專利名稱：:一種刺激軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的組合物(骨膠原羥基磷灰石化合物)，其制備方法以及含...的制作方法本發(fā)明涉及一種可刺激軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的骨膠原羥基磷灰石化合物(OHC)。本發(fā)明還涉及制造OHC的方法。本發(fā)明進(jìn)一步地涉及到含有OHC的藥劑的用途，尤其用于口服時(shí)，可預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)和骨質(zhì)疏松，并可用以治愈骨折，軟骨缺損和骨缺損。從皮質(zhì)甾類療法中得知一種微晶羥基磷灰石組合物(MCHC)可用于預(yù)防骨質(zhì)疏松，見A.Pines等等所著“當(dāng)代醫(yī)藥研究和見解”8卷，10期，1984，734-742頁，本組合物含有大約50%重量比的羥基磷灰石和磷酸鈣的復(fù)合鹽，還含有約26%的骨膠原以及約9%的非骨膠原蛋白/肽，另外還含有0.65%的鈉以及鎂和鉀以及痕量元素氟、鋅、鍶、硅、鐵、銣、銫和鉑，最后還含有葡糖胺聚糖、檸檬酸鹽和水。而對于如何制造MCHC都是一無所知的。本發(fā)明的目的是提供一種骨膠原羥基磷灰石化合物(OHC)及其制造方法。本發(fā)明的另一目的是提供含有OHC化合物的復(fù)方藥劑，本藥劑可刺激軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，以預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松，并可用以治愈骨折，軟骨缺損和骨缺損。據(jù)發(fā)現(xiàn)，OHC對骨和軟骨的新陳代謝有特殊作用，因其含有以非變性狀態(tài)存在的有機(jī)成分和以生理平衡比例存在的無機(jī)成分。使用OHC可以保證向人類和動物機(jī)體的骨略系統(tǒng)提供必需物質(zhì)(非膠原骨特有肽，局部骨和軟骨細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)因子，鈣和磷)。OHC提供骨膠原的有機(jī)骨膠原質(zhì)以及必需的骨質(zhì)特有的，非膠原肽以及蛋白質(zhì)聚糖，以支持骨的新陳代謝。OHC還促進(jìn)骨質(zhì)再生并能增強(qiáng)對包埋在骨膠原質(zhì)內(nèi)的骨羥基磷灰石無機(jī)成分的摻入。OHC還可刺激體內(nèi)軟骨的修復(fù)機(jī)能并可防止軟骨組織的退化。OHC對成骨細(xì)胞具有一種生物作用的特性，這些成骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨組織的生成，OHC加強(qiáng)了成骨細(xì)胞的增生和代謝，進(jìn)而促進(jìn)了非特異性間質(zhì)細(xì)胞對軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化。因此OHC是治療不同病源骨疾病的一種新藥，如可治療第一期和第二期的骨質(zhì)疏松，可治愈骨折，骨缺損，以及可作為骨修補(bǔ)術(shù)用藥。從所述的OHC的細(xì)胞生物學(xué)特性看，OHC在動物體內(nèi)有藥理作用，對人有臨床治療作用，OHC明顯地優(yōu)于鈣類制劑以及所有骨粉食品。對于治療骨質(zhì)疏松，OHC藥品提供了一種真正可以取代骨重吸收抑制劑的物質(zhì)，如雌激素和降鈣素。OHC不僅抑制了骨的重吸收，而且促進(jìn)了骨的生長。不同于現(xiàn)存的一些藥品，這些藥品也可刺激骨的新陳代謝，如氯化鈉和二膦酸，OHC顯然副作用較小，如無胃腸道反應(yīng)和關(guān)節(jié)疼痛等付作用。二膦酸的治療范圍較窄，而在此范圍內(nèi)，OHC實(shí)際上是無毒的。另外，OHC對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生出一種生物作用，這些軟骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)軟骨組織的形成和重吸收。軟骨細(xì)胞受到OHC刺激不失去表型并能增生和增加代謝，還可預(yù)防用藥(如皮質(zhì)類固醇激素)后所致的軟骨方面的疾病。另外，OHC促進(jìn)了非特異性間質(zhì)細(xì)胞對軟骨細(xì)胞的分化以此促進(jìn)軟骨的組織變形，這是在軟骨組織中起重要作用的過程。OHC對于治療骨關(guān)節(jié)炎具有突出療效，骨關(guān)節(jié)炎減少了軟骨細(xì)胞的數(shù)量以及降低了它們的代謝活性，而軟骨組織的再生需要有序的軟骨組織。OHC還適于治療骨質(zhì)疏松，并可治愈骨折、骨和軟骨的損傷。OHC的生物活性可以在體外鑒定，例如a).對于成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的DNA合成的刺激作用，b).對于軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的蛋白合成的刺激作用，c).與對總蛋白合成的刺激作用相比較，對于軟骨細(xì)胞的骨膠原總合成的選擇性刺激作用，d).對于軟骨細(xì)胞中的蛋白X和蛋白Y的合成的誘導(dǎo)作用，e).促進(jìn)非特異性間質(zhì)細(xì)胞對軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化，在OHC刺激骨膠原總合成物時(shí)，Ⅰ型骨膠原與Ⅱ型骨膠原在骨細(xì)胞培養(yǎng)基中的比例可以一直保持不變，盡管時(shí)間已超過了24小時(shí)，但仍可保護(hù)軟骨細(xì)胞的表型。用一種普通的方法測定作用于DNA合成時(shí)的生物活性，即測定細(xì)胞株對3H-胸腺嘧啶核甙攝入的刺激，細(xì)胞株如3T3纖維組織細(xì)胞;見JimenedeAsua等等所著“美國自然學(xué)術(shù)科學(xué)方法”，72卷(1975)，2724-2728頁。這是鑒定細(xì)胞分裂物質(zhì)所用的常規(guī)生物技術(shù)方法。因細(xì)胞株易于培養(yǎng)，在鑒定方法中使用細(xì)胞株是十分便利的。本試驗(yàn)方法是根據(jù)以下考慮設(shè)計(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的未轉(zhuǎn)化、纖維組織母細(xì)胞具有兩種極端生長階段。靜止階段時(shí)，細(xì)胞處以G0-G1狀態(tài)，因此不會分裂。另一個(gè)是活躍的增殖階段。必要營養(yǎng)物、漿液或其它生長促進(jìn)因子可以調(diào)節(jié)靜止階段向增殖階段轉(zhuǎn)化的過程。OHC即含有如此的生長促進(jìn)因子，因此將OHC溶于中性緩沖生理鹽水溶劑中，如磷酸緩沖鹽水(PBS)或生理鹽水中，本溶液具有一種高刺激性，用藥劑量與靜止期的3T3纖維組織母細(xì)胞吸收3H胸腺嘧啶核甙相關(guān)。