專利名稱：用于預(yù)防新血管生成及治療人類(lèi)惡性腫瘤的含喹唑啉酮的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含喹唑啉酮的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及緩減血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和管的形成并由此緩減與血管生成有關(guān)的疾病，以及治療人類(lèi)惡性腫瘤，即，抑制最初的腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的組合物，其中包括本申請(qǐng)定義的作為活性組分的喹唑啉酮衍生物。
1967年公開(kāi)的美國(guó)專利3,320,124描述并要求保護(hù)一種用喹唑啉酮衍生物治療球蟲(chóng)病的方法。鹵夫酮，即7-溴-6-氯-3-〔3-(3-羥基-2-哌啶基)-2-氧代丙基〕-4(3H)-喹唑啉酮，首先由美國(guó)氰胺公司(American Cyanamid Company)在該專利中描述并要求保護(hù)，它是該專利認(rèn)定的優(yōu)選化合物并且是該專利描述并要求保護(hù)的衍生物中已商品化的一個(gè)。
隨后的美國(guó)重新公開(kāi)的專利26,833和美國(guó)專利4,824,847；4,855,299；4,861,758和5,215,993都涉及到鹵夫酮的抗球蟲(chóng)病性質(zhì)。美國(guó)專利4,340,596提示鹵夫酮也可用于治療泰累爾氏梨漿蟲(chóng)病。
1991年，一位本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)表論文報(bào)道以用作抑制球蟲(chóng)劑的推薦量使用鹵夫酮時(shí)，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白合成降低并認(rèn)為是皮膚損傷中的重要誘因，而且被治療的家禽皮膚強(qiáng)度降低。并且發(fā)現(xiàn)鹵夫酮在細(xì)胞水平上通過(guò)鳥(niǎo)皮膚成纖維細(xì)胞抑制膠原蛋白的合成〔I.Granot，等，Poult.Sci.，Vol.70，pp.1559-1563(1991)〕。
但是，那時(shí)沒(méi)有人公開(kāi)，認(rèn)識(shí)到或推測(cè)到美國(guó)專利No.3,320,124公開(kāi)的鹵夫酮或有關(guān)的喹唑啉酮衍生物可有效地用于纖維化病的治療以及用于再狹窄，腎小球硬化，和血管生成所決定的疾病的治療。
與初級(jí)或次級(jí)纖維化有關(guān)的臨床癥狀或疾病，如系統(tǒng)性硬化癥，移植-對(duì)抗-宿主疾病(GVHD)，肺與肝的纖維化以及各種自身免疫疾病的特征是過(guò)量產(chǎn)生結(jié)締組織，這可導(dǎo)致正常組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞。這些疾病最好在細(xì)胞功能紊亂期被診斷，其主要表現(xiàn)為膠原蛋白過(guò)量沉積。
一般的觀點(diǎn)是，由于無(wú)法阻止其病理過(guò)程，現(xiàn)在大部分對(duì)纖維化疾病的治療是無(wú)效的，效果很差的。為了降低細(xì)胞外間隙膠原蛋白沉淀，現(xiàn)已作過(guò)各種嘗試?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行性纖維化增生疾病顯示結(jié)締組織的過(guò)量產(chǎn)生?，F(xiàn)已嘗試開(kāi)發(fā)藥物抑制在纖維化中起重要作用的膠原蛋白的聚集〔K.I.Kivirikk，Annals of Medicine(醫(yī)學(xué)年鑒)，Vol.25.pp.113-126(1993)〕。
這樣的藥物可通過(guò)調(diào)節(jié)前膠原多肽鏈的合成，或抑制某些特定的轉(zhuǎn)譯后過(guò)程而起作用，這既可減少細(xì)胞外膠原蛋白纖維形成也可減少變性纖維的聚集。盡管這種蛋白在維持組織完整性中很重要并且它牽連到各種疾病，但僅可獲得很少的膠原蛋白合成抑制劑。
細(xì)胞毒性藥物已被用于緩減膠原蛋白產(chǎn)生成纖維細(xì)胞增生〔J.A.Casas，等，Ann.Rhem.Dis.，Vol.46，p.763(1987)〕其中秋水仙堿可緩減膠原蛋白分泌物進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)〔D.Kershenobich，等，N.Engl.J.Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志)Vol.318，p.1709(1988)，為重要膠原蛋白代謝酶的抑制劑〔K.Karvonen，等，J.Biol.Chem.，(生化雜志)Vol.265，p.8414(1990)；C.J.Cunliffe，等，J.Med.Chem，(醫(yī)用化學(xué)雜志)Vol.35，p2652(1992)〕。
不幸的是，這些抑制劑中沒(méi)有一種是對(duì)膠原蛋白類(lèi)特異的。而且，它可嚴(yán)重干擾其他重要的膠原蛋白分子如傳統(tǒng)的補(bǔ)體途徑中的膠原蛋白、神經(jīng)肌肉連接終板乙酰膽堿酯酶、膠固素和肺表面活性劑脫輔蛋白質(zhì)的生物合成，帶來(lái)毒性后果。
其他可抑制膠原蛋白合成的藥物，如硝苯吡啶和苯妥英，也擬制其他蛋白的合成，因此非特異性地阻斷了膠原蛋白生物合成的途徑〔TSalo，等，J.Oral Pathol.Med..Vol.19，p.404(1990)〕。
膠原蛋白交聯(lián)抑制劑，如β-氨基-丙腈，也是非特異性的，盡管它們可被用作抗纖維化劑。長(zhǎng)期使用這類(lèi)藥物可導(dǎo)致lathritic綜合癥并干擾彈性蛋白基因(elastogenesis)，因?yàn)閺椥缘鞍?，另一種纖維性結(jié)締組織蛋白，也是交聯(lián)的。另外，膠原蛋白交聯(lián)抑制劑的作用是次級(jí)的，膠原蛋白的過(guò)量產(chǎn)生必先于其被膠原蛋白酶分解。
