少大 約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更高相同性的核苷酸序列，或者是能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1或 3或者其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列。(iii)分離的核酸分子或者其功能衍生物、片段或者禽類同系物，其包含SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列或者所述分子的功能片段。本發(fā)明應(yīng)理解為提供了上述cDNA核苷酸序列的基因組DNA形式。為此，SEQ ID NO :1相應(yīng)于ChIFNX cDNA，包括編碼信號(hào)肽的序列。SEQ IDNO 3相應(yīng)于編碼成熟蛋白質(zhì)即 沒有信號(hào)序列的蛋白質(zhì)的ChIFNXcDNA開放讀框的序列，。SEQ ID NO :2相應(yīng)于包括信號(hào) 序列的ChIFNX蛋白；而SEQID NO :4相應(yīng)于不包括信號(hào)序列的ChIFNλ蛋白。本文提及的ChIFN λ的基因組和cDNA形式應(yīng)理解為是其最廣泛含義，且包括(i)經(jīng)典的基因組基因，由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或未翻譯序 列(即內(nèi)含子、5'-和3'-未翻譯序列)組成；(ii)相應(yīng)于編碼區(qū)(即外顯子)的mRNA或者cDNA，任選包含該基因的5'-或者 3'-未翻譯序列；和/或
(iii)相應(yīng)于有或無與該蛋白質(zhì)前體形式相關(guān)的序列如信號(hào)序列的編碼區(qū)的 mRNA或cDNA，以及任選5，-或者3，-未翻譯序列。如前文所述，ChIFNA相應(yīng)于先前未鑒別的禽類干擾素分子。應(yīng)理解本發(fā)明還提 供了前述核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明另一方面涉及禽類細(xì)胞因子多肽或者其功能片段或者衍生物，其中 所述多肽是III型干擾素。優(yōu)選地，所述禽類干擾素III型多肽是禽IFN-λ多肽或者其功能片段或者衍生 物。 更優(yōu)選地，所述IFN- λ多肽是ChIFN- λ。本發(fā)明另一方面涉及分離的蛋白質(zhì)，其如SEQ ID NO :2或4所示或者與SEQ ID NO 2或4所示序列在全長上具有至少大約60 %、65 %、75 %、80 %或更高相同性，或者其功 能衍生物、片段或者禽類同系物。術(shù)語“蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為包含肽、多肽和蛋白質(zhì)。也應(yīng)理解這些術(shù)語在本文可互換 使用。蛋白質(zhì)可以是糖基化或者非糖基化蛋白質(zhì)，和/或可以含有與蛋白質(zhì)如氨基酸、脂 質(zhì)、碳水化合物或者其它肽、多肽或者蛋白質(zhì)融合、連接、結(jié)合或者另外關(guān)聯(lián)的許多其它分 子。在后文提及“蛋白質(zhì)”時(shí)包括包含氨基酸序列的蛋白質(zhì)以及與其它分子如氨基酸、脂質(zhì)、 碳水化合物或者其它肽、多肽或者蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述60%或者更高的相似性是指65%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者 99%相似性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選是分離形式?！胺蛛x的”是指經(jīng)歷至少一個(gè)純化步驟且適宜地 通過例如組合物而定義的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)組合物相對(duì)于其它成分包含至少大約10%所 述蛋白質(zhì)、優(yōu)選至少大約20%、更優(yōu)選至少大約30%、更優(yōu)選至少大約40-50%、甚至更優(yōu) 選至少大約60-70%、以及更優(yōu)選80-90%或更高的所述蛋白質(zhì)，這通過分子量、氨基酸序 列或者其它常規(guī)方式確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以被認(rèn)為是生 物學(xué)純的。如本文所用，關(guān)于權(quán)利要求的蛋白質(zhì)和核酸分子，術(shù)語“分離的”是指所述材料已 經(jīng)從其原始環(huán)境(例如如果其是天然發(fā)生的則從其天然環(huán)境)中分離出。例如，存在于活的 動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或者蛋白質(zhì)不是分離的，但是從天然系統(tǒng)中一些或者所有共 存材料中分離的相同多核苷酸或蛋白質(zhì)則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分， 和/或這種多核苷酸或者蛋白質(zhì)可以是組合物的一部分，且在這種載體或者組合物不是其 天然環(huán)境的一部分時(shí)仍是分離的。如本文所用，分離的材料或者組合物也可以是“純化”的 組合物，即其不需要絕對(duì)純度，而是相對(duì)定義。得自文庫的各個(gè)核酸可以被常規(guī)純化為電泳 同質(zhì)性。在另一方面，本發(fā)明提供了這樣的核酸，其已經(jīng)從基因組DNA中或者從文庫的其它 序列或者其它環(huán)境中純化至少1、2、3、4、5或者更高數(shù)量級(jí)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以分離自天然來源、是合成的或者是重組產(chǎn)生的多肽。肽和 蛋白質(zhì)可以在體外或者體內(nèi)重組表達(dá)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過使用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn) 生和分離。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法整體或者部分合成。見例 如 Caruthers et al. (1980)Nucleic AcidsRes. Symp. Ser. 215-223 ；Horn et al. (1980) Nucleic Acids Res.Symp. Ser. 225—232 ；Banga, Α. K. , Therapeutic Peptides andProteins,Formulation,Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster, PA所述。例如，可以使用各種固相技術(shù)(見例如Roberge et al. (1995) Science269 202 ；Merrifield(1997)Methods Enzymo 1. 289 :3_13)進(jìn)行月太合成，自動(dòng)合成 可以例如通過使用ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)根據(jù)廠商指導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以是作為與其連接的一或多個(gè)其它結(jié)構(gòu)域的融合蛋白而合 成和表達(dá)，以例如更易于分離重組合成的肽、鑒別和分離抗體和表達(dá)抗體的B細(xì)胞等。便于 檢測(cè)和純化的結(jié)構(gòu)域包括例如金屬螯合肽如多組氨酸序列段和組氨酸_色氨酸模塊，使得 可以在固定化金屬上純化；蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域，使得可以在固定化免疫球蛋白上純化；以及在 FLAGS延伸/親和性純化系統(tǒng)(Immunex Corp，Seattle WA)中使用的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu) 域與包含基序的蛋白質(zhì)之間包含可裂解接頭序列如因子Xa或者腸激酶(Invitrogen，San Diego CA)以便于純化。例如，表達(dá)載體可包含與六組氨酸殘基連接的編碼表位的核酸序 列，隨后是硫氧還蛋白和腸激酶裂解位點(diǎn)(見例如Williams et al. (1995)Biochemistry 34 1787-1797 ；Dobeli et al. (1998)Protein Expr. Purif. 12 :404_14)。所述組氨酸殘基 便于檢測(cè)和純化，而腸激酶裂解位點(diǎn)提供了從剩余融合蛋白中純化區(qū)域的手段和方法。與 編碼融合蛋白的載體及融合蛋白的應(yīng)用相關(guān)的技術(shù)在一些學(xué)術(shù)和專利文獻(xiàn)中充分描述，見 例如 Kroll et al. (1993)DNA Cell. Biol.，12 :441_53 所述。盡管本發(fā)明涵蓋重組蛋白質(zhì)，但是在合成所述蛋白質(zhì)中也包含化學(xué)合成技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，化學(xué)合成的多肽是基于分離自禽類動(dòng)物的分子適宜地合成的。禽類 動(dòng)物分子的分離可以通過任何合適方法實(shí)現(xiàn)，例如通過層析分析，如使用CM-纖維素離子 交換層析及隨后S印hadex (例如G-50柱)過濾。許多其它技術(shù)也是合適的，包括HPLC、PAGE 等技術(shù)。優(yōu)選本發(fā)明的化學(xué)合成的多肽是基于分離自雞的分子適宜地合成。所述多肽可以使用如Carpino et al. (1991)所述F-moc化學(xué)方法通過固相合成 方法合成。多肽及其片段也可以通過另外的化學(xué)方法合成，包括但不限于如Stewart et al. (1985)所述t-Boc化學(xué)方法，或者通過傳統(tǒng)的液相肽合成方法合成。本發(fā)明再一方面涉及由SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列或者互補(bǔ)于能在低嚴(yán)格 條件下與SEQ ID NO :1或3雜交的序列的序列編碼的蛋白質(zhì)，其編碼SEQ ID NO :2或4所 示氨基酸序列或者與SEQ ID NO :2或4在序列長度上具有至少大約60%、65%、70%、75%、 80%或者更高相同性。本發(fā)明明確包含衍生自禽類動(dòng)物而不是僅僅是雞的相關(guān)或同源的III型干擾素 基因或蛋白質(zhì)，所述禽類動(dòng)物例如但不限于任何家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或 者獵禽，選自火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡 和雀等。本發(fā)明進(jìn)一步提供了衍生自胚胎組織或者培養(yǎng)的細(xì)胞的所述禽III型干擾素基 因。在本文提及“III型干擾素”時(shí)應(yīng)理解為是指前文所述核酸和蛋白質(zhì)分子。如本文所用，短語“核酸”或者“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸；或者 任何這些的片段；基因組或合成來源的DNA或RNA (例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是單鏈 或雙鏈DNA或RNA且可以代表有義鏈或反義鏈；肽核酸(PNA)；或者任何DNA樣或者RNA樣 材料，天然或合成來源的，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNP)。該術(shù)語涵蓋了含有已
15知天然核苷酸類似物的核酸，即寡核苷酸。該術(shù)語還涵蓋了具有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)，見 例如 Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144 189-197 ;Strauss-Soukup et al. (1997) Biochemistry 36 :8692_8698 ；Samstaget al. (1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 :153-156。最后，應(yīng)理解本發(fā)明提供了反義核酸分子，其針對(duì)本文定義的禽類細(xì)胞因子核酸 分子。“表達(dá)產(chǎn)物”包括RNA分子如mRNA轉(zhuǎn)錄物以及蛋白質(zhì)。一些基因是非蛋白質(zhì)編碼 基因且產(chǎn)生mRNA或者其它RNA分子，且參與調(diào)節(jié)RNA:DNA、RNA:RNA或者RNA:蛋白質(zhì)相互 作用。所述RNA (例如mRNA)可以直接起作用，或者通過引導(dǎo)其它分子如RNAi或者通過剪 接產(chǎn)物(例如外顯子或內(nèi)含子)起作用。本發(fā)明也涵蓋短的干擾RNA(si-RNA)。其它基因 編碼mRNA轉(zhuǎn)錄物，其隨后被翻譯為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)包括多肽。因此，不同表達(dá)的核酸分子 可僅編碼mRNA，或者另外編碼蛋白質(zhì)。mRNA和蛋白質(zhì)均是“表達(dá)產(chǎn)物”。本發(fā)明另一方面提供了在細(xì)胞中產(chǎn)生重組禽III型干擾素分子的方法，所述方法 包括在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼所述禽III型干擾素的核酸分子或者互補(bǔ)于編碼所述禽III型 干擾素的核酸分子的核酸分子。本發(fā)明的核酸優(yōu)選是分離形式或者與載體如表達(dá)載體的連接形式?！胺蛛x的”是指 核酸分子經(jīng)歷至少一個(gè)純化步驟，且其例如通過組合物而被適宜地定義，所述組合物相對(duì) 于其它成分包含至少大約10%所述核酸分子，優(yōu)選至少大約20%、更優(yōu)選至少大約30%、 更優(yōu)選至少大約40-50%、以及更優(yōu)選至少大約60-70%、甚至更優(yōu)選80-90%或更多的所 述核酸分子，這通過分子量、氨基酸序列或者其它合適方式確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，本發(fā)明的核酸分子也被認(rèn)為是生物學(xué)純的。本發(fā)明的核酸可以通過例如克隆和表達(dá)cDNA文庫、通過PCR擴(kuò)增信使或基因組 DNA等方式產(chǎn)生、分離和/或操縱。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，同源基因可以通過如本文所述 操縱模板核酸而進(jìn)行修飾。本發(fā)明可以與本領(lǐng)域已知的任何方法或方案或裝置聯(lián)合實(shí)施， 這些在學(xué)術(shù)和專利文獻(xiàn)中充分描述。用于實(shí)施本發(fā)明的核酸，無論是RNA、iRNA、反義核酸、cDNA、基因組DNA、載體、病 毒或者其雜交體，均可以通過遺傳工程、擴(kuò)增和/或表達(dá)/重組產(chǎn)生等方式分離自多個(gè)來 源。從這些核酸中產(chǎn)生的重組多肽可以單獨(dú)分離或者克隆，并檢測(cè)其預(yù)期活性。任何重組 表達(dá)系統(tǒng)均可使用，包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲或者植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?；蛘?，這些核酸可以在體外通過熟知的化學(xué)合成技術(shù)合成，例如Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105 661 ；Belousov et al. (1997)supra ；Frenkel et al. (1995)supra ； Blommers et al. (1994) supra ；Narang et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 90 ；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68 109 ；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22 1859 ；美國專利 No. 4，458，066 所述。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明序列的寡核苷酸，所述序列如本發(fā)明舉例的序列的亞序 列。寡核苷酸可包括例如單鏈多脫氧核苷酸或者兩個(gè)互補(bǔ)多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學(xué) 合成的。操縱核酸的技術(shù)如亞克隆、標(biāo)記探針(例如使用Klenow聚合酶進(jìn)行隨機(jī)-引 物標(biāo)記，切口平移(nick translation)、擴(kuò)增)、測(cè)序、雜交等技術(shù)在學(xué)術(shù)和專利文獻(xiàn)中
16充分描述，見例如 Sambrook, ed.，Molecular Cloning :aLaboratory Manual (2nd ed.)， Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，ed. John Wiley&Sons, Inc.，New York(1997) ；Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology :Hybridization With Nucleic Acid Probes， Part I.Theory and NucleicAcid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993)。核酸、載體、殼體、多肽等可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何眾多一般方法分 析和量化。這些方法包括例如分析生物化學(xué)方法如NMR、分光光度測(cè)定法、X射線成像、電 泳、毛細(xì)管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)以及超擴(kuò)散層析，各種免疫學(xué)方法 如液體或凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射性免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、免疫熒光測(cè)定、Southern分析、Northern分析、斑點(diǎn)印跡分析、凝膠電泳(例如 SDS-PAGE)，核酸或者靶或者信號(hào)擴(kuò)增方法，放射標(biāo)記，閃爍計(jì)數(shù)以及親和性層析。獲得和操縱用于實(shí)施本發(fā)明方法的核酸可以通過從基因組樣品中克隆而進(jìn)行，且 如果需要?jiǎng)t篩選和再克隆從例如基因組克隆或者cDNA克隆中分離或者擴(kuò)增的插入體。本 發(fā)明方法中使用的核酸的來源包括基因組或者cDNA文庫，其包含于例如哺乳動(dòng)物人工染 色體(MAC)中，見例如美國專利No. 5，721，118,6, 025，155 ；酵母人工染色體(YAC)；細(xì)菌人 工染色體(BAC) ；Pl 人工染色體，見例如 Woon et al. (1998) Genomics 50 :306_316 所述； Pl-衍生的載體(PAC)，見例如Kern (1997)Biotechniques 23 :120_124 ；粘粒、重組病毒、噬 菌體或者質(zhì)粒。本發(fā)明的核酸可以與啟動(dòng)子可操縱地連接。啟動(dòng)子可以是一個(gè)基序或者核酸控 制序列的一個(gè)陣列，其指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)鄰近的必需的核酸序 列，如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情況中包含TATAT元件。啟動(dòng)子也任選包含遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子或者 阻抑物元件，其可以位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相隔數(shù)千個(gè)堿基對(duì)?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù) 環(huán)境和發(fā)育條件下是活性的啟動(dòng)子。“可誘導(dǎo)”啟動(dòng)子是在環(huán)境或者發(fā)育調(diào)節(jié)下的啟動(dòng)子。 “組織特異性”啟動(dòng)子在生物體的某些組織類型中是活性的，但是在同一生物體的其它組織 類型中是無活性的。術(shù)語“可操縱地連接”是指核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子，或者轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合位點(diǎn)的陣列)與第二個(gè)核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列指導(dǎo)相 應(yīng)于第二個(gè)序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸例如編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列的表達(dá)載體和克隆 載體。本發(fā)明的表達(dá)載體和克隆載體可包含病毒顆粒、桿狀病毒、噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘 粒、fosmid、細(xì)菌人工染色體、病毒DNA(例如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、狂犬病病毒以及 SV40衍生物)、基于Pl的人工染色體、酵母質(zhì)粒、酵母人工染色體，以及特異于感興趣宿主 (如桿狀細(xì)菌、曲霉菌和酵母)的任何其它載體。本發(fā)明的載體可包含染色體、非染色體以 及合成的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量合適的載體，這些載體是可商購的。如果需要，可以使用常規(guī)的分子生物學(xué)方法將本發(fā)明的核酸克隆進(jìn)任何載體中； 在體外克隆擴(kuò)增的核酸的方法在例如美國專利No. 5，426，039中描述。為了便于克隆擴(kuò)增 的序列，可以將限制酶位點(diǎn)“構(gòu)建進(jìn)(built into)”PCR引物對(duì)。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽和肽的表達(dá)載體文庫?？梢詫⑦@些核酸導(dǎo)入基因 組或者細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核中，并且通過在學(xué)術(shù)和專利文獻(xiàn)中充分描述的多種常規(guī)技術(shù)表 達(dá)。見例如 Roberts et al. (1987)Nature 328 731 ；Schneider (1995)Protein Expr.