為測定3T3纖維組織母細(xì)胞由于刺激作用而吸收3H胸腺嘧啶核甙時(shí)，使用常規(guī)消毒方法即γ-射線照射食物和藥品制劑，并不會消弱OHC的生物活性。測定OHC對于成骨細(xì)胞的DNA合成物的細(xì)胞特異性刺激作用時(shí)，也可采用上述試驗(yàn)方法。通過一系列的酶解試驗(yàn)，可以獲得鼠顱蓋成骨細(xì)胞的類群，成骨細(xì)胞的類群可代表成骨細(xì)胞成熟的各個(gè)不同階段類群Ⅰ-Ⅲ視為前成骨細(xì)胞型，類群Ⅳ-Ⅶ視為成骨細(xì)胞型，類群Ⅴ視為靜止期成骨細(xì)胞。中性的可溶解的OHC成分的給藥劑量取決于OHC對Ⅴ和Ⅵ的成骨細(xì)胞刺激所產(chǎn)生的影響，在平行試驗(yàn)中，鼠成纖維細(xì)胞初始培養(yǎng)相的增生不受刺激，隨后，從試驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)中性可溶性的OHC成分具有骨細(xì)胞的特殊活性。用一種常規(guī)方法確定對蛋白質(zhì)合成的生物效應(yīng)，即測定細(xì)胞，如3T3成纖維細(xì)胞，人包皮成纖維細(xì)胞，對L-(S-3H)-脯氨酸的攝入刺激，此方法是根據(jù)以下考慮設(shè)計(jì)的受刺激的細(xì)胞蛋白合成增加。如果在培養(yǎng)基上供給受刺激細(xì)胞L-(S-3H)脯氨酸，這些脯氨酸就會摻入到新合成的蛋白質(zhì)中。一段培養(yǎng)期之后，可以測定放射攝入的量，這就是測定OHC刺激效果的方法，OHC含有高刺激性能的中性可溶的成分，用藥劑量取決于3T3纖維組織母細(xì)胞和人類包皮纖維組織母細(xì)胞的蛋白合成。測定堿性磷酸酶的方法記載在GesellschaftFurKlinischeChemie所著“2.Klin化學(xué)與Klin生化”中，8卷(1970)，P658;9卷(1971)，P464，10卷(1972)P182.測定磷酸酶活性的目的主要是為了在試驗(yàn)各階段中控制其質(zhì)量。表Ⅰ總結(jié)了OHC組合物(從150次所需原料量所獲得)分析測定的結(jié)果。表Ⅰ器官感覺試驗(yàn)細(xì)微顆粒狀的帶有不明顯自然氣味的米灰色粉末鑒定鈣和磷酸酶的鑒定骨膠原的鑒定水含量＜7%灰的總量51.3-62.7%鈣19.2-23.6%磷8.9-10.9%骨膠原23.4-28.6%非骨膠原蛋白/肽7.2-10.8%痕量成分氟、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、銅、鎳的鑒定磷酸酶活性0.5-15mE/毫克非正常毒性無耐受力微生物總含量＜104/克酵母＜102/克腸細(xì)菌＜102/克比微生物種類無根據(jù)本發(fā)明，用下列方法步驟制備OHC先將官方獸醫(yī)檢查過的12個(gè)月齡的哺乳動物胎兒的骨頭剔下，然后將清潔過的骨頭迅速冷凍，溫度保持在-20℃--30℃;見圖1，第1格，在進(jìn)行下一步驟之前，先要檢查骨頭是否新鮮，有無變味和變色，并檢查骨頭是否清潔、符合要求。必要時(shí)還要檢查其形狀和大小以確證是家畜哺乳動物的骨胳。要去除任何殘存的肌肉、腱以及軟骨。如果對動物的鑒定吃不準(zhǔn)，也可以用常規(guī)免疫反應(yīng)進(jìn)行特殊鑒定，例如沉淀反應(yīng)。將骨頭置于一個(gè)碾碎機(jī)中，碾碎成最大限度為1厘米左右的顆粒(見圖1，第2格)。下一步將骨頭顆粒在20-80℃下減壓干燥，直到其殘存水分含量到達(dá)最大限度10%-25%之間(見圖1，第3a和3b格)。用酸，例如鹽酸，磷酸，醋酸，甲酸或檸檬酸調(diào)節(jié)骨料的PH值到5.0-5.5左右。然后用親水和親脂的溶劑對骨料進(jìn)行脫水和脫脂處理，直到殘存水分和脂肪的含量為5%左右，或者先用親水溶劑在20-80℃溫度下脫水至殘存水分含量的最大限度為5%左右，然后再用親脂溶劑在20-80℃溫度下脫脂至殘存脂肪含量的最大限度為5%左右。(見圖1，第4a和4b格)然后再將所得的脫水和脫脂的骨料在20-80℃溫度下減壓進(jìn)一步干燥，例如在一個(gè)旋渦流中，直到水的含量的最大限度是1%(見圖1，第5格)根據(jù)應(yīng)用的要求，將所得骨料在粉碎機(jī)中研磨至顆粒大小為50-300微米不等的粉末(見圖1，第6格)如果每克骨料中的微生物數(shù)目超過了10，000，應(yīng)該用常規(guī)方法進(jìn)行消毒，例如用環(huán)氧乙烷處理或用γ-射線照射(見圖1，第10-12格)。即可獲得適于制備藥劑用的OHC。(見圖1，第3格)本發(fā)明中的制備方法也可以采用另一種形式，將上述所說哺乳動物的骨頭在一個(gè)碾碎機(jī)中粉碎，直至顆粒形狀的最大限度為1厘米左右(見圖2第2格)。然后用酸調(diào)節(jié)骨粒的PH值到5.0-5.5。然后再用親水劑和親脂劑對骨粒進(jìn)行脫水和脫脂處理，直至殘余的水和脂的含量的最大限度為5%左右，或者先用脫水劑在20-80℃溫度下進(jìn)行脫水處理。直至殘余水量的最大限度為5%左右，然后再用脫脂劑在20-80℃溫度下進(jìn)行脫脂處理，直至殘余脂肪量的最大限度為5%左右。(見圖2，第3a和3b格)所得脫水和脫脂的骨料在20-80℃的溫度下減壓進(jìn)一步干燥，例如在一個(gè)旋渦流中，直至水分含量的最大限度為10%左右(見圖2，第4格)。必要的話，骨料可參照上述步驟繼續(xù)加工。(見圖2，第5格至第11格)?？色@得適于制備藥劑的OHC。本發(fā)明方法所使用的骨頭，較適合的是長骨，如肱骨、股骨、脛骨、橈骨、尺骨、掌骨或蹠骨，小牛的骨頭更為適用。很明顯，為了防止產(chǎn)品變性，有必要在每次操作中，當(dāng)濕度和脂肪含量降低后馬上降低干燥和脫脂的溫度，脫脂和干燥的溫度的最大限度是80℃。因此當(dāng)水和脂肪含量落下后，馬上降低溫度，并且操作時(shí)要非常迅速。進(jìn)行脫水和干燥時(shí)，壓力的最大限度為400毫巴左右。典型適用的親脂劑如丙酮，三氯乙烯，二氯甲烷、低沸點(diǎn)石油醚。典型適用的親水溶劑如丙酮、乙醇，以及異丙醇?？蓪⑺肙HC用常規(guī)方法制成口服藥劑，如顆粒劑、包膜片劑、膠囊、包衣藥丸、粉劑或混懸劑。每日劑量0.6～10克，每日2或3次，每次200～4000毫克。制備OHC顆粒劑OHC與填充劑，調(diào)味劑相混合，用水濕潤，制成顆粒并干燥。制備OHC包膜片劑將OHC制成顆粒并干燥，然后過篩。再與芳香劑、潤滑劑，崩解劑相混合，混合物放在模子里壓成片，用薄的顏色涂層包衣。制備OHC包衣藥丸先將OHC制成顆粒，干燥并過篩，然后加入制片劑的輔料，將藥丸核心成型，將核心分開，分別以白色涂料，著色、拋光。制備OHC粉劑將OHC制成有硬皮的細(xì)粒，加芳香劑并過篩。制備OHC混懸劑，將OHC與可增加粘稠度的輔劑一起混懸于糖蜜中，制成混懸劑，再著色和加入芳香劑，保存。圖1表示例1中制備OHC的方案圖2表示例2中制備OHC的方案圖3表示受OHC提取物刺激后3T3纖維組織母細(xì)胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情況，橫座標(biāo)以微升/毫升的形式表示OHC提取物在培養(yǎng)基中的濃度，縱座標(biāo)以每分鐘計(jì)數(shù)×104的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。