最近我們提交的序號(hào)為08/181,066的美國(guó)專利申請(qǐng)描述并要求保護(hù)一種治療人類(lèi)患者纖維化疾病、再狹窄和腎小球硬化癥的方法，其中包括對(duì)該患者使用含藥物有效量的可有效抑制I型膠原蛋白合成的式I藥物活性化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)后，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鹵夫酮可用于緩減新血管生成，以及治療人惡性腫瘤。因此可以相信，美國(guó)專利3,320,124描述和要求保護(hù)的其他喹唑啉酮也具有相似的性質(zhì)，該文獻(xiàn)作為參考收編于此。
因此，根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在提供一種用于緩減新血管生成及治療人類(lèi)惡性腫瘤的組合物，其中包括與藥學(xué)上可接受的載體混合的，作為活性組分的，藥物有效量的式I化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
本發(fā)明還提供了一種治療人類(lèi)患者長(zhǎng)期血管生成的方法，其中包括對(duì)該患者使用藥物有效量的可有效緩減新血管生成的式I化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
本發(fā)明還提供了一種治療人類(lèi)患者惡性腫瘤的方法，其中包括對(duì)該患者使用藥物有效量的可有效抑制人惡性腫瘤細(xì)胞增生的式I化合物。
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
根據(jù)本發(fā)明，也提供了式I化合物在制備具有如本申請(qǐng)所述的緩減新血管生成活性的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了式I化合物在制備具有如本申請(qǐng)所述的抗人腫瘤細(xì)胞增生作用的藥物中的用途。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，該化合物為鹵夫酮。
在序號(hào)為08/181,066的美國(guó)專利申請(qǐng)中，清楚地顯示和說(shuō)明了本發(fā)明化合物可有效地治療纖維化疾病如硬皮病和GVHD，以及再狹窄和腎小球硬化癥。該申請(qǐng)排除了任何無(wú)根據(jù)的推測(cè)，如化合物在作用產(chǎn)生前可能是無(wú)活性的；化合物可能未到達(dá)靶區(qū)域，或者其他機(jī)能性質(zhì)可能使化合物不適用于體內(nèi)。而且，通過(guò)同一化合物在與過(guò)量膠原蛋白沉積有關(guān)的兩種特定的纖維化疾病，即，硬皮病和GVHD，以及再狹窄和腎小球硬化癥的治療中的確鑿事實(shí)可完全反駁那些可能性。因此，將上述美國(guó)專利申請(qǐng)作為參考文獻(xiàn)收編于此。
按照本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中毛細(xì)血管按一定的順序生長(zhǎng)〔J.Folkman和M.Klagsbrun，“血管生成的因素”，Science(科學(xué))，Vol.235 pp.442-447(1987)；J.Folkman和Y.Shing，“血管生成”，J.Biol.Chem.，(生化雜志)，Vol.267 pp.10931-10934(1992)〕。當(dāng)新的毛細(xì)血管新芽從小靜脈旁生長(zhǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞剝蝕基底膜，遷移至血管生成處，增生，形成一個(gè)腔，兩個(gè)新芽的頂端連接，產(chǎn)生一個(gè)毛細(xì)血管環(huán)，并產(chǎn)生了新的基底膜〔J.Folkman，“弄清血管生成的原因探索與發(fā)現(xiàn)”，Perspectives in Biology and Medicine，(生物學(xué)與醫(yī)學(xué)透視)，Vol.29，pp.1-36(1985)〕。
ECM(內(nèi)皮細(xì)胞膜)的剝蝕和重建是血管生成的基本過(guò)程。另外，由內(nèi)皮細(xì)胞合成的ECM組分(即，膠原蛋白，層粘連蛋白，血小板反應(yīng)蛋白，纖連蛋白和SPARC)具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和成形的功能〔J.Bischoff“Approaches to Stutying Cell Adhesion Molecules inAngiogenesis”，(血管生成中細(xì)胞粘合分子的研究)，Trends Cell Biol.(細(xì)胞生物學(xué)動(dòng)向)，No.5，pp.69-74(1995)〕。現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAE)在出芽和形成血管中合成I型膠原蛋白和SPARC?，F(xiàn)在提出I型膠原蛋白可參與直接遷移和BAE細(xì)胞裝配〔M.L.Jruela-Arispe，等，Lab，Invest No.64，pp.174-186(1991)〕。并已發(fā)現(xiàn)外源的I型膠原蛋白通過(guò)融合人類(lèi)皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞而加速血管的形成〔C.I.Jackdon和K.L.Jenkins，Exp Cell Res.，No.192，pp.319-232(1991)〕。血管的腔內(nèi)含膠原纖維，說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞使用原纖維折迭并排列成血管結(jié)構(gòu)。
由于大范圍的血管生成是與胚胎發(fā)育相伴的，因此健康成人中現(xiàn)有血管的出芽和再生的非凡能力已大部退化〔J.Folkman and Y.Shing，ibid.(1992)〕。
病理?xiàng)l件下，正常的限制血管生成的控制機(jī)制被破壞，血管無(wú)控制地生成。結(jié)果是，過(guò)量的血管生成產(chǎn)了一些所謂“血管生成病” 〔J.Folkman，“癌癥，血管病，類(lèi)風(fēng)濕病和其他疾病中的血管生成”，NatureMedcine，(天然藥物)，Vol.1，pp.27-31(1995)〕。一些血管生成疾病，包括血管過(guò)量向視網(wǎng)膜內(nèi)生長(zhǎng)的視網(wǎng)膜病，導(dǎo)致視覺(jué)障礙甚至失明〔J.Folkman.ibid.(1995)〕。