17Purif. 6435 10 ；Sambrook，Ti jssen或者Ausubel所述。所述載體可以分離自天然來源，得 自如ATCC或者GenBank文庫這種來源，或者通過合成或者重組方法制備。例如，本發(fā)明的 核酸可以在在細(xì)胞(例如附加型表達(dá)系統(tǒng))中穩(wěn)定或者瞬時(shí)表達(dá)的表達(dá)盒、載體或者病毒 中表達(dá)。可以在表達(dá)盒和載體中摻入選擇標(biāo)記，以賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞和序列選擇表型。例如，選 擇標(biāo)記可編碼附加型維持和復(fù)制，由此不需要整合進(jìn)宿主基因組中。一方面，本發(fā)明的核酸在體內(nèi)給予以在原位表達(dá)本發(fā)明的肽或者多肽。所述核酸 可以作為“裸DNA”給予(見例如美國專利No. 5，580，859)，或者以表達(dá)載體形式例如重組 病毒性形式給予。所述核酸可以通過任何途徑給予，包括腫瘤周圍或者腫瘤內(nèi)給予，如下文 描述。在體內(nèi)給予的載體可以衍生自病毒基因組，包括重組修飾的有包膜或無包膜DNA和 RNA病毒，優(yōu)選選自桿狀病毒、細(xì)小病毒、picornoviridiae、皰疹病毒、痘病毒、腺病毒或者 小RNA病毒科。也可以使用嵌合載體，其采用每個(gè)親代載體的有利性質(zhì)(見例如Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870)。這種病毒基因組可以通過重組DNA技術(shù) 修飾以包含本發(fā)明的核酸；以及可以進(jìn)一步工程化為復(fù)制缺陷、條件復(fù)制或者具有復(fù)制能 力。另一方面，載體衍生自腺病毒(例如衍生自人腺病毒基因組的無復(fù)制能力的載體，見 例如美國專利No. 6，096，718,6, 110，458,6, 113，913,5, 631，236)；腺伴隨病毒和逆轉(zhuǎn)錄病 毒基因組。逆轉(zhuǎn)錄病毒可包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免 疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及這些病毒的組合的那些病毒；見例如美國專 禾Ij No. 6, 117, 681,6, 107, 478,5, 658, 775,5, 449, 614 ；Buchscher and Panganiban(1992) J. Virol. 66 2731-2739 Johann etal. (1992) J. Virol. 66 1635-1640)?；谙侔殡S病 毒(AAV)的載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)具有靶核酸的細(xì)胞，例如在體外產(chǎn)生核酸和肽以及在體內(nèi)和 離體基因治療方法中；見例如美國專利No. 6，110，456、5，474，935 ;0kada et al. (1996) GeneTher. 3 :957_964 所述。如本文所用，術(shù)語“表達(dá)盒”是指這樣的核苷酸序列，其能影響結(jié)構(gòu)基因(即蛋白 質(zhì)如本發(fā)明的多肽的編碼序列)在與這種序列相容的宿主中表達(dá)。表達(dá)盒包含與多肽編碼 序列以及任選其它序列例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可操縱地連接的至少一個(gè)啟動(dòng)子。也可以使用實(shí) 現(xiàn)表達(dá)必需或者有益的其它因子，例如增強(qiáng)子。如本文所用，“可操縱地連接”是指DNA序列 上游連接啟動(dòng)子，由此該啟動(dòng)子介導(dǎo)所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄。因此，表達(dá)盒也包含質(zhì)粒、表達(dá) 載體、重組病毒、任何形式重組“裸DNA”載體等?！拜d體”包含核酸，其可感染、轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)或者持久轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。應(yīng)意識(shí)到載體可以是 裸核酸或者與蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)復(fù)合的核酸。所述載體任選包含病毒或細(xì)菌核酸和/或蛋白 質(zhì)和/或膜(例如細(xì)胞膜、病毒脂質(zhì)包膜等)。載體包括但不限于復(fù)制子(例如RNA復(fù)制 子、噬菌體)，DNA片段可以與其附著且變得可以復(fù)制。載體因此包括但不限于RNA、自主復(fù) 制環(huán)狀或線性DNA或RNA (例如質(zhì)粒、病毒等，見例如美國專利No. 5，217，879)，且包括表達(dá) 和非表達(dá)質(zhì)粒。在重組微生物或者細(xì)胞培養(yǎng)物作為“表達(dá)載體”宿主時(shí)，其包括已經(jīng)摻入宿 主染色體中的染色體外環(huán)狀和線性DNA和RNA。在載體由宿主細(xì)胞維持時(shí)，所述載體可以在 有絲分裂期間作為自主結(jié)構(gòu)由細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制，或者被摻入宿主基因組中。為了在特定組織或者在指定條件下優(yōu)化表達(dá)，所述核酸核酸分子可以可操縱地置 于啟動(dòng)子序列控制下，如前文所述。為此目的的合適的細(xì)胞和病毒顆粒也在前文論述。產(chǎn) 生高水平表達(dá)的細(xì)胞或病毒顆粒的啟動(dòng)子序列和培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
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本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸序列如編碼本發(fā)明多肽的序列或者包含本發(fā)明 載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何宿主細(xì)胞，包括原核 細(xì)胞，真核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或者植物細(xì)胞。 舉例的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌、傷寒沙門氏菌，以及假單胞菌、鏈霉菌和 葡萄球菌屬的各個(gè)菌種。舉例的昆蟲細(xì)胞包括果蠅S2和Spodoptera Sf9。舉例的動(dòng)物細(xì) 胞包括CHO、COS或者Bowes黑素瘤，或者任何小鼠或者人細(xì)胞系。合適宿主的選擇在不利 于技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。載體可以通過使用任何各種技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒感 染、基因槍，或者Ti介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。特殊的方法包括磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染、脂染或者電穿孔。工程化的宿主細(xì)胞可以在針對(duì)激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或者擴(kuò)增本發(fā)明基因而適 當(dāng)修改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化合適的宿主以及宿主生長至合適細(xì)胞密度之后， 通過合適方式誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子(例如溫度轉(zhuǎn)變或者化學(xué)誘導(dǎo))，以及可以將細(xì)胞另外培 養(yǎng)一段時(shí)間以使其產(chǎn)生希望的多肽或者其片段。細(xì)胞可以通過離心收獲、通過物理或化學(xué)方法破壞，以及保留所得粗提物以進(jìn)一 步純化。用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可以通過任何常規(guī)方法破壞，包括冷凍-解凍循環(huán)、 超聲處理、機(jī)械破壞或者使用細(xì)胞裂解劑。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知?？梢詮闹亟M 細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化表達(dá)的多肽或者片段，通過包括如下的方法進(jìn)行硫酸銨或者乙 醇沉淀、酸提取、陰離子或者陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和 性層析、羥磷灰石層析以及血凝素層析。如果需要，可以在完成多肽構(gòu)型中使用蛋白質(zhì)重折 疊步驟。如果需要，可以應(yīng)用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行最終純化步驟。因此，本發(fā)明另一方面提供了分離的細(xì)胞，其表達(dá)內(nèi)源或重組禽III型干擾素或 者其功能片段、衍生物或者同系物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明這個(gè)方面的禽III型干擾素分子是禽IFN-λ，特 別是 ChIFN-λ?；蛘?，分離的細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞，其通過如先前所述那些遺傳構(gòu)建體表 達(dá)III型干擾素分子。在細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳構(gòu)建體的方法已經(jīng)在本文定義，且為本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知。分離表達(dá)內(nèi)源或者重組禽III型干擾素的細(xì)胞的方法已經(jīng)在本文論述，且為本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知。如本文所用，術(shù)語“相似性”和“相同性”包括在核苷酸或氨基酸水平對(duì)比的序列 之間的精確相同性。在核苷酸水平無相同性的情況中，“相似性”及包括“相同性”在序列之 間不同，其編碼在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平彼此相關(guān)的不同氨基酸。在一特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，在相同性而不是在相似性水平進(jìn)行核苷酸序列對(duì)比。用于描述兩或多個(gè)多核苷酸之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“比較窗”、 “序列相似性”、“序列相同性”、“序列相似性百分比”、“序列相同性百分比”、“基本上相似 (substantially similar) ” 和“基本上相同性(substantialidentity) ”?！皡⒖夹蛄?，，長 度為至少12個(gè)、但通常為15-18以及通常至少25或更多個(gè)如30個(gè)單體單位。由于兩個(gè) 多核苷酸可各自包含(1)兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即僅完整多核苷酸序列的一部
19分)，及(2)兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，所以兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間序列對(duì)比典 型通過“比較窗”對(duì)比兩個(gè)多核苷酸序列以鑒別和對(duì)比序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗” 是指與參考序列對(duì)比的典型12個(gè)連續(xù)殘基的節(jié)段。比較窗與參考序列(其不包含添加或 缺失)相比可包含大約20%或更少的添加或缺失(即缺口)，以優(yōu)化兩個(gè)序列的對(duì)比?？?以通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，以及TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0,GeneticsComputer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)進(jìn) 行比較窗對(duì)比的序列優(yōu)化對(duì)比，或者通過任何選擇的方法產(chǎn)生目測(cè)和最佳序列對(duì)比(即達(dá) 到與比較窗最高同源百分比)?？梢蕴峒暗氖抢鏏ltschul et al. (Nuc 1. Acids Res. 25 3389,1997)揭示的BLAST程序。關(guān)于序列分析的詳細(xì)論述可以見于Unitl9. 3 of Ausubel et al. ( “Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley&Sons Inc, Chapter 15，1994-1998)?？梢允褂迷S多其它算法對(duì)比核苷酸和氨基酸序列，例如但不限于PILEUP、 CLUSTALW、SEQUENCHER 或者 VectorNTI。如本文所用，術(shù)語“序列相似性”和“序列相同性”是指序列在比較窗上以逐個(gè)核苷 酸為基礎(chǔ)的相同或者功能或結(jié)構(gòu)相似達(dá)到程度。因此，例如計(jì)算“相同性百分比”是通過比 較窗對(duì)比兩個(gè)最佳對(duì)比的序列，確定在這個(gè)兩個(gè)序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基(例如A，T，C， G，I)的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗中位置總數(shù)(即窗口大小)， 將結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列相同性百分比。對(duì)于本發(fā)明，“序列相同性”應(yīng)理解為通過DNASIS 計(jì)算機(jī)禾呈序(Version 2. 5 for windows ；available from Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco, California, USA)計(jì)算的平均“匹配百分比”，使用軟件 參考手冊(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值。相似的評(píng)述適用于序列相似性。如上所述以及更特別地，蛋白質(zhì)和/或核酸序列相同性(同源性)可以通過使用 本領(lǐng)域已知的任何序列對(duì)比算法和程序計(jì)算。序列相同性(同源性)的程度可以通過使 用任何計(jì)算機(jī)程序和相關(guān)參數(shù)確定，包括本文所述那些程序和參數(shù)，如BLAST 2.2.2.或者 FASTA version 3. 0t78，使用程序默認(rèn)參數(shù)。例如，所述序列對(duì)比算法是BLAST算法。一方 面，對(duì)于核酸序列相同性分析，BLAST核苷酸參數(shù)包括word size = 11, expect = 10, filter lowcomplexity with DUST, cost to open gap = 5, cost to extend gap = 2, penalty formismatch = -3, reward for match = 1, Dropoff (X) for BLAST extensions in bits =20，final X dropoff value for gapped alignment = 50，所有其它選項(xiàng)均為默認(rèn)值。 一方面，對(duì)于多肽序列相同性分析，序列對(duì)比算法是BLAST算法，例如其中BLAST核苷酸參 數(shù)包括 word size = 3, expect = 10, filter lowcomplexity with SEG, cost to open gap = 11，cost to extend gap = 1, similaritymatrix Blosum62,Dropoff (X) for blast extensions in bits = 7,X dropoff valuefor gapped alignment (in bits) = 15, final X dropoff value for gapped alignment = 25。舉例的算法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP, FASTA, TFASTA和 CLUSTALW(Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad. Sci. USA85(8) =2444-2448,1988 ； Altschul et al.，J. Mol.Biol. 215(3) :403_410，1990 ；Thompson et al.