小方塊表示9個(gè)測定數(shù)的平均值的偏差標(biāo)準(zhǔn)改正系數(shù)0.917。圖4表示當(dāng)受胎牛血清(……)和OHC成分(-)刺激時(shí)，3T3纖維組織母細(xì)胞吸收L-(5-3H)蛋白的情況。橫座標(biāo)以微升/毫升的形式表示試驗(yàn)樣品在培養(yǎng)基中的濃度?？v座標(biāo)以每分鐘計(jì)數(shù)×103的形式表示吸收L-(5-3H)脯氨酸的情況。圖5表示當(dāng)34/4劑量的OHC作用于牛的軟骨細(xì)胞時(shí)，其吸收3H胸腺嘧啶核甙的情況。橫座標(biāo)以微升/毫升的形式表示試驗(yàn)樣品在培養(yǎng)基中的濃度。縱座標(biāo)以每分鐘計(jì)數(shù)×104的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。圖6表示當(dāng)OHC濃度刺激時(shí)，骨膠原合成和軟骨細(xì)胞總蛋白在單層培養(yǎng)基中的情況。橫座標(biāo)表示每毫升培養(yǎng)基所用的分析蛋白活性的微克量。縱座標(biāo)表示新合成蛋白的微克量X-X，新合成的骨膠原微克量0-0。圖7表示一次劑量的OHC作用時(shí)，骨膠原在總蛋白中含量增加的百分比。圖8表示當(dāng)受照射的和未照射的OHC提取物刺激時(shí)，3T3纖維組織母細(xì)胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情況。受照射的OHC提取物的蛋白含量為690微克/毫升，未受照射的OHC提取物的蛋白含量為670微克/毫升。橫座標(biāo)以微升/25毫升的形式表示OHC提取物在培養(yǎng)基中的濃度?？v座標(biāo)以每分鐘計(jì)數(shù)的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。圖9表示當(dāng)lencoll，lenphos，lensol，聚集的lensol，OssPnlvit，mitsnbishiCookies，骨營養(yǎng)濃縮物，Conzocal，PMC和OHC刺激時(shí)，3T3纖維組織母細(xì)胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情況。橫座標(biāo)以微升/毫升的形式表示試驗(yàn)樣品在培養(yǎng)基中的濃度?？v座標(biāo)以每分鐘計(jì)數(shù)的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的攝入。在所查的這些細(xì)胞生物制劑中，只有OHC、PMC和lencoll具有活性。從每種調(diào)查物中各取出1克，用10毫升的磷酸緩沖生理鹽水萃取，離心出的上層清液部分用作試驗(yàn)。圖10表示用維生素D2、葡萄糖酸鈣、OHC治療后14個(gè)月，骨皮質(zhì)濃度百分比的變化。與維生素D2相比較，使用OHC時(shí)可增加療效11.6%。圖11表示用OHC和對照物治療病人兩年以上，放射性無機(jī)物含量BMC的平均數(shù)的變化，以克/厘米的形式表示。小格子表示偏差的標(biāo)準(zhǔn)。圖12表示用OHC和對照物治療病人，在兩年期間內(nèi)骨小粱的容積(TBV)和額嵴皮質(zhì)的濃度變化的平均值，小格子表示偏差的標(biāo)準(zhǔn)。圖13的縱線以每分鐘計(jì)數(shù)的形式來表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收，橫座標(biāo)表示所查樣品在培養(yǎng)基中的濃度，以微克/200毫升來表示。以下實(shí)例可對發(fā)明作更詳細(xì)地說明。例1OHC的制備(方法1)從約3個(gè)月齡的小牛身上剔下長骨(肱骨、股骨、脛骨、橈骨、尺骨、掌骨和蹠骨)，以此作為制備OHC的原料。先將官方獸醫(yī)檢查過的動物宰殺，剔下骨頭，然后將清潔過的骨頭迅速冷凍起來，溫度保持在-20℃--30℃，直至進(jìn)行下一步處理;(見圖1，第1格)。在進(jìn)行下一步處理之前，先檢查骨頭是否新鮮(由它們的氣味和顏色辨別)，是否清潔，并保證它們確實(shí)是所需要的骨頭。去除任何殘存的肉、筋腱和軟骨。第一步，先將1600公斤冷凍的骨頭放在帶有20毫米篩孔的不銹鋼碾碎機(jī)中。碎骨粒的大小約為1厘米左右。碾磨時(shí)，將骨頭的溫度保持在0℃以下，(見圖1，第2格)下一步，將磨碎的骨頭放在不銹鋼葉片干燥器中，在0.97-0.98巴壓力下進(jìn)行脫水處理，在干燥過程中，熱水的最初溫度是90℃，然后降到40℃很快就沒有更多熱水會進(jìn)入冷凝收集器(干燥開始后10小時(shí)左右)，停止加熱并在減壓下進(jìn)一步干燥骨頭，直至殘留水分含量的最大值為10%左右(見圖1，3a格)或10%-25%(圖1，3b格)，在以后的干燥過程中，骨頭的溫度不應(yīng)超過40℃。用檸檬酸調(diào)節(jié)干燥骨頭的PH值至5.0-5.5。再一次把干燥的骨頭放在20-80℃下進(jìn)行脫水處理，并去除類脂化合物，為此或者將丙酮做為脫水劑和脫脂劑，或者先用丙酮在20-80℃下對干燥的骨頭進(jìn)行脫水，再用三氯乙烯溶液在20-80℃溫度下脫脂。所得的骨頭，其中的水含量和脂肪含量的最大值為5%(見圖1，第4a和4b格)。在20-80℃的溫度下和90毫巴的壓力下，在一個(gè)旋渦流內(nèi)去除殘余溶劑。殘余溶劑的含量是1%左右(見圖1，第5格)將所得骨頭放在一個(gè)具有2×20mm長眼篩網(wǎng)的錘式研磨機(jī)內(nèi)研磨，并在一個(gè)過篩機(jī)上過篩，過篩機(jī)的上層篩網(wǎng)的篩眼規(guī)格為2.4毫米，下層篩網(wǎng)的篩眼規(guī)格為0.34毫米。棄去留在2.4毫米篩網(wǎng)上的骨料，再通過0.34毫米篩網(wǎng)過篩。再將其放入一個(gè)具有0.8毫米沖孔篩板插入的研磨機(jī)中研磨，并在一個(gè)具有0.74毫米規(guī)格篩眼的篩網(wǎng)和0.34毫米規(guī)格篩眼的篩網(wǎng)的過篩機(jī)上過篩。棄去留在0.74毫米篩網(wǎng)上的骨料，再將骨料通過0.34毫米的篩網(wǎng)過篩，收集骨料并再一次在一個(gè)具有0.8毫米沖孔篩板插入的研磨機(jī)中進(jìn)行研磨，再將其用上述方法過篩，最后收集粉末并用一個(gè)具有0.25毫米規(guī)格篩孔的篩網(wǎng)過篩，再將其置于一個(gè)具有0.5毫米沖孔篩板插入的研磨機(jī)上研磨。再將所有粉末通過一個(gè)具有0.25毫米規(guī)格篩眼的篩網(wǎng)進(jìn)行過篩(見圖1，第6格)。表二列出了所得OHC粉末的分析數(shù)值。