但是，不正常的血管生成起重要作用的破壞性最強(qiáng)的疾病是實(shí)體瘤的發(fā)展和蔓延。眾所周知，一旦腫瘤已經(jīng)出現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞數(shù)的任何增加前一定都有新的毛細(xì)血管的增加，這些毛細(xì)血管集中在腫瘤上并向腫瘤細(xì)胞提供氧和營(yíng)養(yǎng)〔J.Folkman.ibid(1985)；J.Folkman，“What Isthe Evidence that Tumors Are Angiogenesis Dependent？”(腫瘤依賴于血管生成的證據(jù))，J.Natl.Cancer Inst.，Vol.82，pp.4-6(1989)；N.Weidner，等，“Tumor Angiogeuesis Correlates with Metastasis inInvasive Prostate Carcinoma”(侵入性前列腺癌中腫瘤血管生成與遷移的關(guān)系)Amer.J.Pathol.，Vol 143，pp.401-409(1993)〕。因此，只要伴隨的血管生成過(guò)程的活化被防止，腫瘤可以保持無(wú)害并固定于它們的原來(lái)的組織中。
由于由各種原因引起的實(shí)體腫瘤在其腫瘤生長(zhǎng)中均有與血管生成有關(guān)的步驟，因此抑制與腫瘤有關(guān)的血管生成最有可能克服癌癥〔M.S.O′Reilly，等，“A Novel Angiogenesis Inhibitor that Mediates theSuppression of Metastases by a Lewis Lung Carcinoma，”(介導(dǎo)路易斯肺惡性腫瘤擴(kuò)散抑制的新的血管生成抑制劑)，Cell，Vol.79，pp.316-325(1994)〕。
具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這樣的假設(shè)腫瘤血管生成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)〔J.Folkman，ibid.(1989)；N.Weidner，等，ibid(1993)；M.S.O′Reilly，等，ibid(1994)；N.Weidner，等“Tumor Angiogenesis andMetastasis-Correlation in Invasive Breast Carcinoma，”(侵入性乳腺癌中腫瘤血管生成和擴(kuò)散的關(guān)系)，N.Eng.J.Med.，Vol.324，pp.1-8(1991)〕。實(shí)際上，在新血管生成發(fā)生之前在臨床上大多數(shù)實(shí)體腫瘤都不能診斷，新血管的生成在實(shí)體腫瘤中的誘導(dǎo)是由一個(gè)或多個(gè)血管生成因子傳遞的〔J.Folkman，ibid(1987)；J.Folkman and Y.Shing，ibid.(1992)〕.另外，抑制血管增生和進(jìn)入指定器官的能力具有治療其他疾病的可能性，這是醫(yī)學(xué)的首要問(wèn)題。
長(zhǎng)期的血管生成可見(jiàn)于各種病理狀態(tài)，如關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，糖尿病性視網(wǎng)膜炎，慢性炎癥，硬皮病，血管病，晶狀體后纖維組織形成和血友病關(guān)節(jié)中非正常毛細(xì)血管增生，延長(zhǎng)的月經(jīng)和失血，以及其他女性生殖系統(tǒng)的疾病〔J.Folkman，ibid(1995)；J W.Miller，等“VascularEndothelial Growth Factor/ Vascular Permeability Factor IsTemporarily and Partially Correlated With Ocular Angiogenesis in aPrimate Model”(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/血管滲透因子在靈長(zhǎng)目模型的眼血管生成中臨時(shí)的和部分的聯(lián)系)，J.Pathol.Vol.145，pp.574-584(1994)；A.P.Adamis，等，“Increased Vascular Endothelial Growth FactorLevels in the Vitreous of Eyes with Proliferative DiabeticRetinopathy”(具有增生性糖尿病視網(wǎng)膜炎的眼玻璃體中升高的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平)Amer.J.Ophthal.，Vol.118，pp.445-450(1994)；K.Takahashi，等，“Cellular Markers that Distinguish the Phases ofHemangioma during Infancy and Childhood，”(區(qū)別嬰兒期和兒童期血管瘤期的細(xì)胞標(biāo)志)J.Clin，Invest.，Vol.93，pp.2357-2364(1994)；D.J.Peacock，等，“Angiogenesis Inhibition Suppresses CollagenArthritis，”(抑制膠原蛋白關(guān)節(jié)炎的血管生成抑制)，J.Exp.Med.Vol.175，pp.1135-1138(1992)；B.J.Nickoloff，等，“AberrantProduction of Interlenkin-8 and Thrombospondin-1 by PsoriaticKeratinocytes Mediates Angiogenesis，”Amer J.Pathol.，Vol.44.pp.820-828(1994)；J.Folkman，“Angiogenesis in Female ReproductiveOrgans”(女性生殖器官的血管生成)，inSteroid Hormones andUterine Bleeding，N.J.Alexander and C.d′Arcangues，Eds，AmericanAssociation for the Adrancement of Science Press，Washington，D.C.U.S.A.，pp.144-158(1992)〕。