，Nucleic Acids Res.22(2) 4673-4680,1994 ；Higgins et al. , Methods Enzymol. 266 383-402,1996 ； Altschul et al. ,Nature Genetics3 :266_272，1993)。同源性或者相同性可以通過使用序 列分析軟件測(cè)量(例如 Sequence Analysis Software Package of the Genetics ComputerGroup, University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue, Madison,WI 53705)。這種軟件通過各種缺失、取代和其它修飾賦予同源性程度數(shù)值而比較 相似序列。BLAST, BLAST 2. 0和BLAST 2. 2. 2算法也用于本發(fā)明。這些程序在例如Altschul et al. (1990)，supra中描述。進(jìn)行分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。這個(gè)算法包括首先通過鑒別在查詢 序列中的短字長W而鑒別高得分序列對(duì)(HSP)，其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列同樣長度的字對(duì)比時(shí)匹 配或滿足正值閾值得分Τ。T是指相鄰字得分閾值(Altschul et al. (1990) supra)。這些 最初的相鄰字hits作為種子起始檢索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。所述字hits沿每個(gè) 序列兩個(gè)方向延伸直至累積對(duì)比得分可以增加。對(duì)于核苷酸序列，累積得分用參數(shù)M(對(duì) 于一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)分；總是>0)計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣計(jì)算累積得分。 當(dāng)累積對(duì)比得分從其最大實(shí)現(xiàn)值降低X數(shù)量時(shí)；當(dāng)由于一或多個(gè)負(fù)分殘基對(duì)比積累導(dǎo)致累 積得分為0或以下時(shí)；或者到達(dá)每個(gè)序列末端時(shí)，字hits在每個(gè)方向的延伸終止。BLAST 算法參數(shù)W、T和X確定了對(duì)比的靈敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如 下默認(rèn)參數(shù)字長(W)為11，預(yù)期(E)為10，M = 5，N = _4及比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序 列，BLASTP程序使用如下默認(rèn)參數(shù)字長為3，預(yù)期(E)為10，BL0SUM62得分矩陣(參見 Henikoff&Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)對(duì)比(B)為 50，預(yù)期(E) 為10，M = 5，N = -4，及比較兩條鏈。BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析(參見例如，Karlin&Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873)。BLAST 算法 提供的相似性的一個(gè)測(cè)量是最小和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶 然發(fā)生匹配的概率指示。例如，如果在測(cè)試核酸與參考核酸比較中的最小和概率小于大約 0. 2、更優(yōu)選小于大約0. 01、最優(yōu)選小于大約0. 001，則核酸被認(rèn)為與參考序列相似。在一個(gè) 方面，蛋白質(zhì)和核酸序列同源性用Basic Local Alignment Search Tool (“BLAST”)評(píng)估。 例如，可以使用5個(gè)特殊BLAST程序以進(jìn)行下述任務(wù)(I)BLASTP和BLAST3針對(duì)蛋白質(zhì)序 列數(shù)據(jù)庫比較氨基酸查詢序列；(2) BLASTN針對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較核苷酸查詢序列； (3)BLASTX針對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比較查詢核苷酸序列(兩條鏈)的六框概念(six-frame conceptual)翻譯產(chǎn)物；(4) TBLASTN針對(duì)在所有6個(gè)讀框中翻譯的核苷酸數(shù)據(jù)庫(兩條鏈) 比較查詢蛋白質(zhì)序列；及(5)TBLASTX針對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的six-frame翻譯比較核苷酸 查詢序列的six-frame翻譯。BLAST程序通過鑒別查詢氨基酸或核酸序列和優(yōu)選得自蛋白 質(zhì)或核酸序列數(shù)據(jù)庫的測(cè)試序列之間的相似節(jié)段(它們?cè)诒疚姆Q作“高得分節(jié)段對(duì)”)而鑒 別同源序列。高得分節(jié)段對(duì)優(yōu)選通過得分矩陣鑒別(即對(duì)比)，它們中的許多是本領(lǐng)域已 知的。優(yōu)選地,所用得分矩陣是 BL0SUM62 矩陣(Gonnet et al.，Science256 =1443-1445, 1992 ；Henikoff and Henikoff, Proteins 17 :49_61，1993).較不優(yōu)選地，也可以使用 PAM 或 PAM250 矩陣(參見例如，Schwartz and Dayhoff, eds. , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships :Atlas of ProteinSequence and Structure, Washington National Biomedical ResearchFoundation)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，為確定是否核酸具有在本發(fā)明范圍內(nèi)的所需序列相同性， 使用 NCBI BLAST 2. 2. 2 程序，默認(rèn)選項(xiàng) blast (default options toblast)。在 BLAST 2. 2. 2程序中有大約38個(gè)設(shè)定選項(xiàng)。在本發(fā)明的這個(gè)舉例方面，除了默認(rèn)filtering設(shè)定(i即所有參數(shù)設(shè)為默認(rèn)，除了 filtering被設(shè)為OFF)使用所有默認(rèn)值；在其位置使用“-F F”設(shè)定，其使得不能filtering。默認(rèn)filtering的使用經(jīng)常導(dǎo)致由于短序列長度所致的 Karlin-Altschulviolations ο用于本發(fā)明這個(gè)舉例方面的默認(rèn)值包括"Filter for low complexity :0NWord Size 3Matrix :Blosum62Gap Costs :Existence :11Extension :1”其它默認(rèn)設(shè)定為:filter for low complexity OFF, word size of 3 for protein,BL0SUM62 matrix,gap existence penalty of-11 and a gap extension penalty of-1。術(shù)語“同源性”和“相同性”在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列上下文中，是指當(dāng)針對(duì) 比較窗或指定區(qū)域進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性比較或?qū)Ρ葧r(shí)，如用任何序列比較算法測(cè)量或者手工對(duì) 比或者肉眼觀察，兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列是相同的或者具有規(guī)定百分比的相同的氨基酸 殘基或核苷酸。為序列比較，一個(gè)序列可以作為參考序列，測(cè)試序列針對(duì)其進(jìn)行比較。當(dāng)用 序列比較算法時(shí)，測(cè)試和參考序列被輸入計(jì)算機(jī)，如果需要指定亞序列坐標(biāo)，以及指定序列 算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定替代參數(shù)。序列比較算法然后基于 程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列相同性百分比?！氨容^窗”，如本文所用，包括任何數(shù)目連續(xù)殘基的節(jié)段。例如，在本發(fā)明的其它方 面，范圍為20到全長本發(fā)明的舉例多肽或核酸序列的連續(xù)殘基與同樣數(shù)目的連續(xù)位置的 參考序列在兩個(gè)序列最佳對(duì)比后相比較。如果參考序列具有所需的與本發(fā)明的舉例多肽或 核酸序列的序列相同性，則該序列在本發(fā)明范圍內(nèi)。短語“基本上相同，，在兩個(gè)核酸或多肽的上下文，可以指當(dāng)最大對(duì)應(yīng)性比較或?qū)Ρ?時(shí)，如用如下詳細(xì)討論的一種任何已知序列比較算法測(cè)量或者肉眼觀察，兩個(gè)或多個(gè)序列 具有例如至少大約至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高序 列相同性或者更高核苷酸或氨基酸殘基(序列)相同性。在其它方面，本發(fā)明提供了具有 與本發(fā)明的舉例序列的基本相同性的核酸和多肽序列。本發(fā)明的核酸序列可以在多肽編碼 區(qū)的整個(gè)長度上基本上相同?？梢杂蒙鲜龀绦驒z測(cè)的基序包括編碼亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、糖基化 位點(diǎn)、遍在位點(diǎn)、α螺旋和β折疊的序列，編碼指導(dǎo)被編碼蛋白質(zhì)的分泌的信號(hào)肽的序列， 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的序列如同源框，酸性序列段，酶活性位點(diǎn)，底物結(jié)合位點(diǎn)，及酶裂解位點(diǎn)。為in Silico確定和鑒別序列相同性、結(jié)構(gòu)同源性、基序等，本發(fā)明的序列可以被 存儲(chǔ)、記錄和操作在可由計(jì)算機(jī)讀和接近的任何介質(zhì)上。因此，本發(fā)明提供了計(jì)算機(jī)、計(jì)算 機(jī)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)、計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品等，其上記錄或存儲(chǔ)本發(fā)明的核酸和多肽序列。 如本文所用，術(shù)語“記錄”和“存儲(chǔ)”是指用于在計(jì)算機(jī)介質(zhì)上存儲(chǔ)信息的過程。本領(lǐng)域技 術(shù)人員能容易地采用任何已知方法用于在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄信息以產(chǎn)生包含本發(fā)明 一或多種核酸和/或多肽序列的產(chǎn)品。本發(fā)明另一方面是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其上記錄至少一種本發(fā)明的核酸和/或多肽
22序列。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括磁可讀介質(zhì)、光學(xué)可讀介質(zhì)、電子可讀介質(zhì)和磁/光學(xué)介質(zhì)。 例如，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以是硬盤、軟盤、磁帶、CD-ROM，Digital Versatile Disk(DVD), Random Access Memory (RAM)或Read Only Memory (ROM)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它 類型的其它介質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“計(jì)算機(jī)”、“計(jì)算機(jī)程序”和“處理器”以其最廣泛的一般含義使 用，包括所有這種裝置。本發(fā)明提供了分離的或者重組的核酸，其在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明舉例的序列雜 交。另一方面，所述嚴(yán)格條件是高嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或者低嚴(yán)格條件，這些條件如本 領(lǐng)域已知以及本文所述。這些方法可用于分離本發(fā)明的核酸。另一方面，根據(jù)其在嚴(yán)格條件下雜交的能力定義的本發(fā)明的核酸可以是本發(fā)明核 酸的大約5個(gè)殘基至全長核酸；例如其長度可以是至少5，10，15，20，25，30，35，40，50，55， 60，65，70，75，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800
或者更多個(gè)殘基，或者是全長基因或編碼序列，例如cDNA。本發(fā)明也包括短于全長的核酸。 這些核酸可以用作例如雜交探針、標(biāo)記探針、PCR寡核苷酸探針、iRNA、反義核酸或者編碼抗 體結(jié)合肽(表位)的序列、基序、活性位點(diǎn)等。“雜交”是指核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程。雜交反應(yīng)可以是靈敏性及 選擇性的，由此甚至在感興趣的特定序列以低濃度存在于樣品中時(shí)也可以被鑒別。嚴(yán)格條 件可以通過例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或者甲酰胺的濃度定義，或者通過雜交溫度定義， 這些條件為本領(lǐng)域熟知。例如，提高嚴(yán)格性可以通過降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度，或者提 高雜交溫度、改變雜交時(shí)間等方式實(shí)現(xiàn)，如下文詳細(xì)描述。另一方面，本發(fā)明的核酸通過其 在各種嚴(yán)格條件(例如高、中、低)下的雜交能力而定義。本文提及的低嚴(yán)格條件包括對(duì)于雜交條件而言至少大約0-15% ν/ν甲酰胺和至 少大約1Μ-2Μ鹽，以及對(duì)于洗滌條件而言至少大約1Μ-2Μ鹽。通常地，低嚴(yán)格條件溫度是大 約25-30°C至大約42°C。可以改變溫度，較高的溫度用于代替甲酰胺和/或產(chǎn)生另外的嚴(yán)格 條件。在需要時(shí)，可以使用另外的嚴(yán)格條件，如中等嚴(yán)格條件，其包括對(duì)于雜交條件而言至 少大約16% ν/ν-30% ν/ν甲酰胺和至少大約0. 5Μ-0. 9Μ鹽，以及對(duì)于洗滌條件而言至少大 約0. 5Μ-0. 9Μ鹽；或者使用高嚴(yán)格條件，其包括對(duì)于雜交條件而言至少大約31% ν/ν-50% ν/ν甲酰胺和至少大約0. 01Μ-0. 15Μ鹽，以及對(duì)于洗滌條件而言至少大約0. 01Μ-0. 15Μ鹽。 通常地，洗滌在Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) %進(jìn)行(Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5 :109，1962)。 然而，雙鏈DNA的Tm降低1V，則錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目增加1 % (Bonner and Laskey, Eur. J.Biochem. 46 83,1974) 0甲酰胺在這些雜交條件中是任選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)格水平 如下低嚴(yán)格條件是6 X SSC緩沖液，0. 1% w/v SDS，25-42°C;中等嚴(yán)格條件是2 X SSC緩沖 液，0. 1% w/v SDS，溫度為 20°C -65°C ；高嚴(yán)格條件是 0. IX SSC 緩沖液，0. 1% w/v SDSJj^ 度為至少65°C。在本發(fā)明的核酸通過其在高嚴(yán)格條件下雜交的能力定義的情況中，這些條件包括 大約50%甲酰胺，溫度為大約37°C -42°C。一方面，通過其在降低的嚴(yán)格條件下雜交的能 力定義的本發(fā)明的核酸，所述條件包括大約35% -25%甲酰胺，溫度為大約30°C -35°C?；?者，本發(fā)明的核酸通過其在高嚴(yán)格條件下雜交的能力定義，所述條件包括在42°C在50%甲 酰胺、5XSSPE、0. 3% SDS以及重復(fù)序列封閉核酸如cot_l或者鮭精DNA(例如200n/ml剪