表Ⅱ器官感覺試驗(yàn)細(xì)微顆粒狀的帶有不明顯自然氣味的米灰色粉末正常鑒定鈣和磷酸酶的鑒定正常骨膠原的鑒定正常水含量＜7%6.3%灰的總量51.3-62.7%56.2%鈣19.2-23.6%21.57%磷8.9-10.9%9.71%骨膠原23.4-28.6%26.4%非骨膠原蛋白/肽7.2-10.8%9.0%痕量成分氟、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、銅、鎳的鑒定正常磷酸酶活性0.5-15mE/毫克3.9me/毫克非正常毒性無耐受力正常微生物總含量＜104/克大約300酵母/霉菌＜102/克無腸細(xì)菌＜102/克無比微生物種類無無如果分析結(jié)果表明OHC組合物每克含有多于10，000的微生物，那么或者用環(huán)氧乙烷處理消毒或者用γ-射線照射(見圖1，第10-12格)可獲得適于制備藥劑的OHC。例2OHC的制備(方法2)用例1中的方法將骨頭粉碎成最大限度為1厘米左右的顆粒。然后用檸檬酸調(diào)節(jié)骨粒的PH值為5.0～5.5，并參照例1進(jìn)一步處理。表Ⅲ列出了OHC組合物的分析數(shù)據(jù)。表Ⅲ器官感覺試驗(yàn)細(xì)微顆粒狀的帶有不明顯自然氣味的米灰色粉末正常鑒定鈣和磷酸酶的鑒定正常骨膠原的鑒定正常水含量＜7%6.6%灰的總量51.3-62.7%56.07%鈣19.2-23.6%21.33%磷8.9-10.9%9.95%骨膠原23.4-28.6%26.2%非骨膠原蛋白/肽7.2-10.8%8.8%痕量成分氟、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、銅、鎳的鑒定正常磷酸酶活性0.5-15mE/毫克5.4mE/毫克非正常毒性無耐受力正常微生物總含量＜104/克大約10酵母/霉菌＜102/克無腸細(xì)菌＜102/克無比微生物種類無無例3受OHC刺激時(shí)3T3纖維組織母細(xì)胞對3H胸腺嘧啶核甙的吸收在DMEM(Dnlbeco′s改良的Eagles基，BoehningerMannheim)中培養(yǎng)瑞士小鼠的3T3纖維組織母細(xì)胞。用CO2首次調(diào)節(jié)PH值到6.6之后，進(jìn)行無菌消毒之前，給培養(yǎng)基補(bǔ)充100單位/毫升的青霉素，100毫克/毫升的鏈霉素(二者都出自BoehringerMannbeim)以及3.7克NaHCO3/升(Merck，Darmstadt)，另外再補(bǔ)充10%的小牛血清用于細(xì)胞培養(yǎng)。將此融合培養(yǎng)基放在90毫米的培養(yǎng)皿中于37℃的溫度5%的CO2壓力下生長，細(xì)胞每周進(jìn)行二次傳代培養(yǎng)，初始接種為每培養(yǎng)皿每10毫升培養(yǎng)基4×104細(xì)胞在下列的每個(gè)試驗(yàn)中，用的是3代至20代的傳代細(xì)胞。進(jìn)行3H胸腺嘧啶核甙吸收試驗(yàn)所使用的方法記載在L.JimenerdeAsua等所著“美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展“72卷(1975)2724～2728頁。瑞士鼠3T3成纖維細(xì)胞取自上述的培養(yǎng)基、用0.5%胰蛋白酶/0.02%EDTA對細(xì)胞進(jìn)行胰酶角，酶解液用無菌水配制。將細(xì)胞混懸于DMEM/10%胎牛血清中，濃度是4×104細(xì)胞/毫升。取1毫升細(xì)胞混懸液涂布在1.9平方厘米微量滴定盤上。細(xì)胞培養(yǎng)4天，不更換培養(yǎng)基，便形成了靜止期的非增殖細(xì)胞的融合單層。然后，吸出培養(yǎng)基，再加入1毫升無胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基和測試用的樣品。取1克如例1和例2中方法所制備的OHC混懸于10毫升除去鎂和鈣的磷酸緩沖鹽水(每升含0.2克氯化鉀，8克氯化鈉，2.7克磷酸氫鈉，12分子水，0.2克磷酸二氫鉀)中。于室溫振搖2小時(shí)之后，于2000×g離心樣品15分鐘。分離出2～500微升的含有中性可溶性O(shè)HC成分的上層清液，將其加入到上述的3T3纖維組織母細(xì)胞的培養(yǎng)基中。為了做空白測定試驗(yàn)，將同樣質(zhì)量的新鮮培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)基中，再加入2-200微升的胎牛血清做為對照。將分析所用的培養(yǎng)基最后置于37℃，5%CO2壓力下培養(yǎng)20小時(shí)，然后與3H胸腺嘧啶核甙混合。參照以下方法對細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記每1毫升的培養(yǎng)基里加入10微升的含1微居里(甲基-3H)胸腺嘧啶核甙(Amcrsham)和0.9微克的甲基胸腺嘧啶核甙(Sigma美國)和英國的無菌胸腺嘧啶水溶液。加入3H胸腺嘧啶核甙后，在上述的條件下再進(jìn)行4小時(shí)培養(yǎng)。然后用閃爍計(jì)數(shù)器測試樣品。先吸出培養(yǎng)基，再用0.5毫升的0.02%EDA/PBS溶液洗細(xì)胞層，然后再參考上述方法對細(xì)胞進(jìn)行胰酶解處理，直至細(xì)胞完全分離。將混懸的細(xì)胞放在一個(gè)裝置中進(jìn)行處理，裝置會將細(xì)胞自動地輸送到玻璃微纖維器(Whatman934-AH)中去，儀器工作程序如下1)用PBS洗2)用5%三氯醋酸(MerckDarmstadt)沉淀;3)乙醇固定，干燥玻璃微纖維濾器，并轉(zhuǎn)送至閃爍器瓶內(nèi)，加入3毫升的液體閃爍器cocktail液(7克PermablendPackard溶于1升1∶3比例的Tritenx-100/甲苯中，在一臺LK3-Wallac1217Rackbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器上測量樣品每分鐘蛻變的放射性。用OHC刺激所測定的最大值僅僅約為用胎牛血清刺激所測定的最大值的一半。然而，要記住胎牛血清含有的總蛋白相當(dāng)于OHC提取物所含有的6倍，這樣，用OHC提取物刺激時(shí)吸收了3H胸腺嘧啶核甙就要比起用胎牛血清時(shí)有效的多。用OHC所獲得的測定結(jié)果記錄在圖Ⅲ中。此套分析方法也可用于測定OHC組合物的質(zhì)量。當(dāng)把胎牛血清做為對照物時(shí)，這即可作為細(xì)胞生物學(xué)分析系統(tǒng)的內(nèi)部檢查，也可作為OHC樣品所得到的數(shù)值的一個(gè)參考，這樣就可以給OHC組合物的生物活性特征定義，并表示活性單位，以此作為OHC組合物的生物活性的標(biāo)準(zhǔn)。例4受OHC刺激時(shí)3T3纖維組織母細(xì)胞和人類包皮纖維組織母細(xì)胞對L-(5-3H)脯氨酸的吸收。采用例3中的方法測定培養(yǎng)細(xì)胞對脯氨酸吸收，但是，在已述的細(xì)胞培養(yǎng)方法中，將3H胸腺嘧啶核甙換成L-(5-3H)脯氨酸。這種測量方法可確定被培養(yǎng)細(xì)胞蛋白合成率，而且通過對細(xì)胞放射性的定量測定，可以確定OHC組分的生物學(xué)活性，圖4表明，受OHC刺激時(shí)，3T3纖維組織母細(xì)胞對L-(5-3H)脯氨酸的吸收。