在許多上述異?，F(xiàn)象中，無(wú)限制的新的毛細(xì)血管的生長(zhǎng)本身就是疾病的過(guò)程。例如，在關(guān)節(jié)炎中，新毛細(xì)血管可侵入并破壞關(guān)節(jié)軟骨。在糖尿病中，眼中新的毛細(xì)血管出血并導(dǎo)致失明。某些發(fā)展中的疾病，如腸閉鎖、血管畸形，和單側(cè)筋膜萎縮，也可由不正常的血管生成產(chǎn)生〔J.Folkman，ibid.(1995)〕。
正在研究幾種血管生成抑制劑；其中包括血小板因子4，煙曲霉素衍生物AGH 1470，干擾素α29， 血小板反應(yīng)蛋白，血管抑制類(lèi)固醇(angiostatic steroids)，和血管抑制素(angiostatin)〔J.Folkman，ibid.(1995)；M.S.O′Reilly等，ibid.(1994)；V.Castle，等，“Antisence-Mediated Reduction in Thormbospondin Reverses the MalignantPheotype of a Human Squamous Carcinoma，”J.Clin.Invest.，Vol.87，pp.1883-1888；D.Ingber等“Synthetic Analogues of Fumagillin thatInhibit Angiogenesis and Suppress Tumor Growth，”(抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的煙曲霉素的合成類(lèi)似物)Nature(自然)，Vol.348，pp.555-557〕。
盡管為了更充分地理解和正確評(píng)價(jià)本發(fā)明，下面將以與某些優(yōu)選方案有關(guān)的附圖和實(shí)施例描述本發(fā)明，但是我們并不打算將本發(fā)明限制在這些特定的優(yōu)選方案中。相反，本發(fā)明應(yīng)覆蓋如所附的權(quán)利要求書(shū)中限定的包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有選擇，修改和等同情況。因此，下列包括優(yōu)選方案的附圖和實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施，顯然，以實(shí)施例的方式顯示的特例僅為了說(shuō)明和討論本發(fā)明的優(yōu)選方案，提供它們的原因是使大家最實(shí)用地、最容易地理解本發(fā)明對(duì)制劑過(guò)程以及原則和概念的描述。
用下面的附圖描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中

圖1A和1B表示劑量反應(yīng)曲線，顯示鹵夫酮對(duì)無(wú)(圖1A)或有(圖1B)1 ng/ml基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下，對(duì)混入存在于培養(yǎng)物中的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的3H-胸苷的作用。
圖2A表示呈毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的組織。單層細(xì)胞上覆蓋了膠原蛋白凝膠并暴露于1ng/ml b FGF加1ug/ml肝素中。培養(yǎng)基中存在2天后拍攝對(duì)照顯微照片。該細(xì)胞組織再生為毛細(xì)血管樣血管的分支及交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
圖2B顯示用0.1μg/ml鹵夫酮培養(yǎng)后圖2A的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物。這些細(xì)胞保持非重迭，單層排列，未形成典型的分支及交織毛細(xì)血管樣管。
圖3A表示從植入I型膠原蛋白凝膠的從鼠主動(dòng)脈環(huán)分支的新形成的(10天)微血管，引起環(huán)和結(jié)網(wǎng)的增長(zhǎng)。
圖3B顯示用0.1μg/ml鹵夫酮培養(yǎng)后的圖3A的鼠主動(dòng)脈環(huán)，培養(yǎng)液隔天置換。單細(xì)胞從主動(dòng)脈環(huán)向外周遷移，但未排列成微血管。
圖4為使用植入圖3測(cè)定的兔主動(dòng)脈環(huán)的I型膠原蛋白的，顯示與鹵夫酮對(duì)微血管形成抑制效果有關(guān)的時(shí)間與劑量的曲線圖。
圖5為顯示第2天(1)或第6天(2)時(shí)除去鹵夫酮導(dǎo)致微血管形成(在第14天評(píng)估)的特征條形圖，它與未處理過(guò)的主動(dòng)脈環(huán)(未處理)相似。經(jīng)14天的培養(yǎng)期后，鹵夫酮對(duì)微血管的形成出現(xiàn)完全的抑制。
圖6為表示鹵夫酮對(duì)硫酸鹽混入內(nèi)皮下的ECM的作用的特征曲線。將牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞以融合細(xì)胞密度接種并暴露于存在Na2〔35S〕O4的lug/ml鹵夫酮中(□)。對(duì)照細(xì)胞(■)保持無(wú)鹵夫酮。在不同的時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞層溶解，暴露其下面的ECM，用胰蛋白酶消化，并將溶解了的物質(zhì)在β-閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。
圖7A為顯示鹵夫酮對(duì)混入自動(dòng)生長(zhǎng)的，亞融合的，人平滑肌肉瘤細(xì)胞的3H-胸苷的作用的特征曲線。
圖7B比較了有無(wú)10ng/ml鹵夫酮時(shí)10％FCS(■)或10ng/mlHB-EGF(