23切和變性的鮭精DNA)中。一方面，本發(fā)明的核酸通過其在降低的嚴(yán)格條件下雜交的能力定 義，所述條件包括35 %甲酰胺，溫度降低為35 °C。在雜交之后，可以在50°C將濾膜用6X SSC、0.5% SDS洗滌。高于25%甲酰胺的這 些條件被認(rèn)為是“中等嚴(yán)格條件”，低于25%甲酰胺的這些條件被認(rèn)為是“低嚴(yán)格條件”。一 個(gè)具體的“中等”雜交條件實(shí)例是在30%甲酰胺條件下進(jìn)行上述雜交的條件。一個(gè)具體的 “低”雜交條件實(shí)例是在10%甲酰胺條件下進(jìn)行上述雜交的條件。相應(yīng)于特定水平嚴(yán)格條件的溫度范圍可以通過計(jì)算感興趣的核酸的嘌呤與嘧啶 的比率以及據(jù)此調(diào)節(jié)溫度而進(jìn)一步縮小。本發(fā)明的核酸也通過其在如Ausubel和Sambrook 所述的高、中等和低嚴(yán)格條件下雜交的能力定義。本領(lǐng)域熟知上述范圍和條件的變化。雜 交條件在下文進(jìn)一步論述。可以修改上述程序以鑒別與探針序列的同源性水平降低的核酸。例如，為了獲得 與檢測(cè)探針同源性降低的核酸，可以使用較低的嚴(yán)格條件。例如，在Na+濃度為大約IM的 雜交緩沖液中，雜交溫度可以5°C的增量從68°C降低至42°C。在雜交之后，可以將濾膜用 2XSSC,0.5% SDS在雜交溫度洗滌。高于50°C的這些條件被認(rèn)為是“中等”嚴(yán)格條件，低于 50°C的這些條件被認(rèn)為是“低”嚴(yán)格條件。一個(gè)具體的“中等嚴(yán)格”雜交條件實(shí)例是在大約 55°C進(jìn)行上述雜交。一個(gè)具體的“低嚴(yán)格”雜交條件實(shí)例是在大約45°C進(jìn)行上述雜交?；蛘?，雜交可以在含有甲酰胺的緩沖液如6XSSC中在42°C進(jìn)行。在這種情況中， 雜交緩沖液中的甲酰胺濃度可以5%的增量從50 %降低至O%，以鑒別與探針同源性水平 降低的克隆。在雜交之后，可以將濾膜用6X SSC、0. 5% SDS在50°C洗滌。高于25%甲酰 胺的這些條件被認(rèn)為是“中等”嚴(yán)格條件，低于25 %甲酰胺的這些條件被認(rèn)為是“低，，嚴(yán)格 條件。一個(gè)具體的“中等嚴(yán)格”雜交條件實(shí)例是在30%甲酰胺進(jìn)行上述雜交。一個(gè)具體的 “低嚴(yán)格”雜交條件實(shí)例是在10%甲酰胺進(jìn)行上述雜交。然而，雜交形式的選擇不是關(guān)鍵的-關(guān)鍵的是洗滌條件的嚴(yán)格性，其確定核酸是 否在本發(fā)明范圍內(nèi)。用于鑒別本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的洗滌條件包括例如鹽濃度為大約 0.02摩爾，pH 7，溫度為至少大約50°C或者大約55°C至大約60°C;或者鹽濃度為大約0. 15M NaCl，在72°C進(jìn)行大約15分鐘；或者鹽濃度為大約0. 2X SSC，溫度為至少大約50°C或者大 約55°C至大約60°C，進(jìn)行大約15-20分鐘；或者將雜交復(fù)合物用含有0. 1% SDS的鹽濃度 為大約2 X SSC的溶液在室溫洗滌兩次，每次15分鐘，然后用含有0.IX SSC在 68°C洗滌兩次，每次15分鐘；或者使用等價(jià)條件。見Sambrook，Tijssen和Ausubel關(guān)于 SSC緩沖液和等價(jià)條件的描述。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)重組禽III型干擾素的方 法，所述方法包括如下步驟(i)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入包含置于合適啟動(dòng)子序列的控制下的核酸分子的遺傳構(gòu)建 體，所述核酸分子編碼所述禽III型干擾素或者互補(bǔ)于編碼所述禽III型干擾素的核酸分 子；(ii)在足以使所述核酸分子表達(dá)的時(shí)間和條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及(iii)分離所述表達(dá)產(chǎn)物。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)禽III型干擾素融合分 子的方法，所述方法包括在所述細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，所述核酸分子編碼禽III型干擾素多肽或者其功能片段、衍生物或者禽類同系物或者互補(bǔ)于編碼的核酸分 子，其中所述多肽是第一個(gè)III型干擾素與第二個(gè)III型干擾素之間或者第一個(gè)III型干 擾素與第二個(gè)I型或II型干擾素之間的融合多肽，所述I型或II型干擾素選自IFN-α、 IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β 或者 Ch IFN-γ 等。因此，在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了第一個(gè)III型干擾素與第二個(gè) III干擾素或者第一個(gè)III型干擾素與第二個(gè)I型或II型干擾素之間的重組融合多肽，所 述 I 型或 II 型干擾素選自 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ChiFN-α ,ChIFN-β 或者 ChIFN-γ 等。根據(jù)本發(fā)明這方面所述的前述實(shí)施方案，所述重組禽III型干擾素優(yōu)選是禽 IFN-λ多肽分子或者包含其的融合分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述III型干擾素是 ChIFN-λ 多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了遺傳構(gòu)建體，所述遺傳構(gòu)建體包含如前述核 酸分子或者編碼禽III型干擾素融合多肽或者其功能片段或者衍生物或互補(bǔ)于編碼禽III 型干擾素融合多肽或者其功能片段或者衍生物的核酸分子的核酸分子，其中所述多肽是 III型干擾素與第二個(gè)III型干擾素或者第一個(gè)III型干擾素與第二個(gè)I型或II型干擾 素之間的融合多肽，所述I型或II型干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN- γ , Ch IFN-α、Ch IFN-β 或者 Ch IFN-y 等。優(yōu)選地，所述III型干擾素是IFN-λ，特別是ChIFN-λ。為了產(chǎn)生融合多肽，將編碼包含禽III型干擾素多肽或者其功能片段或者衍生物 的第一個(gè)編碼區(qū)的核酸分子克隆在第二個(gè)編碼區(qū)鄰近，任選由間隔核酸分隔，由此第一個(gè) 編碼區(qū)與第二個(gè)編碼區(qū)在相同的開放讀框中，在這兩個(gè)編碼區(qū)之間沒有介于其中的終止密 碼子。當(dāng)翻譯時(shí)，由此產(chǎn)生的多肽包含第一個(gè)和第二個(gè)編碼區(qū)的多肽產(chǎn)物之間的融合體。編 碼融合多肽的遺傳構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一個(gè)起始密碼子和一個(gè)終止密碼子，其能由在其 中進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞翻譯機(jī)構(gòu)識(shí)別。產(chǎn)生融合多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本發(fā)明另一方面涉及所述蛋白質(zhì)和核酸分子的抗體。這種抗體可以是單克隆抗體 或者多克隆抗體，且可以選自天然發(fā)生的抗體或者可以是特定產(chǎn)生的抗體。在后者的情況 中，首先需要將ChIFNX多肽或者核酸抗原與載體分子結(jié)合以實(shí)現(xiàn)免疫原性。本發(fā)明的抗 體可用作治療劑或者診斷劑。分子的抗體包括特異于所述分子的抗體。這些抗體可用于分離、鑒別或者量化本發(fā)明的多肽或者相關(guān)多肽。術(shù)語“抗體”包括肽或多肽，衍生自能特異性結(jié)合抗原或者表位的免疫球蛋白基 因或者其片段，以其為原型或者基本由其編碼，見例如Fundamental Immunology, Third Edition, W. Ε. Paul, ed. ， Raven Press, N. Y. (1993) ；Wilson et al. (1994) J. Immunol. Methods 175 267-273 ；Yarmush et al. (1992)J.Biochem. Biophys. Methods 25(4) 285-97所述。術(shù)語抗體包括保留結(jié)合抗原能力的抗原結(jié)合部分，即“抗原結(jié)合位點(diǎn)”(例如 片段、亞序列、互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的 單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段； (iii)Fd片段，由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成； (v)dAb 片段(Ward et al.，(1989)Nature341 :544_546)，其由 VH結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分 離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。單鏈抗體也包含在術(shù)語“抗體”中。本發(fā)明分子的抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，且可以選自天然發(fā)生的抗
25體或者可以是針對(duì)這些多肽和基因產(chǎn)物特定產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明提供了重組和合成的抗體 以及抗體雜交體。在本文“合成抗體”被認(rèn)為包括抗體片段和雜交體。本發(fā)明這個(gè)方面的抗 體可特別用于免疫治療，也可以用作診斷工具或者作為純化指定多肽或核酸分子的手段。免疫、產(chǎn)生和分離抗體(多克隆抗體和單克隆抗體)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知,且在一些學(xué)術(shù)和專利文獻(xiàn)中描述,見例如Coligan，CURRENTPR0T0C0LS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991) ；Stites (eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(7th ed.)Lange MedicalPublications, Los Altos, CA( "Stites") ；Goding, M0N0CL0NALANTIBODIES PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press, NewYork, NY(1986) ；Kohler(1975) Nature 256 495 ；Harlow(1988)ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York。除了使用動(dòng)物在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的傳統(tǒng)方法之外，抗體也可以在 體外產(chǎn)生，例如使用表達(dá)噬菌體文庫的重組抗體結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生。見例如Hoogenboom(1997) Trends Biotechnol. 15 :62_70 ；Katz (1997)Annu.Rev.Biophys. Biomol. Struct. 26 27-45。針對(duì)本發(fā)明多肽產(chǎn)生的多克隆抗體可以通過將所述多肽直接注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)或 者通過給予非人動(dòng)物所述多肽而獲得。然后如此獲得的抗體結(jié)合所述多肽。以此方式，即 使僅編碼所述多肽片段的序列也可用于結(jié)合完整天然多肽的產(chǎn)生抗體。這種抗體可用于從 表達(dá)多肽的細(xì)胞中分離所述多肽。對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的任何技術(shù)。所 述技術(shù)例如包括雜交瘤技術(shù)、三瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及EBV-雜交瘤 技術(shù)(見例如 Cole (1985) in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96)。可以采用產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(見例如美國專利No. 4，946，778)產(chǎn)生本發(fā)明多肽 的單鏈抗體?；蛘?，可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)這些多肽或者其片段的人源化抗體。如本文所用，術(shù)語“衍生物”包括核酸分子的部分(portions)、片段或者部分 (parts)或者其翻譯產(chǎn)物。衍生物也可以是單一或多重核苷酸或者氨基酸取代、缺失和/或 添加。本發(fā)明的核酸分子的衍生物也包括在至少低嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO :1或3所示 核苷酸序列雜交的核酸分子。本發(fā)明核酸分子的衍生物還包括寡核苷酸、PCR引物、反義分 子、適用于共抑制的分子以及融合核酸分子。也涵蓋的一些分子是能調(diào)節(jié)ChIFN-λ基因表 達(dá)的分子。本文所述多肽分子的衍生物包括片段、部分(parts)、部分(portions)、突變體、 變體，以及源于天然、合成或者重組來源，包括融合蛋白。所述衍生物包括具有與肽、多肽或 者其它蛋白質(zhì)樣或者非蛋白質(zhì)樣分子融合的完整蛋白質(zhì)的特定表位或者部分的片段。部分 或片段包括例如ChIFN-λ多肽的活性區(qū)域。衍生物可以衍生自氨基酸插入、缺失或者取 代。便利地，這些衍生物通過首先在編碼核酸產(chǎn)生一或多個(gè)核苷酸取代、缺失和/或添加而 制備?；蛘?，一旦已知氨基酸序列，則氨基酸可以通過確定的技術(shù)化學(xué)添加在需要提供希望 的突變體的任何序列中。所有這種衍生物均包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的禽III型干擾素的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及 一或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入。插入氨基酸序列變體是其中在蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入一或 多個(gè)氨基酸殘基的那些變體，但是隨機(jī)插入也可以適當(dāng)篩選所得產(chǎn)物。缺失變體特征在于
26從序列中除去一或多個(gè)氨基酸。取代氨基酸變體是其中已經(jīng)除去至少一個(gè)殘基，其在這個(gè) 位置插入一個(gè)不同的殘基。典型的取代是根據(jù)表2進(jìn)行的那些取代。
0186]表2:合適的氨基5脧取代殘基0187]原始?xì)埢e例的取代0188]AlaSer0189]ArgLys0190]AsnGln ；His0191]AspGlu0192]CysSer0193]GlnAsn ；Glu0194]GluAsp0195]GlyPro0196]HisAsn ；Gln0197]IleLeu ；Val0198]LeuIle ；Val0199]LysArg ；Gln ；Glu0200]MetLeu ；Ile ；Val0201]PheMet ；Leu ；Tyr0202]SerThr0203]ThrSer0204]TrpTyr0205]TyrTrp ；Phe0206]ValIle ；Leu ；Met0207]在禽III型干擾素衍生物是由于氨基酸取代而產(chǎn)生的情況中，所述氨基酸通常由
具有相似性質(zhì)如疏水性、親水性、電負(fù)性、大側(cè)鏈等性質(zhì)的其它氨基酸置換。氨基酸取代典 型為單一殘基取代。氨基酸插入通常是大約1-10個(gè)氨基酸殘基，缺失通常是大約1-20個(gè) 殘基。優(yōu)選地，缺失或插入是成對(duì)產(chǎn)生，即缺失兩個(gè)殘基及相應(yīng)插入兩個(gè)殘基。取代氨基酸變體是已經(jīng)除去序列中至少一個(gè)殘基且在這個(gè)位置插入一個(gè)不同殘 基。舉例的取代氨基酸變體是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代典型包括在如下一組殘基 內(nèi)取代甘氨酸與丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸與亮氨酸；天冬氨酸與谷氨酸；天冬酰胺與谷 氨酰胺；絲氨酸與蘇氨酸；賴氨酸與精氨酸；以及苯丙氨酸與酪氨酸。在氨基酸序列中添加 包括與其它肽、多肽或者蛋白質(zhì)融合。本發(fā)明禽III型干擾素多肽的重組或者合成的突變體和衍生物的其它實(shí)例包括 單一或多重取代、缺失和/或添加與所述多肽相關(guān)的任何分子如碳水化合物、脂質(zhì)和/或蛋 白質(zhì)或多肽。為了方便及速記起見，在本文提及禽III型干擾素如IFN-λ、ChIFN-λ或者禽類 干擾素樣多肽時(shí)包括其如上述任何衍生物。所述“片段”包括得自天然、合成或者重組來源的部分(parts)和部分 (portions)，包括融合蛋白。部分或者片段包括例如ChIFNλ的活性區(qū)域。
如本文所用，核苷酸序列的“禽類同系物”應(yīng)是指這樣的分離的核酸分子，其與本 發(fā)明的核酸分子或者其互補(bǔ)核苷酸序列基本相同，但是在所述序列內(nèi)出現(xiàn)一或多個(gè)核苷酸 取代、插入、缺失或者重排。同系物還應(yīng)理解為是指分離自或者另外相應(yīng)于在除了雞之外 的禽類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的分子的核酸或者蛋白質(zhì)分子?！巴滴铩笔侵冈诹硪辉松镏械男?列(核苷酸或者蛋白質(zhì))，其與參考序列具有至少大約60%及優(yōu)選65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者 99%相同性。所述“功能片段、衍生物或者禽類同系物”應(yīng)理解為是指如前文定義能進(jìn)行禽 IFN-λ的一或多種活性的分子。更特別地，所述功能片段、衍生物或者禽類同系物應(yīng)是指 在禽類動(dòng)物中能誘導(dǎo)或者調(diào)節(jié)針對(duì)抗原或者傳染原的免疫應(yīng)答的多肽、蛋白質(zhì)或者其它物 質(zhì)，所述傳染原例如但不限于傳染性支氣管炎病毒、禽傳染性喉支氣管炎病毒，傳染性支氣 管炎病毒、新城疫病毒、Marek' s病病毒、雞貧血病病毒、禽流感病毒、大腸桿菌、沙門氏 菌、艾美耳球蟲或者支原體等。本發(fā)明另一方面提供了鑒別禽III型干擾素遺傳序列或者其功能片段或者衍生 物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將核酸樣品與雜交有效量的III型干擾素探針 接觸，然后檢測(cè)所述雜交情況。所述核酸樣品可包含例如基因組DNA、mRNA或者cDNA。感興趣的遺傳序列可以是重組形式，在病毒顆粒、噬菌體顆粒、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì) 胞或者植物細(xì)胞中。優(yōu)選地，所述遺傳序列源自禽類動(dòng)物。更優(yōu)選地，所述遺傳序列源自 禽類動(dòng)物，所述禽類動(dòng)物選自雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲 雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡和雀等。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述遺傳序列源自雞。優(yōu)選地，所述禽III型干擾素探針包含至少10、20、30、40或者50個(gè)核苷酸的核苷 酸序列，但是本發(fā)明也包括使用更大的探針，所述探針衍生自或者針對(duì)SEQ ID N0:1或3所 示核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列或者功能片段或者衍生物。優(yōu)選地，將這個(gè)序列用能產(chǎn)生可 鑒別信號(hào)的報(bào)道分子(例如放射性同位素如P或者S，或者生物素?；姆肿?標(biāo)記。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了鑒別禽III型干擾素遺傳序列或者其功能片段或 者衍生物的方法，所述方法包括將衍生自禽III型細(xì)胞因子基因的核苷酸序列的長度為至 少12個(gè)核苷酸的兩個(gè)非互補(bǔ)核酸“引物分子”與核酸模板分子序列接觸，所述模板分子包 含與引物分子序列相關(guān)的核苷酸序列，隨后在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增模板分子的特定核酸分子拷 貝。在一個(gè)實(shí)施例中，第一個(gè)引物分子優(yōu)選針對(duì)禽IFN-λ基因如ChIFN-λ基因以及 特別是SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列或者其同系物或者衍生物的有義鏈，第二個(gè)引物 優(yōu)選針對(duì)禽IFN-λ基因如ChIFN-λ基因以及特別是SEQ ID NO 1或者3所示核苷酸序列 的互補(bǔ)序列或者其同系物或者衍生物的反義鏈。因此，這兩個(gè)引物雜交所述模板分子，由此 在存在DNA聚合酶、輔因子和適當(dāng)?shù)孜锏臈l件下，以5'至3'方向從每個(gè)引物分子朝向DNA 上另一引物分子雜交的位置發(fā)生DNA合成，從而擴(kuò)增插入的DNA。核酸引物分子可進(jìn)一步包含能摻入多核苷酸分子中的任何核苷酸腺嘌呤、胞嘧 啶、鳥嘌呤、胸苷或者肌苷的組合，或者其功能類似物或者衍生物，條件是其在至少低嚴(yán)格 條件下能雜交SEQ ID NO :1或3所示核酸分子。
核酸引物分子可進(jìn)一步是包含于包含其它核酸引物分子的水溶液中。更優(yōu)選地， 所述核酸引物分子是基本純的形式。所述核酸模板分子可以是重組形式，在病毒顆粒、噬菌體顆粒、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì) 胞或者植物細(xì)胞中。優(yōu)選地，所述相關(guān)的遺傳序列源自禽類動(dòng)物細(xì)胞、組織或者器官。更優(yōu) 選地，所述相關(guān)遺傳序列源自雞細(xì)胞、組織或者器官。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，基因的表達(dá)或者靶基因在體外表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過 測(cè)量所述基因表達(dá)產(chǎn)物水平的變化而確定。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)禽III型干擾素多肽或者其功能片 段、衍生物或者同系物的存在的方法。本領(lǐng)域熟知的各種方法可用于直接或者間接確定多肽水平。這種方法包括免疫化 學(xué)方法，如Western印跡、ELISA、免疫沉淀和RIA ；凝膠電泳方法，包括一維和二維凝膠電 泳；基于蛋白質(zhì)或肽層析分離的方法；使用蛋白質(zhì)_融合報(bào)道構(gòu)建體和比色讀數(shù)的方法；基 于鑒定活性翻譯的多聚核糖體mRNA的方法，以及質(zhì)譜分析法。在實(shí)施本發(fā)明的篩選方法中，可以將檢測(cè)化合物與本發(fā)明的多肽在體外接觸，或 者在體內(nèi)給予本發(fā)明的細(xì)胞或者禽類動(dòng)物。不將本發(fā)明限于任一理論或者作用模式，所述 檢測(cè)化合物包括免疫反應(yīng)性分子，如前文描述的抗體。免疫測(cè)定可用于檢測(cè)禽類動(dòng)物中細(xì)胞因子的存在，特別是檢測(cè)其中所述禽類細(xì)胞 因子水平例如在感染病原體之后改變的情況中的免疫應(yīng)答。由此這種免疫測(cè)定特別用于確 定禽類動(dòng)物是否已經(jīng)暴露于病原體或者目前感染病原體或者具有延長的低級(jí)病原性感染。 免疫測(cè)定也可用于量化細(xì)胞因子，特別是用于篩選對(duì)于病原體具有改良的疾病抗性的高表 達(dá)細(xì)胞因子的遺傳原種。本發(fā)明提供了免疫反應(yīng)性分子的所有這種應(yīng)用，以及需要進(jìn)行所 述免疫測(cè)定的診斷測(cè)試。眾多的免疫測(cè)定技術(shù)可以是例如在美國專利No. 4，016，043,4, 424，279和 4，018，653中所述那些技術(shù)。這些方法可以用于檢測(cè)III型干擾素。例如，將針對(duì)ChIFN-λ 產(chǎn)生的抗體固定在固體支持物上，形成第一個(gè)復(fù)合物，將得自待檢測(cè)細(xì)胞因子存在的動(dòng)物 的生物學(xué)樣品與結(jié)合的分子接觸。在使得足以形成抗體-細(xì)胞因子二級(jí)復(fù)合物的適當(dāng)保溫 時(shí)間之后，然后加入用能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記的第二個(gè)ChIFN-λ抗體，以及保 溫足以形成抗體_細(xì)胞因子_標(biāo)記的抗體三級(jí)復(fù)合物的時(shí)間。洗去任何未反應(yīng)的材料，通 過觀測(cè)報(bào)道分子信號(hào)確定所述三級(jí)復(fù)合物的存在。所述結(jié)果可以通過簡單觀測(cè)可見信號(hào)而 定性，或者通過與含有已知量半抗原的對(duì)照樣品對(duì)比而定量。對(duì)這個(gè)測(cè)試進(jìn)行的改變包括 同時(shí)測(cè)試，其中將樣品和標(biāo)記的抗體同時(shí)加入結(jié)合的抗體中；或者反向測(cè)試，其中首先組合 標(biāo)記的抗體與待檢測(cè)的樣品，保溫，然后同時(shí)加入結(jié)合的抗體中。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知，顯然可以存在微小變化。以上使用的抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。所述固體基質(zhì)典型是玻璃或者聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼 龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。所述固體支持物可以是試管、珠、盤或者微滴定平板， 或者是適于進(jìn)行免疫測(cè)定的任何其它表面。所述結(jié)合方法為本領(lǐng)域熟知，通常包括所述分 子與不溶載體的交聯(lián)共價(jià)結(jié)合或者物理吸附。如本文所用，“報(bào)道分子”是指這樣的分子，通過其化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生可以檢測(cè)抗原結(jié) 合的抗體的可檢測(cè)分析的信號(hào)。檢測(cè)可以是定性或者定量檢測(cè)。這種類型測(cè)定中最常用的
29報(bào)道分子是酶、熒光團(tuán)或者含有分子的放射性核素(即放射性同位素)。在酶免疫測(cè)定的情 況中，通常通過戊二醛或者高碘酸鹽將酶與第二種抗體綴合。然而正如所公認(rèn)的，存在許多 為本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于獲得的許多不同的綴合技術(shù)。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡 萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。特定酶使用的底物通常根據(jù)在由相應(yīng)酶水 解時(shí)產(chǎn)生的可檢測(cè)的顏色改變加以選擇。也可以使用熒光底物，其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物?；蛘撸梢詫晒饣衔锶鐭晒馑睾土_丹明與抗體化學(xué)結(jié)合，而不改變其結(jié)合能 力。當(dāng)通過特定波長的光照射而激活時(shí)，所述熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，在分子中誘導(dǎo) 可激發(fā)狀態(tài)，隨后發(fā)射在使用光學(xué)顯微鏡可觀察的特征性顏色的光。如在EIA中，使熒光標(biāo) 記的抗體結(jié)合第一個(gè)抗體_半抗原復(fù)合物。在洗去未結(jié)合的反應(yīng)物之后，將剩余的復(fù)合物 暴露于合適波長的光，觀測(cè)到的熒光表示存在感興趣的半抗原。免疫熒光和EIA技術(shù)在本 領(lǐng)域已經(jīng)充分確定，特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法。然而，也可以使用其它報(bào)道分子如放射性同 位素、化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然已知怎樣改變所述程序以更適合 所需目的。前文所述抗體也可用于純化本發(fā)明的重組禽類細(xì)胞因子。使用抗體親和性純化蛋 白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本文揭示的禽III型IFN的鑒別和測(cè)序促進(jìn)了用于禽類動(dòng)物疾病的診斷和預(yù)防/ 治療方案的開發(fā)。也促進(jìn)了用于其中的試劑的開發(fā)。因此，本發(fā)明應(yīng)被理解為提供了本文 所揭示的禽III型干擾素多肽或者其功能片段、衍生物或者同系物在治療和/或預(yù)防禽類 動(dòng)物疾病中的應(yīng)用。例如，本發(fā)明可特別用于但不限于治療或者預(yù)防感染病原性生物體的禽類動(dòng)物疾 病。然而，應(yīng)理解本文所述預(yù)防也包括預(yù)防或治療健康禽類動(dòng)物，以提供針對(duì)感染的保護(hù)作 用或者其它有利作用。因此，本發(fā)明一方面提供了誘導(dǎo)或者正調(diào)節(jié)禽類動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，所述方法 包括在足以誘導(dǎo)、增強(qiáng)或者另外保持免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的 前述多肽或者核酸分子。本發(fā)明另一方面提供了治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的方法，所述方法包括在足以 保持、刺激或者增強(qiáng)所述禽類動(dòng)物免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的前 述禽III型干擾素多肽或者核酸分子或者其功能片段、衍生物或者同系物。本發(fā)明再一方面提供了治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的方法，所述禽類動(dòng)物已經(jīng)暴 露于或者感染病原性生物體，所述方法包括給予所述禽類動(dòng)物有效量的前述禽III型干擾 素多肽或者核酸分子或者其功能片段、衍生物或者同系物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述禽類動(dòng)物包括家禽(poultry)、家禽 (domestic bird)或獵禽。如本文所用，“禽類動(dòng)物”是指雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯 鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡和雀等。特別優(yōu)選的禽類動(dòng)物是家禽(poultry)、家禽 (domestic bird)或獵禽，更優(yōu)選雞。根據(jù)先前的實(shí)施方案，特別優(yōu)選所述禽類細(xì)胞因子是III型干擾素分子，特別是 IFN- λ。在最特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述禽類細(xì)胞因子是ChIFN-λ。
本發(fā)明特別用于治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物病原體如細(xì)菌、病毒或者寄生蟲感染。這 種病原體例如包括禽流感病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉 氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、Marek' s病毒、雞貧血病毒、大腸桿菌、沙 門氏菌(Salmonella ssp.)、艾美球蟲(Eimeria ssp)或者支原體等。本文提及“治療”和“預(yù)防”時(shí)是指其最廣泛的含義。術(shù)語“治療”非必須意味著治 療哺乳動(dòng)物直至完全痊愈。相似地，“預(yù)防”非必須意味著預(yù)防對(duì)象最終也不感染疾病。因 此，治療和預(yù)防包括改善特定疾病的癥狀或者預(yù)防或者另外降低特定疾病的發(fā)生危險(xiǎn)。術(shù) 語“預(yù)防”可以被認(rèn)為是降低特定疾病的嚴(yán)重性或者發(fā)作?！爸委煛币部梢允墙档同F(xiàn)有疾病 的嚴(yán)重性。“有效量”是指至少部分獲得預(yù)期反應(yīng)或者延緩疾病發(fā)作或者抑制疾病進(jìn)展或者 完全停止所需的量，治療個(gè)體的特定病癥的發(fā)作或進(jìn)展，治療個(gè)體的分類，預(yù)期的保護(hù)程 度，疫苗的配制，醫(yī)療狀況的評(píng)估，以及其它相關(guān)因素。預(yù)期該數(shù)量在可以通過常規(guī)試驗(yàn)確 定的相對(duì)廣泛范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防暴露于病原性生物體的禽類動(dòng) 物的方法，所述方法包括在足以維保持、刺激或者增強(qiáng)所述動(dòng)物免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下 給予所述禽類動(dòng)物有效量的包含III型干擾素的第一個(gè)禽類細(xì)胞因子組合第二個(gè)禽類細(xì) 胞因子分子。所述第一個(gè)和第二個(gè)細(xì)胞因子可以作為兩個(gè)分子共同給予，或者它們可以作為融 合分子給予。優(yōu)選地，所述第二個(gè)禽類細(xì)胞因子選自I型或II型干擾素，例如但不限于 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、Ch IFN-α、Ch IFN-β 或者 Ch IFN-γ 等，或者選自 III 型干擾素 或者任何其它禽類細(xì)胞因子。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一個(gè)禽類細(xì)胞因子和所述第二個(gè)禽類細(xì)胞因子是 融合分子。根據(jù)本發(fā)明的整個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的第一個(gè)和第二個(gè)禽類細(xì)胞因子與動(dòng)物的免 疫系統(tǒng)相互作用，刺激、增強(qiáng)或者另外調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)于病原體攻擊的免疫應(yīng)答。本發(fā)明另一方面涉及禽III型干擾素多肽或者編碼核酸分子在治療或者預(yù)防禽 類動(dòng)物疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明再一方面涉及禽III型干擾素多肽或者核酸分子在生產(chǎn)調(diào)節(jié)禽類動(dòng)物免 疫應(yīng)答和/或治療或預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述禽III型干擾素分子是IFN- λ，特別是ChIFN- λ。本發(fā)明III型IFN可以在需要治療和預(yù)防的禽類動(dòng)物的整個(gè)生命周期期間給予。 治療或預(yù)防最有效的發(fā)育階段根據(jù)尋求抗其的保護(hù)作用的病原體的性質(zhì)而不同，包括其傳 播模式和最高傳染性時(shí)期?！白罡邆魅拘詴r(shí)期”是指這樣的宿主的發(fā)育階段，在此期間其最 易受到特定病原體的攻擊，或者在此期間由于病原體感染而存在導(dǎo)致家畜損失或者降低生 產(chǎn)力的更大可能。給予所述細(xì)胞因子影響動(dòng)物最佳發(fā)育階段的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知。因此，本發(fā)明的治療或預(yù)防方法是在指定治療或預(yù)防的家禽(poultry)、家禽 (domestic bird)或獵禽的生命周期的任何發(fā)育階段給予所述禽類細(xì)胞因子。本發(fā)明的細(xì)胞因子或者核酸分子可以通過任何方式給予，包括例如卵內(nèi)或者孵化
31后注射，腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、眼內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射或者其它注射 方式，通過加藥的食物或者治療性食物的攝取，或者通過在所述禽中導(dǎo)入編碼或者互補(bǔ)于 編碼所述細(xì)胞因子的核酸分子的分離的核酸分子，或者導(dǎo)入包含能在體內(nèi)或卵內(nèi)表達(dá)所述 細(xì)胞因子的遺傳構(gòu)建體的載體，或者例如活的重組病毒載體、活的重組細(xì)菌載體。在本發(fā)明的細(xì)胞因子通過導(dǎo)入編碼所述細(xì)胞因子的分離的核酸分子如DNA或RNA 分子或者包含能表達(dá)所述細(xì)胞因子的遺傳構(gòu)建體的載體而給予的情況中，所述核酸分子或 者遺傳構(gòu)建體在將其給予合適的禽類動(dòng)物對(duì)象之后必須被轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生生物活性細(xì) 胞因子分子。本發(fā)明的細(xì)胞因子的另一重要應(yīng)用是作為疫苗的天然佐劑，特別是通過重組DNA 技術(shù)產(chǎn)生的亞單位或者合成的肽疫苗。如本文所用，術(shù)語“佐劑”是指這樣的物質(zhì)，當(dāng)其與第二種物質(zhì)或者抗原組合給予 動(dòng)物時(shí)可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)性分子如抗體的產(chǎn)生，所述免疫反應(yīng)性分子識(shí)別所述第二種物質(zhì) 或者抗原分子。佐劑可以治療性應(yīng)用以產(chǎn)生針對(duì)少量抗原的抗體，或者延長抗體產(chǎn)生時(shí)間， 或者增加產(chǎn)生的抗體的量。不希望受到任何理論或者作用模式的限制，佐劑通過誘導(dǎo)局部 抗體形成細(xì)胞流入給予部位而發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明另一方面提供了包含禽類細(xì)胞因子分子的佐劑，其中所述細(xì)胞因子 是III型干擾素或者所述III型干擾素分子與第二個(gè)細(xì)胞因子分子之間的融合分子，以及 任選藥物可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑。優(yōu)選地，所述禽III型干擾素分子是IFN- λ，特別是ChIFN- λ。在其中所述禽類細(xì)胞是融合分子，所述第二個(gè)細(xì)胞因子可以是在禽類動(dòng)物中起作 用的任何細(xì)胞因子分子，特別是IFN-α、IFN-β、IFN- γ , Ch IFN-α、Ch IFN-β或者Ch IFN-γ，或者III型干擾素分子或者任何其它細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明，禽類細(xì)胞因子如III型干擾素、特別是ChIFN-λ，用于疫苗中以增強(qiáng) 抗原的免疫原性，特別是在亞單位疫苗中，導(dǎo)致個(gè)體禽類動(dòng)物中抗體效價(jià)增加，增強(qiáng)特定抗 原免疫的禽類動(dòng)物的保護(hù)作用(即增強(qiáng)的群體免疫性)和/或在免疫的動(dòng)物體內(nèi)增加保護(hù) 性抗體的持續(xù)性。本發(fā)明提供的另一優(yōu)勢(shì)是有效免疫動(dòng)物需要的特定抗原的數(shù)量減少，從 而降低生產(chǎn)成本。根據(jù)這些實(shí)施方案描述的本發(fā)明的細(xì)胞因子可以通過任何方式給予，包括例如通 過卵內(nèi)或者孵化后注射，如腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、眼內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下 注射或者其它注射方式，通過作為加藥食物或者治療性食物攝取。緩釋技術(shù)和活的非致病菌和病毒作為這些分子的輸送載體的開發(fā)將保證當(dāng)給予 家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者獵禽時(shí)的成本效益。其也可以用于核酸接 種中。因此，本發(fā)明的禽類細(xì)胞因子或者疫苗也可以通過遺傳方式輸送。例如，重組禽 ChIFN-λ可以由輸送系統(tǒng)中的遺傳構(gòu)建體編碼，所述輸送系統(tǒng)如病毒、酵母、細(xì)菌、原生動(dòng) 物、昆蟲、禽類動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種輸送系統(tǒng)在靶動(dòng)物中的表達(dá)使得可以輸送所述 重組禽類細(xì)胞因子。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，預(yù)期這樣的遺傳構(gòu)建體，其包含(i)可操縱地置于第一個(gè)啟 動(dòng)子序列的控制下的第一個(gè)核苷酸序列，其編碼禽III型干擾素或者所述III型干擾素與 第二個(gè)細(xì)胞因子之間的融合細(xì)胞因子分子，；(ii)可操縱地置于第二個(gè)啟動(dòng)子序列控制下
32的限定對(duì)其需要賦予免疫性的抗原的第二個(gè)核苷酸序列；以及(iii)輸送載體，其包含促 進(jìn)所述遺傳構(gòu)建體在輸送細(xì)胞中復(fù)制的遺傳序列，所述輸送細(xì)胞如細(xì)菌、酵母、昆蟲、原生 動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述III型干擾素是IFN- λ，特別是ChIFN- λ。也優(yōu)選所述第二個(gè)細(xì)胞 因子選自 IFN- α、IFN- β、IFN- γ、Ch IFN- α、Ch IFN- β 或 Ch IFN- γ，或者選自 II 型干 擾素或者任何其它細(xì)胞因子。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，所述輸送載體正常使用對(duì)于靶動(dòng)物無害或者無致病性。方便 地使用減毒的輸送載體。特別有益的輸送載體是如減毒的病毒和重組病毒以及細(xì)菌載體這 樣的載體。例如，減毒的病毒載體用作活疫苗。將編碼禽類細(xì)胞因子如ChIFN-λ或者其衍生 物的遺傳序列克隆進(jìn)病毒序列中，并將該重組病毒用于感染靶動(dòng)物。所述重組病毒導(dǎo)致動(dòng) 物細(xì)胞感染且在其中復(fù)制，導(dǎo)致重組細(xì)胞因子產(chǎn)生。感染的重組病毒隨后可以在免疫調(diào)節(jié) 有效量的重組細(xì)胞因子產(chǎn)生之后被清除。使用活的細(xì)菌載體采用相似的方案?；蛘?，可以 使用非復(fù)制、非傳染性病毒載體。非復(fù)制的病毒載體提供導(dǎo)入遺傳序列的方式，由于非復(fù)制 病毒載體不能在細(xì)胞至細(xì)胞之間傳播，因此其能瞬時(shí)表達(dá)希望的細(xì)胞因子。本發(fā)明提供了通過給予禽類細(xì)胞因子、特別是III型干擾素如ChIFN-λ或者 其衍生物，直接或者通過重組遺傳序列的表達(dá)而增強(qiáng)動(dòng)物、特別是家禽(poultry)、家禽 (domestic bird)或獵禽(如上述那些禽類動(dòng)物)免疫應(yīng)答的機(jī)會(huì)。這是特別重要的，因?yàn)?大多數(shù)亞單位和合成的肽疫苗的抗原性很低。可以單獨(dú)、組合抗原或者作為融合分子給予 所述細(xì)胞因子?？梢酝ㄟ^減毒的病毒、重組病毒載體或者細(xì)菌載體給予，或者可以通過注射 或者口服給予細(xì)胞因子(例如在加藥食物中)。本發(fā)明提供了用于禽類動(dòng)物例如家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者獵 禽的獸用藥物組合物，以增強(qiáng)所述禽類動(dòng)物的免疫系統(tǒng)或者改善其免疫活性或者促進(jìn)免疫 調(diào)節(jié)作用，所述組合物包含重組禽III型干擾素或者III型干擾素與第二個(gè)細(xì)胞因子之間 的融合分子，所述第二個(gè)細(xì)胞因子融合于抗原或者編碼抗原的遺傳序列，以及適于獸用的 一或多個(gè)載體和/或稀釋劑。優(yōu)選地，在所述組合物包含前述重組禽類細(xì)胞因子的情況中，將所述組合物在卵 內(nèi)或者孵化后注射，或者通過氣霧劑或者攝食給予。在所述組合物包含遺傳物質(zhì)的情況中， 將其作為病毒載體、細(xì)菌載體的一部分或者作為核酸分子給予。需要治療的家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者獵禽的病癥包括由前述 病毒、細(xì)菌或者寄生蟲導(dǎo)致的傳染性疾病、癌癥、免疫抑制、變態(tài)反應(yīng)，以及用于增強(qiáng)或者抑 制生殖系統(tǒng)。所述病癥也包括其中動(dòng)物處于免疫缺失狀態(tài)如應(yīng)激期間或之后、由于過度擁 擠及運(yùn)輸、氣候改變等情況。本發(fā)明的分子可以同源用于其衍生自的物種中，或者其可異源用于其中禽III型 干擾素在除了其衍生自的物種之外禽類動(dòng)物中是有效的情況中。所述組合物也可含有其它 活性分子如抗生素或者抗原分子。細(xì)胞因子分子與抗原分子的組合可增加疫苗的效力。因此本發(fā)明提供了獸用藥物組合物，其包含免疫調(diào)節(jié)有效量的禽III型干擾素或 者禽III型干擾素與第二個(gè)細(xì)胞因子或者能表達(dá)其的遺傳序列之間的融合分子，以及適于 獸用的一或多種載體和/或稀釋劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述III型干擾素是IFN-λ，特別是ChIFN-λ。在所述藥物組合物包含融合分子的情況中，所述融合分子優(yōu)選是ChIFN-λ或者 其功能片段、衍生物或者同系物與第二個(gè)細(xì)胞因子之間的融合分子，所述第二個(gè)細(xì)胞因子 選自I型干擾素如IFN-α、IFN-β、ChIFN- α、ChIFN-β，II型干擾素如IRN-α或者III 型干擾素或者任何其它干擾素。所述藥物組合物的活性成分當(dāng)根據(jù)特定情況給予一定量時(shí)，預(yù)期呈現(xiàn)刺激、增強(qiáng) 或者另外促進(jìn)動(dòng)物、特別是家禽(poultry)、家禽(domestic bird)或者獵禽免疫應(yīng)答的活 性。所述變化根據(jù)例如細(xì)胞因子而定，以及在一些情況中根據(jù)刺激免疫應(yīng)答的抗原而定。例 如，每天每千克體重需要大約0.5yg-20mg特定細(xì)胞因子，其可以組合其它細(xì)胞因子?？梢?調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以每天、每周或者每月或者以其它合適的時(shí) 間間隔給予一些分成幾部分的劑量，或者可以隨著緊急情況而按比例降低劑量。所述活性 化合物可以通過卵內(nèi)或者孵化后注射或者通過以任何便利形式口服或者可以通過遺傳序 列在百度或者細(xì)菌載體中給予。所述活性化合物也可以分散于甘油、液體聚乙二醇和/或其混合物以及在油中給 予。在常規(guī)貯存和使用條件下，這些制品含有防腐劑以防止微生物生長。適于腸道外給予的藥物形式包括無菌水溶液(在水溶性情況中)或者分散液，以 及即時(shí)制備無菌注射溶液或者分散液的無菌粉末。在所有情況中，所述形式必須是無菌的 且必須是易于注射器注射的液體。其在生產(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須是保持無 微生物如細(xì)菌和真菌污染。所述載體可以是溶劑或者分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇以及液體聚乙二醇等)，合適的其混合物，以及植物油?？梢岳缤ㄟ^ 使用包膜如卵磷脂，通過在分散情況中保持顆粒大小以及通過使用表面活性劑，從而保持 適當(dāng)流動(dòng)性?？梢酝ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑防止微生物作用，所述抗菌劑和抗真菌劑例 如是抗生素、parabens、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thimerosal等。在許多情況中，優(yōu)選包括等 滲劑，例如糖或者氯化鈉。延長所述注射組合物的吸收可以例如通過在組合物中使用延遲 吸收的制劑而實(shí)現(xiàn)。無菌注射溶液的制備是通過將活性化合物以需要量摻入根據(jù)需要而具有上述各 種其它成分的合適溶劑中，隨后過濾滅菌。通常地，制備分散液是通過將不同的無菌活性成 分摻入無菌載體中，所述無菌載體含有基本分散介質(zhì)以及需要的上述其它成分。在制備無 菌注射溶液的無菌粉末情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥以及冷凍-干燥技術(shù)，產(chǎn)生活 性成分加上前述無菌過濾溶液任何其它所需成分的粉末。適于獸用的載體和/或稀釋劑包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、水溶液、包膜、抗 菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這種介質(zhì)和制劑在藥物活性物質(zhì)中的應(yīng)用為本領(lǐng) 域熟知。除了與所述活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或制劑之外，其它均可以用于所述組 合物中。輔助的活性成分也可以摻入組合物中。后者是本發(fā)明特別預(yù)期的多價(jià)疫苗或者多 成分細(xì)胞因子分子。本發(fā)明的獸用藥物組合物除了禽III型干擾素或者包含其融合分子之外，還可包 含一或多種其它活性化合物如抗原或者免疫刺激化合物。所述細(xì)胞因子也可以通過活的輸送系統(tǒng)輸送，例如使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)菌中表 達(dá)所述細(xì)胞因子蛋白，其可以被摻入腸道菌群中(gut flora)。或者，可以使用病毒表達(dá)載
34體或者將其摻入重組疫苗中。在這方面，一種形式的病毒表達(dá)是在為動(dòng)物提供傳染有效量 的活的載體(例如病毒或細(xì)菌)的情況中，通過噴霧、飼料或者水給予活的載體。另一形式 的病毒表達(dá)系統(tǒng)是非復(fù)制病毒載體，其能感染細(xì)胞但不在其中復(fù)制。所述非復(fù)制病毒載體 提供了將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞因子中以瞬時(shí)表達(dá)的方式。給予這種載體的模式與給予活的病 毒載體的模式一樣。本發(fā)明通過如下非限制性圖和實(shí)施例得以進(jìn)一步描述。實(shí)施例1 雞III型IFN的克隆、表達(dá)和鑒定材料和方法淋巴細(xì)胞的分離和細(xì)胞培養(yǎng)從4周齡無特定病原體(SPF)的雞中獲取脾，通過70 μ m濾網(wǎng)過濾進(jìn)入含有DMEM 的培養(yǎng)皿中，從各個(gè)脾中制備白細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。將懸浮液經(jīng)過Iymphopr印(Nicomed Pharma AS, Oslo)分層，在1500gmax離心15分鐘。收集在界面的單核細(xì)胞，洗滌，重懸浮，并 在補(bǔ)加10% FCS的DMEM中培養(yǎng)。將連續(xù)的雞巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系HDll維持在補(bǔ)加6% FCS、 2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100 μ g/ml)的RPMI中。根據(jù)需要傳代HDll細(xì) 胞，并接種過夜至80%鋪滿，之后進(jìn)行IFN處理。試齊[J根據(jù)廠商指導(dǎo)制備合成的(1謂嫩類似物？017(1:0 (Invivogen)和ssRNA類似 物poly C(Invivogen)并貯存。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生雞IL6 (chIL6) (Asif et al.， manuscript in preparation)禾口 ChIFN γ (ChIFNY) (Digby andLowenthal 1995)。 核酸 在-80°C貯存，將細(xì)胞因子在4°C貯存。病毒培養(yǎng)將Hmi型流感病毒A/PR/8/34 (PR8) (Talon et al.，2000)在10天齡含胚雞卵的 尿囊腔中培養(yǎng)48小時(shí)。然后收獲含有尿囊液的病毒，等份以及在-80°C貯存。隨后將病毒 在HDll雞巨噬細(xì)胞中傳代5次，通過確定50%終點(diǎn)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)，在這些細(xì) 胞單層上滴定傳染性。RNA分離逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)廠商指導(dǎo)，使用Tri-試劑(Sigma-Aldrich)收獲RNA。根據(jù)廠商指導(dǎo)，使 用DNase 1 (Sigma-Aldrich)對(duì)提取的RNA進(jìn)行Dnase處理。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega)將Dnase處理的RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)?？寺『捅磉_(dá)設(shè)計(jì)IFN-特異性引物以擴(kuò)增全長ChIFNX、ChIFNa和ChIFN^，這些引物在表3 中示出。將合成的cDNA與基因特異性引物用于標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，使用35次如下循環(huán) 94°C 1分鐘，55°C 1分鐘以及72°C 1分鐘；以及在72°C進(jìn)一步延伸15分鐘，隨后進(jìn)行最后 的循環(huán)。將感興趣的DNA產(chǎn)物通過使用凝膠提取試劑盒(Qiagen)進(jìn)行凝膠純化，然后在 pGemT-Easy (Promega)中連接以進(jìn)行序列分析。將這些載體命名為pGemIFNλ、pGemIFNα 禾口 pGemIFN β。pQE50IFNA、pQE50IFNa 和 pET32IFN0 表達(dá)載體的構(gòu)建引物λ 3和λ 4(表3)分別含有BamHI和HindIII限制位點(diǎn)，將其用于在標(biāo)準(zhǔn) PCR中從pGemIFNX中擴(kuò)增ChIFNX成熟0RF。對(duì)PCR片段進(jìn)行純化以及限制消化，然后連接在BamHI和HindIII限制消化的pQE50 (Qiagen)表達(dá)載體的6XHis-標(biāo)記序列下游 以產(chǎn)生pQE50IFNX。使用引物α 3和α4(表3)將ChIFNa相似地亞克隆進(jìn)表達(dá)載體 PQE30 (Qiagen)中，產(chǎn)生pQE30IFN α。使用引物β3和β4(表3)將ChIFN^也相似地亞 克隆進(jìn)表達(dá)載體ΡΕΤ32 (Novagen)中，產(chǎn)生pET32IFN β。使用BamHI和HindIII限制消化以 及DNA測(cè)序證實(shí)所有三個(gè)表達(dá)載體。重組ChIFN λ、α和β的表達(dá)和純化使用標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)程序表達(dá)每個(gè)雞IFN (Qiagen, 1997)。培養(yǎng)大腸桿菌菌株 TOPlOF' (pQE30IFNa )、T0P10F' (pET32IFN3 )或者 T0P10F' (pQE50IFNλ )，并通過異 丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，然后通過離心收獲。使用Triton X-100處理超聲 處理的細(xì)胞裂解物，使用金屬-親和性層析固定蛋白質(zhì)，然后使用咪唑洗脫。在每個(gè)純化步 驟收集樣品進(jìn)行分析，在12% SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行。使用Detoxi-gel (Pierce，USA)對(duì)樣 品進(jìn)行解毒，以從純化的樣品中除去任何LPS。使用Semliki Forest Virus (SFV)生物測(cè)定法測(cè)定IFN活性如先前所述(Lowenthal et al.，1995)，通過IFN抑制SFV-介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的能 力確定其活性。將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)以5X104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔平板中，在補(bǔ) 加10% FCS的DMEM中在37°C保溫過夜。然后棄去培養(yǎng)基，一式兩份加入樣品。將細(xì)胞與 樣品保溫18小時(shí)，然后將培養(yǎng)基用含有SFV (103TCID5(1/ml)的100 μ 1 DMEM置換，在37°C保 溫過夜。通過中性紅染料的攝取以及測(cè)量的吸光度(OD54tl)確定細(xì)胞生存力。硝酸鹽產(chǎn)生測(cè)定雞細(xì)胞系(HDll)用于確定氧化氮的產(chǎn)生，通過Greiss測(cè)定(Migliorini etal.， 1991)同樣方式測(cè)量亞硝酸鹽的積聚(Green et al. , 1982 ；Sung et al.，1991)，然后測(cè)量 吸光度(OD540)。通過PR8抑制作用確定IFN活性將HDll細(xì)胞生長至80%鋪滿，然后加入IFN。將PR8加入含有胰蛋白酶(5 μ g/ ml)的RPMI中，然后加入孔中(moi 0. 1)，保溫1小時(shí)。然后用補(bǔ)加1 % FCS和5 μ g/ml胰 蛋白酶的RPMI置換含有病毒的培養(yǎng)基，在37 L保溫直至90小時(shí)。通過凝血活性檢測(cè)上清 中病毒的存在情況。凝血試驗(yàn)在微滴定平板(Thermo)中進(jìn)行凝血(HA)試驗(yàn)。將在PBS中連續(xù)2倍稀釋的病毒 樣品與等體積的0.5% (vol/vol)得自SPF雞的懸浮的新鮮雞紅細(xì)胞組合。使組合的病毒 和紅細(xì)胞在室溫保溫30分鐘。觀測(cè)含有貼壁同源紅細(xì)胞層的孔為凝血狀態(tài)，記錄為陽性。 出現(xiàn)陽性凝血的最低病毒稀釋度記錄為HA單位/ml (HAU) (Li et al.，2005)。半定量RTPCR (qRT-PCR)根據(jù)廠商指導(dǎo)(Applied Biosystems)，在ABI Prism 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)上相對(duì) 定量處理后的基因表達(dá)，使用比較閾值法(Ct)獲得基因表達(dá)的倍數(shù)變化。使用如先前所述 (Karpala et al.，in press)數(shù)學(xué)公式 Δ Δ Ct (AppliedBiosystems)獲得的平均值計(jì)算相 對(duì)基因表達(dá)。結(jié)果ChIFNA的分子克隆和生物信息分析
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得自用Poly(I:C)刺激2小時(shí)的雞脾白細(xì)胞的cDNA用作模板，進(jìn)行雞IFNX的 PCR擴(kuò)增。鑒別一個(gè)561堿基對(duì)(bp)的條帶(數(shù)據(jù)未示出)?？寺hIFNa和ChIFNi^相 似地分別獲得582和612bp的DNA條帶(數(shù)據(jù)未示出)。獲得所有三個(gè)IFN的序列。先前 已經(jīng)報(bào)道了 ChIFN α和β序列(Sekellick et al.，1994)。因此，將新鑒別的雞基因稱作 ChIFNA。ChIFNX的基因組結(jié)構(gòu)看起來組構(gòu)成5個(gè)外顯子區(qū)，產(chǎn)生預(yù)測(cè)分子量為21kDa的 由186個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(圖3)。對(duì)ChIFNX進(jìn)行的信號(hào)肽分析(Bendtsen et al.， 2004)揭示在第21與22位殘基之間的裂解位點(diǎn)(圖3)。ChIFN λ與HuIFN λ II具有相對(duì)較 高的氨基酸(aa)相同性(36% )，而與其它雞細(xì)胞因子對(duì)比觀測(cè)到相對(duì)較低的氨基酸相同 性(表4)。將翻譯的ChIFNX與一些其它先前定義的IFNX II對(duì)比，鑒別保守的殘基(圖 2)。系統(tǒng)發(fā)生分析進(jìn)一步示出ChIFNX簇接近HuIFN λ II (IL28A)，并支持ChIFN λ與 HuIFN λ 2結(jié)構(gòu)最相似(圖4)。重組ChIFN α、β和λ的表達(dá)將編碼每個(gè)ChIFN的成熟蛋白質(zhì)的ORF亞克隆進(jìn)其表達(dá)載體中，表達(dá)及純化，隨后 使用SDS-PAGE分析。預(yù)期表達(dá)的ChIFN α和ChIFN λ的分子量為大約22kDa (圖5A和C)。 用于ChIFNii的pET32a表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生大約34kDa的預(yù)期分子量(圖5B)。ChIFNA與HDll相似地在雞巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中刺激氧化氮產(chǎn)生活性氧和氮(ROS)的產(chǎn)生是病毒重要的細(xì)胞抑制機(jī)制(Schroder et al.，2004)。 ChIFN γ已經(jīng)示出刺激影響氧化氮水平的代謝物的產(chǎn)生(Lowenthal etal.，1995)。為了 檢測(cè)ChIFNX的氧化氮增強(qiáng)活性，將HDll細(xì)胞用2倍稀釋的重組(r)ChlFNX處理，并與 rChIFN γ和rChIFNP對(duì)比。RChIFNX與rChIFNP相似地增強(qiáng)氧化氮的產(chǎn)生(圖6)。 RChIFN γ證實(shí)對(duì)于檢測(cè)的IFN最高的氧化氮活性(圖6)。ChIFNA的體外生物活性低于ChIFN α為了評(píng)定ChIFN λ的病毒抑制性質(zhì)，將rChIFN α與rChIFN λ在SFV生物測(cè)定中 進(jìn)行對(duì)比。隨后在CEF細(xì)胞中通過每種rChIFN降低病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解(圖7)。ChIFNA對(duì)于流感病毒(PR8)具有抑制作用由于ChIFNX呈現(xiàn)對(duì)于SFV的病毒抑制作用，因此研究其對(duì)于流感病毒的抑制作 用。將HDll細(xì)胞用rChIFNa、rChIFN^或者rChIFNA預(yù)處理，然后用PR8感染，通過HA 試驗(yàn)確定對(duì)于PR8的不同濃度依賴性保護(hù)水平(圖8)。在較高的rChIFNX劑量(IOOng/ ml)，與未處理的細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)相比病毒效價(jià)降低，范圍是在感染后(pi)40小時(shí)無病 毒至在感染后90小時(shí)320HAU(圖8)。最低劑量(25ng/ml)獲得一些保護(hù)作用，中等劑量 (50ng/ml)獲得中等保護(hù)作用(圖8).這清楚證實(shí)IFN λ在雞巨噬細(xì)胞中抑制流感病毒。應(yīng) 用rChIFNa具有最大的保護(hù)作用，范圍是在感染后90小時(shí)在最高劑量(lOOng/ml)未檢測(cè) 到病毒至在最低劑量(25ng/ml)為1280HAU/ml (圖8)。ChIFNP也提供了保護(hù)作用，范圍是 在感染后90小時(shí)在較高劑量(lOOng/ml)未檢測(cè)到病毒至在最低劑量(25ng/ml 5120HAU/ ml (圖8)。總之，所有測(cè)試的IFN均以劑量依賴性方式抑制流感病毒效價(jià)。雞白細(xì)胞正調(diào)節(jié)IFNX，與I型IFN相似由于IFNX看起來與I型IFN在抗病毒方面功能相似，因此測(cè)量ChIFNX是否以 與I型IFN、ChIFNa和ChIFNP相似的方式被誘導(dǎo)。因此，Poly(I:C)用于刺激脾白細(xì)胞，
37通過qRT-PCR測(cè)量ChIFN α、ChIFN^和ChIFN λ的mRNA水平。在刺激后2小時(shí)發(fā)現(xiàn)所有 3 個(gè) ChIFN 均被正調(diào)節(jié)(圖 9)。ChIFN α，mRNA 增加 86 倍，ChIFN β 增加 52-倍，ChIFN λ 增加15倍(圖9)。在刺激后4小時(shí)所有IFN的IFN正調(diào)節(jié)程度均降低(圖9)。ChIFNX 被正調(diào)節(jié)程度低于ChIFN α或ChIFN β。TLR3由I型IFN而不是IFN λ誘導(dǎo)研究I型IFN可誘導(dǎo)基因是否可以相似地被ChIFNX誘導(dǎo)。先前的研究表明抗 病毒相關(guān)受體TLR3是I型ISG(Tissari et al.，2005)。因此將雞脾白細(xì)胞與rChIFN α、 rChIFN^ 或者 rChIFNX 培養(yǎng)，表明僅 I 型 IFN(rChIFNa、rChIFN^)顯著誘導(dǎo) TLR3 (圖 10)。在應(yīng)用50ng/ml的rChIFNa和rChIFNP在2小時(shí)之后誘導(dǎo)TLR3分別為6. 6倍和 7. 5倍，在100ng/ml較高劑量分別為11. 3倍和12. 3倍(圖10)，而rChIFN λ對(duì)于TLR3誘 導(dǎo)作用很小。實(shí)施例2方法將H5m病毒A/Vietnam/1203/04 (V/1203)流感病毒在10天齡含胚無特定病原體 (SPF)卵的尿囊液中進(jìn)行傳代。收獲尿囊液，等份，然后在-80°C貯存以進(jìn)行接種。SPF白色 來亨雞(4周齡)經(jīng)眼內(nèi)接種50卵感染劑量(EID50)的V/1203。感染后(p. i.)24小時(shí)，將 雞麻醉，立即取組織樣品進(jìn)行RNA提取，隨后通過qRT-PCR分析IFN λ。卞艮Karpala, A. J. ， K. R. Morris, Μ. Μ. Broadway, P. G. Mcffaters, Τ. Ε. 0' Neil, K. Ε. Goossens, J. W. Lowenthal, and Α. G. Bean. 2008. Molecularcloning, expression, and characterization of chicken I FN-lamb da. J InterferonCytokine Res 28 :341_50 所述 方法，使用IFNX進(jìn)行病毒保護(hù)作用。通過以每個(gè)卵1000 μ g或者20 μ g稀釋純化的抗-chIFN λ，進(jìn)行流感病毒和抗血 清的卵內(nèi)接種。將200 μ L抗-chIFN-抗體與200 μ L疫苗病毒注射進(jìn)每個(gè)卵的尿囊液中。48 小時(shí)后，從每個(gè)卵中取5mL尿囊液，通過凝血測(cè)定確定病毒效價(jià)(Karpala et al.，2008)。IFN λ佐劑活性通過注射有或無IFN λ的羊紅細(xì)胞(SRBC)測(cè)定。在第0天為4組 SPF雞注射0. Olml SRBC和各佐劑，然后在第15天單獨(dú)注射SRBC。在不同時(shí)間點(diǎn)取雞血樣， 根據(jù) Van der Zijpp and Leenstra, Poultry Sci. 59 1363-1369 的方法通過 HA 確定總抗 體。結(jié)果在雞感染H5m (禽流感)之后誘導(dǎo)IFN λ表達(dá)(圖11)。證實(shí)應(yīng)用IFN λ在感染 前和之后在體外對(duì)抗流感的保護(hù)作用，然而當(dāng)在感染之前應(yīng)用IFNX時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)保護(hù)作 用(圖12)。這些發(fā)現(xiàn)與這樣的事實(shí)一致，即chIFNX活性的抑制(通過IFN λ的抗體)增 強(qiáng)流感疫苗在卵中的生長(圖13)。證實(shí)IFNX呈現(xiàn)佐劑潛力，因?yàn)槠湓诳乖?羊紅細(xì)胞)接種之后刺激抗體產(chǎn)生(圖 14)。應(yīng)用IFNX抑制ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖(圖15)。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到除了特殊描述之外可以對(duì)本發(fā)明加以改變和修改。應(yīng)理解 本發(fā)明包括所有這種改變和修改。本發(fā)明還包括本說明書中個(gè)別或總體提及或者指定的所 有步驟、特征、組合物和化合物，以及任兩或多個(gè)所述步驟或特征的任何及所有組合。參考文獻(xiàn)