圖4表明OHC組合物實(shí)質(zhì)上在所查的細(xì)胞內(nèi)增加了蛋白合成率。例5OHC的中性可溶性成分對牛的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的作用用常規(guī)方法從胎牛的骺軟骨中分離軟骨細(xì)胞。將50，000個(gè)細(xì)胞分開生長4-6天，每個(gè)培養(yǎng)基內(nèi)1毫升的F12基質(zhì)，再補(bǔ)充10%的胎牛血清。參照例3的方法，所制成的培養(yǎng)基再用OHC組合物34/4處理，OHC組合物是根據(jù)例1或例2中的方法所獲得的，參考例3，用3H胸腺嘧啶核甙與細(xì)胞混攪然后測量其摻入的放射性。圖5表明了第一次試驗(yàn)的結(jié)果。圖表示牛軟骨細(xì)胞攝入3H-胸腺嘧啶核甙時(shí)OHC34/4的劑量特性曲線。從圖6和圖7看，很明顯，所查的OHC35/4刺激了總蛋白的合成以及骨膠原合成率。34/4和35/4表示每批處理的順序號碼。例6.中性可溶性的OHC成分對活體外骨細(xì)胞類群的作用。方法基本上采用Cohm等等(Simmons和Kann版)所著“骨胳”的研究，一種試驗(yàn)方法(學(xué)術(shù)出版社，紐約，舊金山，倫敦P3-20)除了使用0.05%透明質(zhì)酸酶作為一種附加酶和膠原酶，胰蛋白酶一起使細(xì)胞從骨組織中釋放出來以外，還可使用一種依賴于連續(xù)時(shí)間的酶的消化方法，從1天的Wister鼠顱蓋中分離出各種骨細(xì)胞群體。在20分鐘時(shí)間的消化過程中釋放出各種細(xì)胞群體，用羅馬數(shù)字按順序標(biāo)出這些細(xì)胞群體，即可得到個(gè)體的細(xì)胞部分。將最先從顱骨中釋放出的細(xì)胞群體稱為Ⅰ，將在1小時(shí)消耗過程內(nèi)最后釋放出的細(xì)胞部分稱為L，功能試驗(yàn)表明，群體Ⅰ至群體Ⅲ可能代表母源骨細(xì)胞池(類似于前成骨細(xì)胞)，細(xì)胞群體Ⅳ至Ⅵ表明具有類似成骨細(xì)胞的特征，或者也許就是類似骨細(xì)胞的細(xì)胞。取10毫升的1.5×105細(xì)胞/mlMEM基質(zhì)(帶有Earles鹽)的混懸液，再補(bǔ)充10%的胎牛血清，將其放于250毫升的組織培養(yǎng)瓶中，于37℃5%的CO2壓力下培養(yǎng)9～10天，可獲得聯(lián)合的細(xì)胞層，再將其與0.2%的胰蛋白酶一起制成混懸液，混懸液于400×g離心7分鐘，以獲得細(xì)胞，將所得到細(xì)胞小團(tuán)再懸浮于用20%胎牛血清和10%DMSO補(bǔ)充的MEM基質(zhì)中，在液氮中冰凍懸浮液直至下一步使用時(shí)。將單獨(dú)的冷凍細(xì)胞群體仔細(xì)地在37℃下培育并懸浮于40毫升的用20%胎牛血清補(bǔ)充的MEM中，將混懸液于400×g時(shí)離心7分鐘，再將所得細(xì)胞小團(tuán)懸浮于用10%胎牛血清補(bǔ)充的新鮮培養(yǎng)基中，并將其灌注入96眼微量滴定板，每眼有密度為7-10×103的細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞兩天，第三天用含有1%或2%胎牛血清的基質(zhì)替換培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，再用含1%或2%胎牛血清和0.5微居里3H胸腺嘧啶核甙以及不同濃度的中性可溶性O(shè)HC成分的新鮮基質(zhì)替換。將適量的PBS加入到對照培養(yǎng)基中。使用EDGF(表皮生長因子)是為了確定不同骨細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞分裂的實(shí)際反應(yīng)。將骨細(xì)胞培養(yǎng)物在上述條件下用含有3H胸腺嘧啶核甙的基質(zhì)培養(yǎng)24小時(shí)，然后參照例3方法測定3H胸腺嘧啶核甙的摻入量。試驗(yàn)結(jié)果列于表Ⅳ，其中每個(gè)數(shù)值是從五次試驗(yàn)中獲得的，并列出標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)，將溶解于PBS的OHC成份加到培養(yǎng)基質(zhì)中，OHC的量為5～50微升，培養(yǎng)基的總量為200微升。表Ⅳ骨細(xì)胞群體用中性可溶性O(shè)HC成分Ⅴ和Ⅹ刺激時(shí)，3H胸腺嘧啶核甙結(jié)合的百分比1%FCS＊2%FCS＊(每分鐘計(jì)數(shù)/眼±標(biāo)準(zhǔn)±偏差數(shù))P-Ⅰ對照(PBS)19022±1630(5)27656±841(5)OpV11070±1160(5)12394±195(5)OpX11800±508(5)12678±884(5)P-Ⅱ?qū)φ?9023±552(5)25103±344(5)OpV15440±491(5)14910±611(5)OpX13161±491(5)13425±940(5)P-Ⅲ對照12473±582(5)15159±588(5)OpV8179±433(5)10105±600(5)OpX6735±455(5)9676±436(5)P-Ⅳ對照16482±750(5)21006±711(5)OpV9445±481(5)11388±649(5)OpX6945±178(5)10356±539(5)P-Ⅴ對照18298±774(5)22677±176(5)OpV14380±746(5)16115±261(5)OpX14866±250(5)18330±296(5)P-Ⅵ對照25789±966(5)37205±2553(5)OpV23424±1026(5)28168±711(5)OpX23346±1239(5)32107±422(5)P-Ⅶ對照19405±827(5)26369±1236(5)OpV30189±1327(5)41293±1769(5)OpX37498±944(5)44817±728(5)P-L對照13378±396(5)18654±491(5)OpV18677±523(5)26816±1027(5)OpX28488±1241(5)33411±1220(5)＊FCS＝胎牛血清很明顯，從表Ⅳ可以看出，與用PBS處理過的對照培養(yǎng)物相比，中性可溶性的OHC成分刺激了骨細(xì)胞群體Ⅴ和Ⅵ的增殖。骨細(xì)胞群體Ⅰ和Ⅶ沒有任何反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果還寫在圖13的圖表中。例7表Ⅴ列出了試驗(yàn)結(jié)果，其中分析了中性可溶性O(shè)HC成分(OHCX)對于鼠皮膚纖維組織母細(xì)胞的作用。表Ⅴ3H-胸腺嘧啶核甙的結(jié)合(每分鐘計(jì)數(shù)/眼±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù))沒有FCS450±29+15μlPBS485±38+7.5μlOHCX343±18+15.0μlOHCX618±161%FCS917±85+15μlPBS921±33+7.5μlOHCX606±32+15.0μlOHCX643±33+30.0μlOHCX783±792%FCS1051±23+15μlPBS1127±51+7.5μlOHCX1059±38+15.0μlOHCX920±35+30.0μlOHCX1140±57不同濃度的OHCX對鼠纖維組織母細(xì)胞摻入3H胸腺嘧啶核甙的反應(yīng)。