)對(duì)刺激平滑肌肉瘤細(xì)胞增生的抑制。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞如前所述(D.Gospodarowicz，等，“Clonal Growth of BovineEndothelial CellsFibroblast Growth Factor as a Survival Agent”(牛血管內(nèi)皮細(xì)胞的無(wú)性生長(zhǎng)作為存活劑的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Vol.73，p.4120(1979)]，由牛主動(dòng)脈制備血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物。37℃下在該培養(yǎng)物貯存在10％ CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)器中的用10％小牛血清，50U/ml青霉素，和50μg/ml鏈霉素補(bǔ)充的DMEM(每升1g葡萄糖)中。細(xì)胞自動(dòng)生長(zhǎng)期隔天加入特別純化的腦衍生的bFGF(100ng/ml)[D.Gospodarowicz，等，ibid．(1979)；I．Vlodavsky，等，“Vascular Endothelial Cells Maintained in the Absenceof Fibroblast Growth Factor Undergo Structural and FunctionalAlterations that Are Incompatible with Their in Vivo DifferentiatedProperties，”J.Cell Bio.Vol.83，pp.468-486(1979)〕。細(xì)胞增生混入3H-胸苷將牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞點(diǎn)于(4×104細(xì)胞/16mm孔)用10％小牛血清補(bǔ)充的DMEM中。接種后四天，在有或無(wú)1ng/ml bFGF存在下，將該細(xì)胞暴露于增加濃度的鹵夫酮(100-500ng/ml)。過(guò)48小時(shí)，加入3H-胸苷(1μCi/孔)，通過(guò)測(cè)量混入三氯乙酸不溶物的放射性測(cè)定DNA合成〔M.Benezra，等，“Reversal of bFGF Autocrine CeldTransformation by Aromatic Anionic Compounds，”Cancer Res.，Vol.52，pp.5656-5662(1992)；I.Voldavsky，等，“Endothelial Cell-DerivedBasic Fibrobolast FactorSynthesis and Deposition intoSubendothelial Extracellular Matrix，”P(pán)roc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Vol.84，pp.2292-2296(1987)〕。通過(guò)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的ECM沉積用小牛眼睛制備牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物并按前述保存〔D.Gospodarowicz，等，“Stimulation of Corneal Endothelial CellProliferation in Vitro by Fibroblast and Epidermal Growth Factors，”Exp.Eye Rse.，No.25，pp.75-89(1977)〕。將細(xì)胞在37℃在10％ CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)器中培養(yǎng)，用早期(3-8)細(xì)胞傳代完成實(shí)驗(yàn)。
為了制備硫酸鹽標(biāo)記ECM，在融合密度下，在4-6小時(shí)內(nèi)將角膜內(nèi)皮細(xì)胞接種在4-孔盤(pán)中，形成接觸抑制的緊密排列組成的且生長(zhǎng)被抑制的單層細(xì)胞。在這些條件下，細(xì)胞維持存活并保持它們正常的單層構(gòu)型和形態(tài)直到鹵夫酮的濃度為2ug/ml。接種后一和五天加入Na2〔35S〕O4(540-590mCi/mmol)，培養(yǎng)介質(zhì)無(wú)變化。在接種后的不同間隔，通過(guò)用含0.5％ Tritonx-100和20mM NH4OH的PBS溶解(5分鐘，室溫)細(xì)胞層而暴露亞內(nèi)皮細(xì)胞ECM，接著在PBS中洗滌四次〔I.Vlodavsky，等，“Lymphoma Cell Mediated Degradation ofSulfated Proteoglycans in the Subendothelial Extracellular MatrixRelationship to Tumor Cell Metastasis，”Cancer Res.Vol.43，pp.2704-2711(1983)；I.Vlodavsky，等“Endothelial Cell-Derived BasicFibroblast Growth FactorSynthesis and Deposition intoSubendothelial Extracellular Matrix，”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.84，pp.2292-2296(1987)〕。為了測(cè)定硫酸鹽標(biāo)記的物質(zhì)的總量，用胰蛋白酶消化ECM(25μg/ml，24小時(shí)，37℃)在β-計(jì)數(shù)器中對(duì)溶解物質(zhì)計(jì)數(shù)。I型膠原蛋白的三維凝膠中的體外血管生成由成年Sprague-Dawley鼠尾腱制備I型膠原蛋白。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)在4℃，在無(wú)菌的1/1000(v/v)乙酸溶液(lg膠原蛋白300ml)中攪拌48小時(shí)來(lái)溶解膠原蛋白纖維。將所得溶液用無(wú)菌三層網(wǎng)過(guò)濾，在4℃下以16,000g的速度離心1小時(shí)。然后將上清液用1/10 DMEM充分透析并在4℃保存。通過(guò)同時(shí)升高膠原蛋白溶液pH值和離子強(qiáng)度而得到膠原蛋白基質(zhì)凝膠。為了這個(gè)目的，將7體積膠原蛋白溶液與1體積的10xMinimum Essential Medium(最低限度培養(yǎng)基)和2體積碳酸氫鈉(0.15M)快速混合。
從通過(guò)斷頭處死的1-到2-月齡SD鼠得到胸主動(dòng)脈〔R.F.Nicosia和A.Ottinetti，“Growth of Microvessels in Sermm-free MatrixCultrue of Rat Aorta”Lab.Invest，Vol.63，pp.115-122(1990)〕。將主動(dòng)脈立即用PBS移至培養(yǎng)皿。解剖顯微鏡下仔細(xì)地除去主動(dòng)脈周?chē)睦w維脂肪組織，將1mm長(zhǎng)的主動(dòng)脈環(huán)切開(kāi)并在PBS中充分沖洗。
將膠原蛋白溶液(0.2ml)加入各個(gè)16mm孔中并在37℃膠化15分鐘。將各主動(dòng)脈環(huán)移至凝膠的中心定位并將另外的0.4ml膠原蛋白溶液仔細(xì)地倒入環(huán)的頂部。凝膠形成后，加入無(wú)血清的內(nèi)皮生長(zhǎng)介質(zhì)，加入或不加入0.1μg/ml鹵夫酮，并隔天換介質(zhì)。內(nèi)皮細(xì)胞在體外構(gòu)成毛細(xì)血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在24-孔板的16mm孔內(nèi)接種并使其生長(zhǎng)24小時(shí)，得到次融合單層。然后除去培養(yǎng)液介質(zhì)，將0.4ml上述冷卻的膠原蛋白混合物倒在單層細(xì)胞上，并使其在37℃聚合10分鐘。膠原蛋白膠化后，加入含有或不含有各種濃度的鹵夫酮的新鮮介質(zhì)(0.6ml)。用Zeiss反相對(duì)照攝影顯微鏡監(jiān)測(cè)并拍攝內(nèi)皮細(xì)胞單層的重組〔R.Montesano，等，“In Vitro Rapid Organization of Endothelial Cells intoCapillary-like Networks Is Promoted by Collagen Matrices，” J.CellBiol.，Vol.97，pp.1648-1652(1983)〕。鹵夫酮對(duì)人平滑肌肉瘤腫瘤細(xì)胞增生的作用按〔R.S.Mangrulker，等，ibid〕所述，從女性子宮切除手術(shù)中得到人平滑肌肉瘤樣品。將粉碎的組織置于20ml冷的均化緩沖液1MNaCl，10mM Tris(pH7.4)，1mM EDTA，1mM苯甲脒，0.1％CHAPS，0.01％Aprotinin(抑蛋白酶肽)(Sigma)，10μg/ml亮肽素，1mM AEBSF〔R.S.Mangrulker，等，ibid.〕。將樣品均化2分鐘并在4℃下以12000xg的轉(zhuǎn)速離心60分鐘。將上清液用10mM Tris(pH7.4)稀釋(1∶5)至最終產(chǎn)體積為100ml，用0.45μm尼龍濾器過(guò)濾。將細(xì)胞固定并保存在DMEM加10％小牛血清中。幾代后細(xì)胞仍能存活，但使用2或3代的細(xì)胞。對(duì)于增生測(cè)定，將細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔的量接種在含200μl介質(zhì)(含有4.5g/L葡萄糖，10％小牛血清，1％谷氨酰胺，1％青霉素/鏈霉素的DMEM)的96孔培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)2天直到融合。將介質(zhì)變?yōu)楹?.5％小牛血清，1mM胰島素和5μm運(yùn)鐵蛋白的DMEM。24小時(shí)后加入樣品(5-10μl)，過(guò)24小時(shí)后，在每孔中加入〔3H〕胸苷(1μCi/孔)。培養(yǎng)36-48小時(shí)后，用甲醇凝固細(xì)胞，并用5％三氯乙酸沉淀DNA。用150μl/孔0.3N NaOH溶解細(xì)胞，將其移至閃爍瓶中，用β-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果鹵夫酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗增生作用將亞融合的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞保存在含10％小牛血清，含或不含1ng/ml bFGF，含或不含增加濃度的鹵夫酮的介質(zhì)中。接種4天后加入3H-胸苷(1μCi/孔)，此后48小時(shí)測(cè)量DNA合成。如圖1所示，鹵夫酮含量為100ng/ml時(shí)得到混入的3胸苷50％抑制，與是否在培養(yǎng)介質(zhì)中加入bFGF(1ug/ml)無(wú)關(guān)(圖1)。鹵夫酮對(duì)通過(guò)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的ECM的沉積的作用亞內(nèi)皮ECM已顯示可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增生〔D.Gospodarowicz，等，“The Extracellular Matrix and the Control ofProliferation of Vascular Endothelial and Vascular Smooth MuscleCells，”J.Supramol.struc.，No.13，pp.339-372(1980)〕。這種活性歸因于ECM的大分子組分，歸因于肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子如bFGF，它與ECM中乙酰肝素硫酸酯蛋白多糖的GAG側(cè)鏈有關(guān)〔I.Vlodavsky〕等，“Endothelial Cell-Derived Basic Fibroblast FactorSynthesis andDeposition into Subendothelial Extracellular Matrix，”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.84，pp.2292-2296(1987)。為了評(píng)定鹵夫酮對(duì)ECM沉積的影響，接種后24小時(shí)，將標(biāo)記的硫酸鹽(Na2〔35S〕O4)和鹵夫酮加入融合的細(xì)胞單層。在不同的時(shí)間(5，10和14天)，溶解細(xì)胞層以暴露下面的ECM。然后將ECM進(jìn)行胰蛋白酶消化，并用β-閃爍計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，鹵夫酮的濃度為1μg/ml時(shí)，觀察到混入的硫酸鹽幾乎完全的抑制，而藥物濃度為0.2μg/ml時(shí)得到50％的抑制。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成毛細(xì)血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將牛主動(dòng)脈細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)皿的16mm孔中并使其在凝膠表面生長(zhǎng)24小時(shí)，得到亞融合的單層。然后除去培養(yǎng)基質(zhì)，將0.4ml冷的膠原蛋白倒在細(xì)胞單層的上面，使其聚合。膠原蛋白膠化后，加入含bFGF(1ng/ml)和肝素(1ng/ml)，含(圖2B)或不含(圖2A)0.1μg/ml鹵夫酮的新鮮介質(zhì)〔R.F.Nicosa和A.Ottinetti，“Growth ofMicrovessels in Serum Free Matrix Culture of Rat Aorta，”Lab.Invest.，Vol.63，pp.115-122(1990)〕。如圖2B所示，鹵夫酮完全抑制了內(nèi)皮細(xì)胞侵入膠原蛋白凝膠及其隨后分支并交織合的毛細(xì)血管樣管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)成。微血管的形成通過(guò)斷頭處死，由1到2月齡SD鼠得到胸主動(dòng)脈〔R.F.Nicosia，等，ibid，(1990)〕。將主動(dòng)脈移至培養(yǎng)皿中，將其切成1mm長(zhǎng)的主動(dòng)脈環(huán)并在PBS中充分漂洗。將I型膠原蛋白溶液加入各個(gè)16mm孔中，并在37℃膠化15分鐘。在環(huán)的上部再傾倒0.4ml膠原蛋白溶液凝膠形成后，加入含或不含0.1μg/ml鹵夫酮的無(wú)血清的內(nèi)皮生長(zhǎng)介質(zhì)并隔天換介質(zhì)。圖3A顯示10天時(shí)的培養(yǎng)物，從主動(dòng)脈切割端長(zhǎng)出了新形成的分支微血管，引起環(huán)和結(jié)網(wǎng)的增長(zhǎng)。圖3B顯示用隔天置換的0.1μg/ml鹵夫酮處理的相同的培養(yǎng)物。在這些條件下，單細(xì)胞向主動(dòng)脈環(huán)向外周遷移，但未排成微血管。圖4為定量反應(yīng)這種作用的劑量。
當(dāng)鹵夫酮的濃度為100ng/ml時(shí)，幾乎完全抑制了微血管的形成(圖4)。鹵夫酮的濃度為250ng/ml時(shí)，觀察到了完全的抑制，但在第2或6天除去藥物時(shí)，導(dǎo)致了微血管的形成，與未處理的主動(dòng)脈環(huán)中所見(jiàn)相似(圖5)。鹵夫酮對(duì)人平滑肌肉瘤腫瘤細(xì)胞的抗增生作用本實(shí)驗(yàn)研究鹵夫酮對(duì)人類(lèi)平滑肌肉瘤腫瘤細(xì)胞增生的作用。平滑肌肉瘤具有充分的細(xì)胞基質(zhì)，也被充分地血管化〔A.Ferenczy，等，“AComparative Ultrastructural Study of Leiomyosarcoma，CellularLeiomyoma，and Leiomoma of the Uterus，”Cancer，No.28，pp.1004-1018(1971)〕。人們認(rèn)為，它們的生長(zhǎng)依賴于由一般的和惡性的子宮肌細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子(即，bFGF，HB-EGF)〔A.Zhang，等，“Heparin-Binding Epidermal Growth Factor-Like Growth Factor isDifferentially Regnlated by Progesterone and Estradiol in Rat UterineEpithelial and Stromal Cells，”Endocrinology，No.134，pp.1089-1094(1994)；R.S.Mangrulker，等，“Isolation and Characterization ofHeparin-Binding Growth Factors in Human Leiomyomas and NormalMyometrinm，”Biology of Reproduction，No.53，pp.636-646(1995)〕并就地嵌入周?chē)腅CM〔J.Vlodavsky，等，“Extracellar Matrix-Bound Growth Factors，Enzymes and Plasma Proteins，”in；BasementMembranesCellular and Molecular Aspects.D.H.Rohrbach and R.Timpl.，Eds.，Academic Press，Inc.，Orlando，F(xiàn)lorida，U.S.A.，pp.327-343(1993)〕。
將亞融合的人類(lèi)平滑肌肉瘤細(xì)胞接種在含10％胎牛血清〔FCS〕的介質(zhì)中。接種后24小時(shí)，加入增加濃度的鹵夫酮(10-100ng/ml)，24小時(shí)后將該細(xì)胞暴露于3H-胸苷(1μCi/孔)。此后48小時(shí)測(cè)量DNA合成。如圖7A所示，鹵夫酮的濃度為2.5ng/ml時(shí)，得到60-70％3H-胸苷混入抑制率。
誘使其余的人平滑肌肉瘤腫瘤細(xì)胞進(jìn)行與FCS或肝素結(jié)合表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HB-EGF)有關(guān)的增生。通過(guò)在含0.5％ FCS的介質(zhì)中培養(yǎng)而使平滑肌肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。然后將該細(xì)胞暴露于含或不含10ng/ml鹵夫酮的10％ FCS或10ng/mlHB-EGF。然后加入3H-胸苷，36小時(shí)后測(cè)量DNA合成。存在鹵夫酮時(shí)，觀察到由血清或HB-EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增生的完全抑制(圖7B)。結(jié)論本發(fā)明在其最優(yōu)選方案中使用了高效，低價(jià)，無(wú)毒，可抑制數(shù)種參與新血管生成的組分的化合物。例如，鹵夫酮既可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，也可抑制平滑肌細(xì)胞的增生〔E.F.Choi，等，“Halofuginone，ASpecific Collagen Type I Inhibitor Reduces Anastomotic IntimalHyperplasia，”Arch.surg.，Vol.130，pp.257-261(1995)〕，并能抑制膠原蛋白的合成〔I.Granot，等，“Halofuginone；An Inhibitor of CollagenType I Synthesis，”Biochem.Bilphys.Acta，Vol，1156，pp.107-112(1993)〕以及亞內(nèi)皮ECM的排列，這對(duì)微血管的形成都是必要的〔J。Folkman和M.Klagsbrun，ibid.(1987)；J.Folkman和Y.Shing，ibid.(1992)；J.Folkman，ibid.(1985)〕。某些抑制血管生成的近期研究使用了如抗整聯(lián)蛋白的抗體或信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，它們很可能具有廣譜的效果〔J.Folkman.ibid.(1995)；P.C.Brooks，等，“Integrin αVβ3Antagonists Promote Tumor Regression by Inducing Apoptosis ofAngiogenic Blood Vessels，”Cell，Vol.79，pp.1157-1164(1994)〕因而也具有很強(qiáng)的副作用。另一方面，鹵夫酮具有相對(duì)窄和更特異的作用模式。另外，目前被評(píng)價(jià)為抗血管生成劑的很多化合物為蛋白質(zhì)，例如，抗體，血小板反應(yīng)蛋白，angiostatin，血小板因子IV〔J.Folkman，ibid.(1995)；M.S.O′Reilly，等，ibid(1994)；V.Castle，等，ibid.；P.C.Brooks，等，ibid，(1994)〕，它們很容易在體內(nèi)降解，因此應(yīng)以大劑量高頻率給藥。
本發(fā)明的方法使用了高效，低價(jià)，無(wú)毒的化合物。而且，鹵夫酮是低分子量的化合物，極有可能可被口服。該化合物已由F.D.A.通過(guò)，用于家畜的治療。這些特點(diǎn)使鹵夫酮最有希望成為用于臨床的抑制新血管生成和腫瘤血管生成的藥物。
如上所述，使用可有效抑制血管形成的無(wú)毒化合物鹵夫酮可望提供一種抑制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散，以及治療各種臨床疾病的有效對(duì)策。
從上述也可說(shuō)明鹵夫酮在極低的濃度(2.5ng/ml)就可幾乎完全抑制人類(lèi)平滑肌肉瘤細(xì)胞中的DNA合成，無(wú)論該細(xì)胞是由血清還是由有效的生長(zhǎng)促進(jìn)因子如HB-EGF刺激的。鹵夫酮的濃度比抑制正常血管內(nèi)皮細(xì)胞增生所需的濃度低40倍，說(shuō)明鹵夫酮對(duì)平滑肌肉瘤腫瘤細(xì)胞具有直接的，高效的抗增生作用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明不限于前述實(shí)施例的細(xì)節(jié)，本發(fā)明可體現(xiàn)在不脫離其基本特征的其他特定形式中，因此希望將該優(yōu)選方案和實(shí)施例以說(shuō)明而不是以限制看待，應(yīng)參照所附的權(quán)利要求，而不是上面的描述，來(lái)自權(quán)利要求的意圖和等同物的范圍的所有變化均在本發(fā)明的范圍中。
權(quán)利要求
1.一種用于緩減新血管生成及治療人類(lèi)惡性腫瘤的組合物，其中包括與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的作為活性組分的藥學(xué)有效量的式I化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的化合物為鹵夫酮。
3.權(quán)利要求1定義的式I化合物在制備具有如說(shuō)明書(shū)中描述的新血管緩減活性藥物中的用途。
4.權(quán)利要求1定義的式I化合物在制備具有如說(shuō)明書(shū)所述的抗人腫瘤細(xì)胞增生活性藥物中的用途。
5.一種治療人類(lèi)患者長(zhǎng)期血管生成的方法，其中包括對(duì)該患者使用藥物有效量的可有效緩減新血管生成的式I化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
6.一種治療人類(lèi)患者惡性腫瘤的方法，其中包括對(duì)該患者使用藥物有效量的可有效抑制人類(lèi)惡性腫瘤細(xì)胞增生的式I化合物
其中R1選自氫，鹵素，硝基，苯并基，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2選自羥基，乙酰氧基和低級(jí)烷氧基，以及R3選自氫和低級(jí)烯氧羰基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用緩減新血管生成和治療人類(lèi)惡性腫瘤的組合物,其中包括與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的作為活性組分的藥物有效量的式(Ⅰ)化合物,其中:R
文檔編號(hào)A61K31/517GK1194583SQ96196609
公開(kāi)日1998年9月30日 申請(qǐng)日期1996年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月15日
發(fā)明者A·納格勒, S·斯拉溫, I·夫勞達(dá)維斯基, M·皮尼斯 申請(qǐng)人:以色列農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究組織, 哈達(dá)西特醫(yī)藥研究服務(wù)與發(fā)展公司