38
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表4
ChIFNA與其它物種的IFNX及其它雞細(xì)胞因子的相似性
權(quán)利要求
分離的核酸分子，其編碼禽類干擾素 λ(IFN λ)多肽或者其功能片段或者與編碼禽類干擾素 λ(IFN λ)多肽或者其功能片段的核酸分子互補(bǔ)。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述禽類是雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、 鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述禽類是雞。
4.權(quán)利要求3的分離的核酸分子或者所述分離的核酸分子的功能片段或者禽類同 系物，所述核酸分子包含這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼或者互補(bǔ)于編碼SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列或者其功能片段或者禽類同系物的序列，或者編碼或者互補(bǔ)于 編碼與SEQ ID NO :2或4所示序列在全長上具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列相同性的氨基 酸序列的序列，或者能在低嚴(yán)格條件下與所述核酸分子雜交的核酸序列。
5.權(quán)利要求3的分離的核酸分子或者所述分離的核酸分子的功能片段或者禽類同系 物，其中所述核酸分子包含核苷酸序列或者與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列，其中所述核苷 酸序列是SEQ ID NO 1或3所示序列或者是與SEQ ID NO 1或3所示序列在全長上具有至 少大約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高相同性的核苷酸序列，或者是在低嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO :1或3所示序列雜交的核苷酸序列或者其互補(bǔ)形式。
6.權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述分子包含SEQID NO :1或3所示核苷酸序 列或者所述分子的功能片段。
7.權(quán)利要求4或5的分離的核酸分子，其中所述嚴(yán)格條件是中等嚴(yán)格條件。
8.權(quán)利要求4或5的分離的核酸分子，其中所述嚴(yán)格條件是高嚴(yán)格條件。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述序列是cDNA序列。
10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述序列是基因組序列。
11.分離的多肽，其中所述多肽是禽類干擾素_λ(IFN-λ)多肽或者其功能片段。
12.權(quán)利要求11的分離的多肽，其中所述禽類是雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、 鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀。
13.權(quán)利要求12的分離的多肽，其中所述禽類是雞。
14.權(quán)利要求13的分離的多肽或者所述分離的多肽的功能片段或者禽類同系物，其中 所述多肽包含SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列或者與SEQID NO :2或4所示序列在全長上 具有至少大約 60%,65%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%或99%或者更高相同性。
15.權(quán)利要求14的分離的多肽，其中所述多肽由權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)的核酸序列編碼。
16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的禽類干擾素-λ多肽與如下任一干擾素之間的融合多肽i)III型干擾素，或者ii)I 型或者 II 型干擾素，如選自 IFN-a、IFN-β、IFN-Y、Ch IFN-α、ChIFN-β 或者 Ch IFN-y之一的干擾素。
17.權(quán)利要求16的融合多肽，其中所述I、II或者II型干擾素是禽類I型、II型或者III型干擾素。
18.權(quán)利要求17的融合多肽，其中所述禽類是雞、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠雞、鴨、鵝、 鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀。
19.權(quán)利要求18的融合多肽，其中所述禽類是雞。
20.編碼權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的融合多肽的核酸分子。
21.包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，其中所述核酸分子是權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子。
22.包含核酸分子的遺傳構(gòu)建體，其中所述核酸分子是權(quán)利要求21的核酸分子。
23.在細(xì)胞中產(chǎn)生重組禽類干擾素_λ分子的方法，包括如下步驟 (i)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求21或22的遺傳構(gòu)建體；( )在足以使所述核酸表達(dá)的時(shí)間和條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
24.通過權(quán)利要求23的方法產(chǎn)生的重組禽類干擾素-λ分子。
25.表達(dá)權(quán)利要求24的重組禽類干擾素-λ的分離的細(xì)胞。
26.包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子的分離的細(xì)胞。
27.包含權(quán)利要求21-22任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體的分離的細(xì)胞。
28.權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28的分離的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是禽類細(xì)胞。
30.權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌。
32.能結(jié)合權(quán)利要求11-19或者24任一項(xiàng)的多肽的抗體分子。
33.在其上記錄權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的至少一個(gè)核酸和/或多肽序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
34.鑒別禽類干擾素_λ遺傳序列的方法，其中所述方法包括將核酸樣品與雜交有效 量的針對(duì)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核苷酸序列的禽類干擾素-λ探針接觸，然后檢測(cè)所述雜 交情況。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述探針針對(duì)或者衍生自SEQID NO :1或3所示核苷酸 序列或者其互補(bǔ)序列或者功能片段。
36.權(quán)利要求35的方法，其中第一種引物分子針對(duì)SEQID NO :1或3所示核苷酸序列 的有義鏈或者其同系物，第二種引物分子針對(duì)SEQ IDNO :1或3所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列 或者其同系物。
37.測(cè)量禽類動(dòng)物中權(quán)利要求11-15的禽類干擾素-λ多肽水平的測(cè)定方法，包括將得 自所述禽類動(dòng)物的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求32的抗體在足以使得抗體-干擾素_λ復(fù)合物 形成的時(shí)間和條件下接觸，然后檢測(cè)所述復(fù)合物形成情況。
38.誘導(dǎo)或者正調(diào)節(jié)禽類動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括在足以誘導(dǎo)、增強(qiáng)或者 另外保持免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的 多肽或者其功能片段或者同系物，或者給予權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的融合多肽。
39.治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物疾病的方法，所述方法包括在足以誘導(dǎo)、增強(qiáng)或者另外保持 免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的多肽或者 其功能片段或者同系物，或者給予權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的融合多肽。
40.治療已經(jīng)暴露于或者感染病原性生物的禽類動(dòng)物的方法，所述方法包括在足以保 持或者正調(diào)節(jié)所述禽類動(dòng)物的免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下給予所述禽類動(dòng)物有效量的權(quán)利 要求11-15任一項(xiàng)的多肽或者其功能片段或者同系物，或者給予權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的 融合多肽。
41.權(quán)利要求38或39任一項(xiàng)的方法，其中所述禽類動(dòng)物易感或者已經(jīng)感染了病原體。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中所述病原體是病毒、細(xì)菌或者寄生蟲。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述病原體是禽流感病毒(avianinfluenzavirus), 傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)、雞傳染性支氣管炎病毒 (avian infectious bronchitis virus)、雞傳染 f生喉氣管炎病毒(avianinfectious laryngotracheitis virus)、傳染j"生支氣管炎病毒(infectious bronchitisvirus)、新城 疫病毒(Newcastle disease virus) > Marek' s病毒、雞貧血病毒、大腸桿菌、沙門氏菌 (Salmonella ssp·)、艾美球蟲(Eimeria ssp)或者支原體(Mycoplasmas ssp)。
44.權(quán)利要求38-43任一項(xiàng)的方法，其中所述禽類動(dòng)物是雞、、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠 雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述禽類動(dòng)物是雞。
46.權(quán)利要求38-45任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽與第二種禽類細(xì)胞因子分子組合給 予，所述第二種禽類細(xì)胞因子分子選自III型干擾素、I型干擾素或者II型干擾素。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述第二種禽類細(xì)胞因子分子是IFN-α、IFN-β、 IFN- γ、Ch IFN- α、Ch IFN- β 或者 Ch IFN- γ。
48.權(quán)利要求11-19的禽類干擾素-λ多肽或者權(quán)利要求1-10的核酸分子在治療禽類 動(dòng)物中的應(yīng)用。
49.權(quán)利要求11-19的禽類干擾素-λ多肽或者權(quán)利要求1-10的分離的核酸分子在禽 類動(dòng)物中保持、刺激或者增強(qiáng)免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。
50.權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)的禽類干擾素-λ多肽或者權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分 子在生產(chǎn)治療或者預(yù)防禽類動(dòng)物病原體感染的藥物中的應(yīng)用。
51.權(quán)利要求50的應(yīng)用，其中所述病原體是病毒、細(xì)菌或者寄生蟲。
52.權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述病原體是禽流感病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞傳染 性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、Marek' s病 毒、雞貧血病毒、大腸桿菌、沙門氏菌(Salmonella ssp.)、艾美球蟲(Eimeria ssp)或者支 原體。
53.權(quán)利要求48-52任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述禽類動(dòng)物是雞、、火雞、矮腳雞、鵪鶉、珍珠 雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、鴿子、金絲雀、虎皮鸚鵡、鸚鵡或者雀。
54.權(quán)利要求53的應(yīng)用，其中所述禽類動(dòng)物是雞。
55.權(quán)利要求38-47任一項(xiàng)的方法或者權(quán)利要求48-52任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多肽、 核酸分子或者藥物是適于通過動(dòng)物攝食或者通過卵內(nèi)注射、孵化后注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi) 注射、肌內(nèi)注射、眼內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或者皮下注射給予禽類動(dòng)物的形式。
56.適于由禽類攝食形式的加藥或者治療性食品，其包含權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)的重 組禽類干擾素- λ多肽或者權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子。
57.包含權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)的多肽以及任選藥物可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑的佐劑。
58.包含權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)的多肽以及獸用可接受的一或多種載體和/或稀釋劑 的獸藥組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及具有禽類細(xì)胞因子性質(zhì)的新的重組多肽以及編碼其的遺傳序列。本發(fā)明具體涉及重組禽類III型干擾素多肽，編碼其的遺傳序列，以及細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明更具體涉及禽類干擾素-λ(IFN-λ)及其功能衍生物、同系物和片段，以及其使用方法。本發(fā)明的分子和細(xì)胞具有廣泛應(yīng)用，包括但不限于提供治療和預(yù)防疾病、具體是禽類疾病的手段和方法，或者用作免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還提供了篩選免疫應(yīng)答的診斷手段以及鑒別IFN-λ蛋白或核酸功能性的調(diào)節(jié)劑的篩選手段。
文檔編號(hào)A61P31/12GK101918440SQ200880117003
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者A·G·D·比恩, A·J·卡爾帕拉, J·W·洛溫塔爾 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織;澳大利亞家禽合作研究中心私人有限公司