從表Ⅴ所到的結(jié)果可看出，OHCX不能刺激鼠皮膚纖維組織母細(xì)胞。如果將表Ⅳ所列的試驗(yàn)結(jié)果與表Ⅴ所列的試驗(yàn)結(jié)果相比較，很明顯，所觀察到的OHCX的促細(xì)胞分裂劑的活性只專一于成骨細(xì)胞。例8紫外線照射過的OHC的生物活性的測定用25千戈瑞(2.5兆拉德)的紫外線照射OHC，然后參照例3中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖8表示試驗(yàn)結(jié)果。用不同量的紫外線照射過的和未經(jīng)紫外線照射過的OHC的PBS抽提物刺激3T3纖維組織母細(xì)胞，3H胸腺嘧啶核甙摻入的結(jié)果列于圖8，從中可以看出紫外線照射并不影響OHC的生物活性。例9用于同一領(lǐng)域適應(yīng)癥的OHC和已知制劑的療效比較將每種要分析的物質(zhì)各稱出一克，放入一螺旋頂小瓶中，并加入10毫升的PBS，于室溫振搖2小時(shí)后，再用一臺MSE臺式離心機(jī)以每分鐘3600轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，濾出上清液，棄去沉淀。用Bradford[生化分析72(1976)248頁]所述的方法測定溶液的蛋白含量，參照例3的方法刺激3T3纖維組織母細(xì)胞對3H胸腺嘧啶核甙的攝入并對此作出評價(jià)。表Ⅵ列出了參加比較的制劑及它們可提取的蛋白含量。表Ⅵ提取蛋白的量/毫升溶液Lencoll330μgLenphos105μgLensol3850μgLensolagglomerated4200μgOsspulvit24μgMitsubishiCookies82μgPMC400μgOsteotrophicConcentrate骨營養(yǎng)濃縮劑22μgCanzocal28.5μgOHC600μg圖9總結(jié)了試驗(yàn)的結(jié)果。非活性物質(zhì)與空白沒有區(qū)別，因此沒有加以表述。從圖9中可看出，在刺激DNA合成方面，OHC明顯優(yōu)于其它的制劑。例10在動物試驗(yàn)中OHC對骨愈合的作用用60只成年兔子進(jìn)行研究以確定OHC對骨愈合的作用。在兔子股骨末端的雙膝關(guān)節(jié)骺部，用精確的方法制造軟骨或骨形狀大小相同的損傷。再將動物按隨機(jī)抽樣的方法分成4組，每組15只動物。未經(jīng)任何處理的一組為對照組。第一組每日給予830mg的OHC(178.0mg鈣)，第二組每日給予510mg灰末的OHC(沒有活性有機(jī)成份的骨礦物質(zhì)，178.9mg鈣)，第三組每日給予650mg的碳酸鈣。表Ⅶ詳述了試驗(yàn)設(shè)計(jì)。表Ⅶ試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)組分術(shù)后持試驗(yàn)動物每只動物每日劑量中續(xù)時(shí)間的數(shù)量日口服劑附加的鈣的的實(shí)驗(yàn)量量以毫克表示對照組355--565845OHC3551tablet845＠830mg178.0OHC3551tablet(已成灰的)565＠510mg178.9845CaCO3551tablet(Os-Cal)565＠650mg189.7845從造成損傷后的第七天至第23天，給動物標(biāo)上一系列的螢光記號。5，8，12個(gè)星期之后，分別處死5只動物。用螢光顯微鏡觀察動物組織的切片，切片取自同一標(biāo)準(zhǔn)的骨損傷限定的部位。通過螢光顯微鏡上的指針讀數(shù)來判定試驗(yàn)結(jié)果，指針讀數(shù)是根據(jù)螢光的密度、自然度和填補(bǔ)骨損傷的程度以及新骨生長的結(jié)構(gòu)而變化調(diào)節(jié)的。表Ⅷ列出了結(jié)果。TableⅧ取決于不同的處理和試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間的指針讀數(shù)總和的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差組分35days56days84days對照17.8±3.622.0±8.516.2±2.8OHC24.3±4.831.8±1.134.3±2.4OHC(已成灰的)24.4±4.228.2±4.125.0±12.8CaCO(Os-Cal)20.0±7.127.2±6.329.0±6.1用三種制劑處理的組與對照組相比，具有明顯改善的礦物化作用。在骨損傷的愈合方面，用OHC治療的組比其它兩組的療效還明顯。比較用OHC處理的和用灰末OHC處理的兩組試驗(yàn)結(jié)果，可以清楚看出，如果破壞了有機(jī)成份，那也就失去了OHC的有效作用。例11在動物試驗(yàn)中OHC對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的作用。在使用腎上腺類皮質(zhì)素造成骨損傷后，進(jìn)行一系列的兔子試驗(yàn)以觀察OHC對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的作用?？墒褂靡环N新的，能再現(xiàn)生物形態(tài)的測定法進(jìn)行定量測定。見M.Annefeld，“組織反應(yīng)雜志”Ⅶ卷(1958)，273～289頁。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，將鼠分成三組，每組5只公鼠第一組是對照組，不進(jìn)行任何處理。第二組肌肉注射地塞米松，第三組肌肉注射地塞米松再口服OHC。表Ⅸ是試驗(yàn)設(shè)計(jì)。表Ⅸ組分每只動物給予的藥物調(diào)查的持續(xù)時(shí)動物數(shù)目的劑量劑量的總數(shù)間以周表示對照--55地塞米松2×0.5mgi.m1055地塞米松/2×0.5mgi.m1055OHC5×50mgp.o2555i.m.＝肌肉地p.o.＝口服將用藥五周后的動物處死。從雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的股骨頭和徑骨頭切除下所有軟骨組織，進(jìn)一步制備成為電鏡觀察所用的切片。用形態(tài)測定法分析取自每只動物體的50個(gè)軟骨細(xì)胞。與對照組相比較，用地塞米松處理過的動物的內(nèi)胞漿網(wǎng)狀體長度和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的golgi組織的總面積都縮小了，而同時(shí)軟骨細(xì)胞的死亡率卻增加了。這些都證明了皮質(zhì)類固醇對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有損害。而另用OHC處理的動物，內(nèi)包漿網(wǎng)狀體長度和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的golgi組織總面積的縮小卻少得多。OHC降低了軟骨細(xì)胞的死亡率，甚至低于對照物死亡率水平。而地塞米松卻增加了細(xì)胞的死亡率。同時(shí)，OHC還增加了線粒體的總面積和線粒體的數(shù)目。這些發(fā)現(xiàn)都說明了一個(gè)事實(shí)口服OHC以后可增加軟骨細(xì)胞的代謝。表Ⅹ列出了試驗(yàn)結(jié)果。表Ⅹ試驗(yàn)持續(xù)5周之后，用形態(tài)測定法測定軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。對照物地塞米松地塞米松-OHC內(nèi)胞漿網(wǎng)狀體總長度，微米28.2121.6-23.6-golgi組織總面積(微米)2.5812.12-2.712線粒體數(shù)目13.1116.1120.42總面積(微米)1.28-1.3511.962細(xì)胞死亡率%2.174.001.25地塞米松和OHC的影響1＝對照物和試驗(yàn)組分之間統(tǒng)計(jì)數(shù)字有重大差別。2＝用地塞米松處理的組分和用地塞米松處理過再用OHC治療過的組分之間統(tǒng)計(jì)數(shù)字有重大差別。p＝0.01，n＝250每組從此試驗(yàn)中還可看出，用OHC在體外進(jìn)行細(xì)胞生物試驗(yàn)所得結(jié)果與在體內(nèi)的效力相等。結(jié)果還表明OHC保護(hù)了皮質(zhì)類固醇調(diào)節(jié)軟骨和成骨細(xì)胞的新陳代謝的作用。例12使用OHC以支持骨的愈合用雙盲法進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以觀察OHC與安慰劑對骨折愈合的影響。用隨機(jī)抽樣的方法給85例徑骨骨干骨折的病人服兩種藥中的一種，治療期是六周。表Ⅺ列出了病人的年齡和治療類型。表Ⅺ病人的數(shù)目安慰劑1’400mgOHC/d＞55歲1313＜55歲36234936根據(jù)以下參數(shù)測定徑骨干骨折的愈合。a)骨折位置不變b)無痛c)骨的折斷端固定d)折斷端的最大負(fù)載e)放射線透視的發(fā)現(xiàn)。較老年的病人，用OHC治療后約11周骨頭就堅(jiān)實(shí)了這說明比使用安慰劑的效果更迅速(14.2周，P＜0.05)。而較年青的病人的區(qū)別在于沒有有效統(tǒng)計(jì)數(shù)字(12.5周與11.5周相對)。試驗(yàn)結(jié)果很明顯，給予安慰劑時(shí)，骨折愈合手術(shù)中的并發(fā)癥數(shù)目要高三倍，因此OHC可促使骨折規(guī)律性地愈合。例13用OHC治療骨質(zhì)疏松在一個(gè)有對照物的試驗(yàn)中，調(diào)查OHC對腎上腺皮質(zhì)素所引起的骨質(zhì)疏松的作用。用隨機(jī)抽樣的方法將64名50歲以上的患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并接受皮質(zhì)類固醇治療的病人分成幾組，組1的病人在他們常規(guī)治療的基礎(chǔ)上再每日口服4.9克OHC，組2病人不服OHC。在治療末期，用OHC治療的組的病人骨干高度縮小程度以及橈骨骨質(zhì)密度減少程度比起對照組要低的多。另外的參數(shù)，例如用OHC治療的病人的尺骨骨質(zhì)密度和背部的疼痛比起對照組要大大改善了，但還未達(dá)到統(tǒng)計(jì)的有效數(shù)字。結(jié)果列于表ⅩⅡ。表ⅩⅡ用OHC治療一年之后骨質(zhì)稀少指數(shù)的差別對照物OHCP值骨干高度減少的平均1.16＝0.710.87＝0.580.01＜P＜0.05數(shù)厘米±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)橈骨骨質(zhì)密度減少的0.056＝0.0350.043＝0.029P＜0.05平均數(shù)B±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)尺骨骨質(zhì)密度減少的0.033＝0.0310.030＝0.026n.s平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)放射拍片查出的新的43n.s脊骨骨折的數(shù)目n.s＝?jīng)]有意義用OHC治療，可成功地免除因類固醇治療風(fēng)濕所引起的骨質(zhì)稀少病癥的發(fā)展。從實(shí)驗(yàn)中可明顯看出，用OHC治療應(yīng)該與用皮質(zhì)類固醇系統(tǒng)治療一起開始，不要等到已顯出骨質(zhì)稀少的臨床癥狀后再開始。例14OHC與鈣劑相比，對于骨質(zhì)疏松的治療。原發(fā)性肝硬化后期可出現(xiàn)迅速的骨損失的癥狀，進(jìn)行一項(xiàng)臨床試驗(yàn)以調(diào)查將維生素D、OHC以及葡萄糖酸鈣作為治療肝硬化藥物的一部分的情況。選擇65名患有原發(fā)性肝硬化并有骨質(zhì)疏松變化的已絕期的婦女，用非腸道途徑給予維生素D。再將這些病人在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上分成三組，第一組22名病人，僅用維生素D，第二組21名病人，除用維生素D外，每日再給予6.6克OHC。第三組22名病人，給予相當(dāng)于OHC用藥劑量的鈣劑，即每日4片葡萄糖酸鈣泡騰片。治療14個(gè)月后，用掌骨指數(shù)方法測定，發(fā)現(xiàn)非腸道透徑用維生素D不足以阻止骨質(zhì)喪失，而合并應(yīng)用維生素D和葡萄糖酸鈣也只能停止進(jìn)一步地骨質(zhì)喪失，唯有合并應(yīng)用維生素D和OHC時(shí)，與對照組相比，可以使骨皮質(zhì)增加11.6%。試驗(yàn)結(jié)果列于圖10。這些試驗(yàn)表明OHC不只是一種純的鈣劑。例15用OHC治療骨質(zhì)疏松將36名患有慢性活動性自體免疫肝類并用氫化潑尼松和硫唑嘌呤進(jìn)行治療一年以上的病人，按統(tǒng)計(jì)學(xué)要求分成兩組，給第一組的18個(gè)病人每日服6.6克OHC，治療期2年。另一組18個(gè)病人作為對照組不服OHC。用光電測密度術(shù)以及骨的活組織檢驗(yàn)的方法得到試驗(yàn)結(jié)果。兩年后，對照組的橈骨BMC礦物質(zhì)含量(“單一”光電測密度術(shù))以及額嵴CPT的皮質(zhì)厚度(骨的活組織檢查)都減少了(見圖11和圖12)。通過活組織檢驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)骨小梁容積(TBV)也明顯地縮小了(見圖12)。另一方面，經(jīng)過OHC治療的病例，橈骨的礦物質(zhì)含量保持不變，骨小梁的容積卻增加了，而皮質(zhì)厚度降低的程度較之對照組都要少得多。在兩年治療期內(nèi)，對照組中有3個(gè)病人脊椎變形了，而OHC組中卻沒有1人。5名病人的骨小梁容積(TBV)低于Mennier所要求的“脊椎斷裂限度”11%±3%，而用OHC治療過的4名病人中約有一例有脊椎斷裂的危險(xiǎn)性。而三例對照組的病人(TBV)16%都發(fā)生了脊椎變形，并伴隨有TBV水平下降低于11%。例16卵巢切除術(shù)后OHC的作用使用常規(guī)的骨特異性參數(shù)(堿性磷酸酶的骨特異性同功酶-成骨細(xì)胞標(biāo)記;尿中的羥基蛋白-破骨細(xì)胞標(biāo)記;“抵抗酒石酸”酸性磷酸酶-破骨細(xì)胞標(biāo)記)來表示卵巢切除術(shù)后，一方面血清中酶的水平急劇上升(骨的更新代謝高而且強(qiáng))。另一方面，每日給予病人7.5克的OHC，治療9個(gè)月，使骨的新陳代謝水平增加趨于正?；瑥亩档土瞬∪宋ｋU(xiǎn)性。與生化試驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的情況相同，服用OHC時(shí)骨增生，這可通過掌骨指數(shù)驗(yàn)證。用OHC治療前測得骨皮質(zhì)每年損失1.1±0.6%，用OHC治療可使骨增生，一個(gè)統(tǒng)計(jì)意義上的增生值是每年0.2±0.3%。例17用計(jì)算機(jī)斷層X線攝影測定OHC對骨質(zhì)疏松的作用。選擇11例骨質(zhì)疏松病人(2男，9女)，每日服75克OHC治療兩年，再用計(jì)算機(jī)定量斷層X線攝影進(jìn)行檢查。參見P.Ruegsegger等等所著，“計(jì)算機(jī)輔助斷層X線攝影術(shù)雜志”，5(1981)，384～390頁。根據(jù)病人的年齡結(jié)構(gòu)，預(yù)期海綿體密度每年平均損失2.7%。用OHC治療的所有病人實(shí)際上骨質(zhì)海綿體增加量很小。據(jù)觀察，這種增加還僅僅發(fā)生于另外用氟化鈉治療的病人中，而且這種增加作用也是不規(guī)則和不持久的，而且只在某些病中發(fā)現(xiàn)(反應(yīng)者)。最近的結(jié)果(見M.A.Dambacher等等所著“骨骼”7，199-205，1986)表明骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)療法(氟化鈉或合并應(yīng)用氟化鈉和鈣劑)并不能夠阻止疾病的發(fā)展(不能完全抑制骨質(zhì)喪失，脊斷裂率增加)。迄今為止，還從未看到未經(jīng)治療的病人有自動增加骨小梁容積的趨向。權(quán)利要求1.一種骨膠原羥基磷灰石化合物(OHC)的特征在于以下干燥物質(zhì)的分析參數(shù)--------------------------------------------------------器官感覺的試驗(yàn)細(xì)微顆粒狀，帶有不明顯自然自味鑒定的米灰色粉末。-鈣和磷酸酶的鑒定-骨膠原的鑒定水的含量＜7%總灰51.3-62.7%鈣19.2-23.6%磷8.9-10.9%骨膠原23.4-28.6%非骨膠原性蛋白/肽7.2-10.8%痕量成份氟、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、銅、鎳的鑒定磷酸酶活性0.5-15mE/毫克非正常毒性無耐受力微生物總含量＜104/克酵母＜102/克腸細(xì)菌＜102/克比微生物種類沒有以及其特征在于以下生物活性a)刺激成骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的DNA合成；b)刺激軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的蛋白合成；c)與刺激總蛋白的合成相比較，選擇性地刺激了軟骨細(xì)胞的骨膠原總蛋白的合成；d)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中的蛋白X和蛋白Y的合成；e)促進(jìn)非特異性間葉細(xì)胞對軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化。2.制備權(quán)利要求1中所述的骨膠原羥基磷灰石化合物的方法，其中a)將約12個(gè)月齡的哺乳動物胎兒的動物骨頭碾碎成最大1厘米左右尺寸的顆粒;b)于20～80℃的溫度下減壓干燥骨顆粒，直至殘存水含量約10%或10%～25%;c)用酸調(diào)節(jié)骨料的pH值到pH5.0～pH5.5;d)用親水劑和親脂劑進(jìn)行脫水和脫脂，直到殘存的水含量和脂含量最大值為5%，或者光用親水劑于20℃～80℃下進(jìn)行脫水直到殘余水含量最大值約為5%。然后再用親脂劑于20～80℃下進(jìn)行脫脂，直到殘存脂肪含量最大值約為5%;e)于20℃～80℃溫度下減壓干燥已脫水和脫脂的骨料，直到溶劑的最大含量約為1%;f)將骨料粉碎成50～300微米大小的顆粒，然后消毒。3.制備權(quán)利要求1中所述骨膠原羥基磷灰石化合物的方法，其中a)將約12個(gè)月齡的哺乳動物胎兒的動物骨頭碾碎成最大約為1厘米左右大小的顆粒;b)用酸調(diào)節(jié)骨顆粒的pH值為5.0～5.5;c)用親水劑和親脂劑進(jìn)行脫水和脫脂，直到殘有的水含量和脂含量最大值約為5%，或者先用親水劑于20℃～80℃下進(jìn)行脫水，直到殘存水含量的最大值約為5%，然后再用親脂劑于20℃～80℃下進(jìn)行脫脂，直到殘存脂肪含量最大值約為5%;d)于20℃～80℃下減壓干燥已脫水和脫脂的骨料，直到溶劑的最大含量約為1%;e)將骨料粉碎成50～300微米大小的顆粒，然后消毒。4.權(quán)利要求2或3中所述的方法，其中使用的骨頭為長骨。5.權(quán)利要求2或3中所述的方法，其中使用的骨頭為牛小腿的長骨。6.應(yīng)用權(quán)利要求1中所述的骨膠原羥基磷灰石化合物去制備一種藥劑。7.使用權(quán)利要求1中所述的骨膠原羥基磷灰石化合物以預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，并使骨折，軟骨缺損愈合。8.一種口服藥劑，含有權(quán)利要求1中所述的骨膠原羥基磷灰石化合物和任意的輔料以及添加劑。9.預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松的方法以及使骨折，軟骨缺損和成骨缺損愈合的方法，其中的病人所需要的治療是給予病人一定有效量的權(quán)利要求1中所述的骨膠原羥基磷灰石化合物。專利摘要一種刺激軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的組合物，從約12個(gè)月齡的哺乳動物胎兒的骨胳中提取此組合物的方法，以及其制劑。本藥劑可用于預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松，并可用于治愈骨折，軟骨缺損及骨缺損。文檔編號C07G99/00GK87102744SQ87102744公開日1988年2月17日申請日期1987年4月14日發(fā)明者特亞羅森貝格申請人:羅巴法姆股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan