專利名稱：變應(yīng)原－xcd32融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類IgG和抗原/變應(yīng)原(或抗原/變應(yīng)原的組合體)的復(fù)合物。其有關(guān)抗-CD32分子和抗原/變應(yīng)原(或抗原/變應(yīng)原的組合體)之間的融合蛋白。變應(yīng)原本文定義為特應(yīng)性患者以過敏反應(yīng)對其作出反應(yīng)的抗原。本文所使用的抗原可以是各種來源的，例如環(huán)境變應(yīng)原(如房間塵螨、樺樹花粉、草花粉、貓抗原、蟑螂抗原)或食物變應(yīng)原(如牛奶、花生、蝦、大豆)或兩者的組合體，或者非相關(guān)抗原(如牛血清白蛋白(BSA))。
變態(tài)反應(yīng)是一種疾病，其中IgE抗體介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞)的活化，而且通過IgE的低和高親和性受體(B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹狀細(xì)胞)增強(qiáng)抗原呈遞。IgE的這些作用可以被特異性IgG抗體抵消，所述IgG抗體在效應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞兩者上與CD32(FcγRII)相互作用。因此，變態(tài)反應(yīng)應(yīng)該被認(rèn)為是具有不平衡的Th1對Th2細(xì)胞的一種疾病。IgG抗體體內(nèi)抵消IgE成功與否取決于特異性IgE超過特異性IgG的相對濃度，也取決于IgG的同型。所有人類同型對CD32具有低的親和性，這可以由形成與變應(yīng)原的復(fù)合物克服，但是許多變應(yīng)原不形成足夠大的使得可以穩(wěn)定地結(jié)合到CD32上的與IgG分子的復(fù)合物。
迄今使用了利用變應(yīng)原的活性接種的兩種形式。最普遍的是所謂的“免疫療法”，這依賴于用相對高濃度的變應(yīng)原頻繁免疫。這種技術(shù)僅僅在少數(shù)變應(yīng)性疾病(如蜂刺變態(tài)反應(yīng))和鼻炎和結(jié)膜炎的某些病例中有一定的效果，前不久一些報道顯示了在哮喘和特應(yīng)性皮炎中的有效性。經(jīng)典的皮下途徑用于施用變應(yīng)原，但是最近將這一途徑與口頭施用甚至局部施用進(jìn)行了比較，結(jié)果總的來說是正的但是不一致。一種最新的免疫療法，即所謂的Saint-Remy技術(shù)(參見例如EP 0 178 085和0 287 361)，其使用體外與相關(guān)的變應(yīng)原復(fù)合的自身IgG抗體。這種方法使得可以使用低得多的量的變應(yīng)原，具有更小的副作用。
兩種療法的機(jī)制不清楚。在經(jīng)典方法中，雖然不是所有的特異性IgG的明顯增加都與成功的免疫療法有關(guān)，但療法引起特異性IgG抗體增加時顯得具有有益的作用。這一現(xiàn)象的一個可能的理由是IgG抗體對B細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的CD32的比較低的親和性。Saint-Remy法從病人選擇特異性IgG抗體，隨后體外將其與相關(guān)變應(yīng)原混合。以這種方式，他們保證變應(yīng)原不能與細(xì)胞或在細(xì)胞上的其它抗體同型(如在肥大細(xì)胞上的IgE)自由地進(jìn)行反應(yīng)。此外，抗個體基團(tuán)型抗體可能是針對特異性IgG分子而產(chǎn)生的，隨后將阻止變態(tài)反應(yīng)，雖然這一點還沒有由實驗數(shù)據(jù)確認(rèn)。
IgG分子在指導(dǎo)免疫反應(yīng)針對單核細(xì)胞而非B細(xì)胞中是重要的。當(dāng)一般性變應(yīng)原-特異性IgG代替供體-特異性變應(yīng)原-特異性IgG使用時，Saint-Remy法因此應(yīng)該起作用。然而，Saint-Remy法的問題在于人類IgG抗體對其在B細(xì)胞上的Fcγ受體的低的親和性，這與IgE相反，后者易于結(jié)合幾乎所有的抗原-呈遞細(xì)胞(包括B細(xì)胞)，導(dǎo)致散布變態(tài)反應(yīng)和誘導(dǎo)Th2細(xì)胞。復(fù)合物的用途應(yīng)該繞過低親和性問題，因為與單個IgG分子比較復(fù)合物提高的抗體親抗原性；然而，在復(fù)合物中的變應(yīng)原/IgG的組合體也是不合乎需要的，因為結(jié)合人類IgG分子的變應(yīng)原的表位的自然數(shù)不到5，太少以致不能增強(qiáng)復(fù)合物對受體的抗體親抗原性。
采用本發(fā)明，經(jīng)典的免疫療法的風(fēng)險因素被降低，并且在分離特異性IgG分子中所遇到的問題和這些IgG抗體對CD32的低親和性問題得到解決。
IgE結(jié)合至肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞上引起組胺釋放(當(dāng)由抗原交聯(lián)時)。此外，IgE能夠提高人類B細(xì)胞的抗原呈遞(圖1)。此外，在不存在IgE時，B細(xì)胞是非常差的抗原-呈遞細(xì)胞，除了很小部分的B細(xì)胞外，其是特異性抗原受體。可通過胞飲發(fā)生抗原攝取，但是這需要高的抗原濃度和/或長的培養(yǎng)時間。
圖2顯示，超過5天的變應(yīng)原胞飲能夠模仿IgE-介導(dǎo)的抗原呈遞，但是IgG-介導(dǎo)的抗原呈遞不引起T細(xì)胞的刺激作用。事實上，數(shù)據(jù)表明復(fù)合變應(yīng)原和IgG阻止變應(yīng)原呈遞。
在另一系列實驗中，研究了這些IgG-變應(yīng)原復(fù)合物對IgE-介導(dǎo)的抗原呈遞或變應(yīng)原的胞飲攝取的作用。圖3顯示IgG復(fù)合物以劑量-依賴性方式抑制IgE-介導(dǎo)的抗原呈遞，此外，在胞飲之后的抗原呈遞受到抑制。這種作用不是抗原-特異性的(IgG/BSA復(fù)合物抑制Der P1-特異性刺激作用)，單體(非復(fù)合的)IgG不抑制抗原呈遞。
由圖4中所示的實驗排除了IgG/變應(yīng)原復(fù)合物的毒性。與人類單核細(xì)胞一起(預(yù))溫育的IgG3-Der P1復(fù)合物能夠引起一種正常的T細(xì)胞反應(yīng)。這意味著IgG/變應(yīng)原復(fù)合物抑制B細(xì)胞的變應(yīng)原呈遞，同時刺激單核細(xì)胞和樹狀細(xì)胞。同樣地，aCD32抗體或涂布在孔底(刺激作用在其中進(jìn)行)的聚集的IgG也抑制B細(xì)胞的抗原呈遞(圖5)。CD32定向分子抑制抗原呈遞的效率很可能依賴于CD32分子的交聯(lián)的量。然而，對在B細(xì)胞上的CD32的導(dǎo)向抗原(如在天然IgG/抗原復(fù)合物中(圖2)的或在按照本發(fā)明的aCD32/抗原融合蛋白中(圖13a和13b)的)不引起復(fù)合物中抗原的抗原呈遞。另一方面，定向單核細(xì)胞的相同復(fù)合物確實引起抗原-特異性T細(xì)胞反應(yīng)(圖4、13a和13b)。這種現(xiàn)象可以通過B細(xì)胞上CD32B的存在予以解釋，而單核細(xì)胞以及樹狀細(xì)胞表達(dá)CD32A。因此，IgG/抗原復(fù)合物以及aCD32/抗原融合蛋白指導(dǎo)對單核細(xì)胞和樹狀細(xì)胞譜系的細(xì)胞的免疫反應(yīng)，這引起主要的Th1型B細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)，主要表達(dá)CD32B的其它APC不呈遞復(fù)合物中的抗原，因此這些復(fù)合物阻止(進(jìn)一步的)誘導(dǎo)B細(xì)胞的Th2細(xì)胞反應(yīng)。復(fù)合物和CD32之間的相互作用不依賴強(qiáng)的交聯(lián)(超過2個CD32分子)，只要復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度足以使得可以進(jìn)行穩(wěn)定的相互作用。事實上，已經(jīng)顯示在單核細(xì)胞上引起CD32多重交聯(lián)(通過涂布聚集的IgG模仿)的非常大的復(fù)合物的結(jié)合導(dǎo)致對于抗原-特異性T細(xì)胞的刺激作用重要的輔助受體(例如CD80)的下調(diào)(表1)。
除抗原呈遞之外，按照本發(fā)明的IgG/抗原復(fù)合物或aCD32/抗原融合蛋白也抑制正常的人類B細(xì)胞產(chǎn)生Ig。圖14顯示在aCD32抗體或聚集的涂布的人類IgG存在下用aCD40和IL-4刺激的扁桃體B細(xì)胞(與CD32有效地相互作用)不再能夠產(chǎn)生抗體。以aCD32F(ab)片段處理與用完全抗體一樣有效(圖5)，表明對aCD40和IL-4刺激之后Ig產(chǎn)生的抑制作用而言，不需要受體的交聯(lián)。通過其B細(xì)胞受體(BCR)受到抗原刺激的B細(xì)胞需要BCR和CD32的共交聯(lián)。Ig產(chǎn)生的下調(diào)是可逆的和時間依賴性的。當(dāng)在aCD40加IL-4刺激后4天將aCD32抗體加入到B細(xì)胞時，沒有觀察到Ig產(chǎn)生的抑制作用。圖16顯示，抗體產(chǎn)生的抗原-特異性誘導(dǎo)也受B細(xì)胞的aCD32處理抑制。
本質(zhì)上，IgG分子通過與CD32的相互作用控制B細(xì)胞反應(yīng)。尤其是，IgE抗體的作用(這一般對(CD23陽性)B細(xì)胞具有正向作用)能由IgG分子抵消。這阻止有機(jī)體對抗原的超反應(yīng)性免疫反應(yīng)。在IgE抗體大量存在的變態(tài)反應(yīng)中，很明顯天然IgG抗體不能控制免疫反應(yīng)。有趣的是，在人類中IgE和IgG4由相同的白介素(即IL-4)調(diào)節(jié)。然而，IgG4具有對所有CD32的人類IgG亞類的最低的親和性。
本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含a)一種或多種抗原和b)一種或多種與人類Fcγ受體II(FcPII)(CD32)相互作用的部分，例如來源于抗體分子的部分，在下文，將這種融合蛋白簡稱為“按照本發(fā)明的融合蛋白”。
按照本發(fā)明的融合蛋白克服了由人類IgG分子對CD32的低親和性產(chǎn)生的問題。通過將具有Kd＜10-6的aCD32抗體與抗原組合，獲得了天然IgG分子的負(fù)向(B細(xì)胞)和正向兩種作用，所述作用包括在缺少抗體產(chǎn)生下導(dǎo)致Th1/Th0記憶誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的選擇性刺激作用。該作用是無害的，并且指導(dǎo)免疫反應(yīng)針對表達(dá)CD32的抗原-呈遞細(xì)胞，從而，主要表達(dá)CD32A的細(xì)胞介導(dǎo)導(dǎo)致Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)和活化的抗原呈遞(作為由CD32A-表達(dá)抗原-呈遞細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12的結(jié)果)。
按照本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選地沒有強(qiáng)的交聯(lián)。CD32的結(jié)合位點的數(shù)目優(yōu)選地是有限的，以避免刺激性輔助-受體(如CD40、CD80或CD86)的下調(diào)。
它們也破壞了肥大細(xì)胞的效應(yīng)器功能，這些細(xì)胞攜帶融合蛋白的IgE-特異性部分。它們有下列獨特的特征1)使B細(xì)胞-介導(dǎo)的抗原呈遞沉默(阻止誘導(dǎo)Th2細(xì)胞)；2a)阻止IgE開關(guān)誘導(dǎo)；2b)阻止B細(xì)胞中的Ig產(chǎn)生；3)通過與單核細(xì)胞和/或樹枝狀細(xì)胞的相互作用刺激T細(xì)胞區(qū)室(Th1細(xì)胞的刺激作用)；和4)使對攜帶有對融合蛋白的部分特異性的IgE的肥大細(xì)胞沉默。
它們包括a)一種或多種抗原和b)一種或多種與人類Fcγ受體II相互作用的部分，例如來源于抗體的部分。
與Fcγ受體II相互作用的融合蛋白的部分可以是例如1)完全或不完全(修飾的)人類或人源化IgG抗體部分，只要與這些受體的相互作用仍然可能，這意味著全部或部分Fc片段應(yīng)該存在；或2)人類或人源化aCD32抗體部分或其一部分，例如Fab片段，其仍然特異性地識別和結(jié)合FcγRII(CD32)抗原，如在B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞上表達(dá)的，例如操作的人類或人源化aCD32或IgG抗體部分或其一部分，其以比天然aCD32或IgG抗體更高的親和性識別FcγRII(CD32)。
所述抗原可以來源于完全蛋白質(zhì)或其仍然具有T細(xì)胞表位(存在于融合蛋白中的序列上)的部分?？梢允褂镁哂蠭gE-介導(dǎo)的超敏性反應(yīng)的變應(yīng)性患者對其作出反應(yīng)的任何抗原，如特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性結(jié)膜炎的變應(yīng)原。最普通的環(huán)境變應(yīng)原是房塵螨、樺樹花粉、草花粉、貓、蟑螂。每個這樣的變應(yīng)原有一種或多種“主要的變應(yīng)原”(例如對于房塵螨，主要的變應(yīng)原是Der P1；對于樺樹花粉，主要的變應(yīng)原是Bet V1)。然而，完全抗原不是必需的，因為融合蛋白通常僅引起T細(xì)胞反應(yīng)，和對小(8-12個氨基酸長)肽的T細(xì)胞反應(yīng)。因此，選擇的T細(xì)胞表位可以包括在每種變應(yīng)原的融合蛋白中，這樣降低復(fù)合物的大小及分子量。這樣，融合蛋白可以是從一種或多種包含T細(xì)胞表位的DNA骨架產(chǎn)生的，而不是從完全抗原的基因產(chǎn)生的。變應(yīng)原之間的重疊交叉反應(yīng)性表位是優(yōu)選的。融合蛋白應(yīng)當(dāng)特異性地結(jié)合CD32，并包含一種或多種(例如兩種或多種)T細(xì)胞表位(其是一種或多種抗原/變應(yīng)原的)。為了可以進(jìn)行正確的抗原加工，比實際T細(xì)胞表位稍長的DNA骨架最好應(yīng)當(dāng)包括在融合蛋白的制劑中。
對編碼aCD32抗體的基因的融合，優(yōu)選地使用來源于主要變應(yīng)原的克隆基因的短的DNA序列，如房塵螨主要變應(yīng)原I(Der P1)或樺樹花粉變應(yīng)原(Bet V1)。這些短的DNA序列包含一種或多種T細(xì)胞表位的遺傳密碼，所述表位在加工后出現(xiàn)在抗原-呈遞細(xì)胞表面，并由此引起應(yīng)答變應(yīng)原-特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。對于Der P1，大多數(shù)T細(xì)胞表位可以在用氨基酸單字母代碼表示的序列(SEQ.ID.No.1)的101-143位上發(fā)現(xiàn)QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQPQRYCRHYWT101 110 120 130 140尤其是用氨基酸單字母代碼表示的序列(SEQ.ID.No.2)的101-131位QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREAL101 110 120 130包含至少三個T細(xì)胞表位，其結(jié)合一些HLAII類分子。
在例如aCD32和抗原之間的融合可以在蛋白質(zhì)水平(化學(xué)融合)或在基因水平(重組融合蛋白)上實現(xiàn)，本發(fā)明也包括用于生產(chǎn)如上所限定的融合蛋白的方法。其按照常規(guī)方式進(jìn)行，優(yōu)選地包括采用重組基因技術(shù)或化學(xué)交聯(lián)。
重組融合蛋白是優(yōu)選的。
可以經(jīng)已知方法(如以下方法)進(jìn)行利用重組基因技術(shù)的制備從例如IV.3 cDNA PCR-擴(kuò)增一個基因區(qū)段并克隆，所說基因區(qū)段含有抗原-結(jié)合位點和部分Fc區(qū)，后者在aCD32單克隆抗體(例如克隆IV.3)的CH2外顯子下游。適當(dāng)?shù)腞NA純化來作為PCR-擴(kuò)增的來源，例如，從房塵螨純化的RNA用于Der P1基因的擴(kuò)增。將變應(yīng)原基因與分離的重鏈區(qū)段一起連接進(jìn)適當(dāng)?shù)牟溉閯游锉磉_(dá)載體，如p350。此外，分離例如IV.3的完全相應(yīng)的輕鏈基因并克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)牟溉閯游锉磉_(dá)載體，如p345，其具有類似于p350的特征。兩種重組質(zhì)粒用于在例如COS細(xì)胞中共-轉(zhuǎn)染，使得可以將形成的重組融合蛋白釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中。優(yōu)選地經(jīng)免疫親和純化(基于容易大量獲得的抗輕鏈抗體柱)進(jìn)行所說產(chǎn)物的純化。
另外，來源于合適的噬菌體展示文庫(例如，De Kruif等，美國科學(xué)院學(xué)報，92(1995)3938-3942所描述的)的CD32(scFv)特異性單鏈抗體可以用于由克隆的變應(yīng)原基因制造重組融合蛋白(圖6)。從結(jié)合噬菌體提取DNA，分離含有經(jīng)柔性接頭(scFv片段)融合進(jìn)一個VL鏈的半-合成VHDJH區(qū)的DNA片段并克隆。采用編碼T-細(xì)胞表位的限定的合成的寡核苷酸從Der P1和其它主要的變應(yīng)原(由它們的高(T細(xì)胞)交叉反應(yīng)性潛力選擇，以便用一種融合蛋白覆蓋盡可能多的患者)完成與例如Der P1基因的融合。將這些寡核苷酸與scFv抗體片段一起共-連接進(jìn)適當(dāng)?shù)牟溉閯游锉磉_(dá)載體中。將所說的重組載體(例如質(zhì)粒)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染進(jìn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞(如COS和/或CHO細(xì)胞)中，經(jīng)以上所述的免疫親和色譜從細(xì)胞上清液純化所形成的融合蛋白。
所形成的基因構(gòu)建體可以在例如CHO細(xì)胞中表達(dá)，特別是用于大規(guī)模生產(chǎn)；然而，經(jīng)重組基因技術(shù)的其它產(chǎn)生系統(tǒng)也是適當(dāng)?shù)?，尤其?dāng)僅使用T細(xì)胞表位(即不需要糖基化)時?？梢詮娜祟怚g噬菌體展示文庫(其僅含有天然抗體的F(ab)片段)獲得aCD32抗體。然而，編碼抗體或抗原/變應(yīng)原的遺傳物質(zhì)的來源不是關(guān)鍵的。
采用Calsson等[生物化學(xué)雜志173(1978)723-737]，Cumber等[酶學(xué)方法112(1985)207-224]和Peeters等[免疫學(xué)方法雜志120(1989)133-143]所描述的方法，經(jīng)用于例如Mc.a-CD32和Der P1之間的融合蛋白的已知方法進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)的制備。
簡言之，Der P1和Mc.a-CD32分別單獨地用SPDP(摩爾比分別為1/20和1/5)衍生化以引入2-吡啶基二硫化物殘基。在溫和還原和凝膠色譜脫鹽之后，將SPDP-衍生化的Mc.a-CD32(其二硫化物基團(tuán)被還原成巰基基團(tuán))與SPDP-衍生化的Der P1以1/1.6摩爾比一起溫育。然后，形成的DerP1-Mc.a-CD32產(chǎn)物通過凝膠過濾(在例如Superose-12上的)和陰離子交換色譜(在例如FPLC-MonoQ上的)純化。
起始物質(zhì)是已知的物質(zhì)，或者可以按照已知的方法或已知方法的類似方法或本文所描述的(例如實施例中的)方法的類似方法制備。
按照本發(fā)明的融合蛋白對預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)，特別是食物變態(tài)反應(yīng)是有用的。它對患有對特定變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)的患者以及患有對一種或多種其它變應(yīng)原的這樣一種反應(yīng)的患者是常見的。通過本發(fā)明的方法使同時涉及兩種或多種變應(yīng)原的患者脫敏是可能的，其是經(jīng)施用包含針對各種這樣的變應(yīng)原的抗原的融合蛋白進(jìn)行的。優(yōu)選地按照本發(fā)明的融合蛋白將用于預(yù)防和/或治療具有食物變態(tài)反應(yīng)危險(例如對奶的變態(tài)反應(yīng))的新生嬰兒中的變態(tài)反應(yīng)，或者預(yù)防和/或治療具有針對包含在所使用的特定的融合蛋白中的變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)之患者的已有的變態(tài)反應(yīng)。
對于這些疾病，合適的劑量當(dāng)然隨著，例如，所使用的特定的融合蛋白、宿主、施用方式和預(yù)期治療的疾病而變化。然而，一般來說，1-2年內(nèi)的一至三次接種顯示可獲得令人滿意的結(jié)果，但是如果必要，可以進(jìn)行重復(fù)的附加的接種。已顯示對這些治療而言，本發(fā)明的融合蛋白可以以類似常規(guī)使用的劑量和施用方案來施用。
因此本發(fā)明也涉及以上所限定的融合蛋白在變態(tài)反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))的預(yù)防和/或治療中的用途，和治療變態(tài)反應(yīng)的方法(該方法包括對需要這種治療的受治療者施用預(yù)防或治療上有效量的以上所限定的融合蛋白以及至少一種常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑)以及將以上所限定的融合蛋白用作藥物(尤其是抗-變應(yīng)性劑)。
按照本發(fā)明的融合蛋白可以與常規(guī)的藥學(xué)上可接受的稀釋劑和載體以及可有可無的其它賦形劑混合，經(jīng)腸胃外、靜脈內(nèi)或腸內(nèi)施用(例如經(jīng)肌內(nèi)或皮下施用)。當(dāng)然，融合蛋白的濃度隨著所使用的化合物、所需的治療和藥物形式的性質(zhì)而變化。
這樣，本發(fā)明也包括藥物組合物，其包含以上所限定的融合蛋白以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明還涉及制備針對變態(tài)反應(yīng)的藥物的方法(該方法包括將以上所限定的融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合)和以上所限定的融合蛋白在制造預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))之藥物上的用途。
本文使用了下列縮寫aCD32針對CD32的抗體(抗CD32抗體)Ag 抗原APC 抗原-呈遞細(xì)胞BCR B細(xì)胞受體BetV1主要的樺樹花粉變應(yīng)原BSA 牛血清白蛋白CNBR 氰溴化物DerP1主要的房塵螨(Dermatophagoides pteronvssinus)變應(yīng)原DPT 房塵螨抗原DTT 二硫蘇糖醇EBV Epstein-Barr病毒ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定FACS 熒光活化細(xì)胞分選儀FcγRII 人類Fcγ受體II(＝CD32)Fig. 附圖編號FPLC 快速壓力液相色譜GaM 山羊抗小鼠抗體HAc 醋酸HLA 人類白細(xì)胞抗原HPHT 羥基磷灰石IC免疫復(fù)合物Ig免疫球蛋白IL-12 白介素-12LST 淋巴細(xì)胞刺激作用試驗min 分鐘MR摩爾比PBS 磷酸鹽緩沖鹽溶液PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pNPP 對硝基苯磷酸酯sd標(biāo)準(zhǔn)偏差SPDP 3-(2-吡啶基硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯在下列說明本發(fā)明但不限制本發(fā)明的實施例中，所有溫度都是攝氏度。
實施例制備和純化Dre P1--單克隆抗CD32融合蛋白A)方法通過使用SPDP(一種雙功能偶合試劑)將Der P1共價連接到Mc.a-CD32上。簡言之，分別用SPDP(摩爾比分別為1/20和1/5)衍生化Der P1和Mc.a-CD32，以引入2-吡啶基二硫化物殘基。在溫和還原和凝膠色譜脫鹽之后，將SPDP-衍生化的Mc.a-CD32(全部二硫化物基團(tuán)被還原成巰基基團(tuán))與SPDP-衍生化的Der P1以1/1.6摩爾比一起溫育。然后，形成的DerP1-Mc.a-CD32綴合物通過在Superose-12上的凝膠過濾和在FPLC-MonoQ上的陰離子交換色譜純化。B)材料a)SPDP分子量312.4；25.61mM二甲基甲酰胺貯存溶液(8mg/ml)，就在偶聯(lián)之前制備。b)Der P1通過在共價連接到CNBR-Sepharose 4B上的Mc.a-DerP1(4C1/BS/3F8)上的免疫親和色譜純化。分子量28kD；等電點5.0(PHAST-IEF)；無菌過濾，用PBS稀釋。c)單克隆抗-CD32(IV.3)同型小鼠IgG2b-κ鏈；分子量150kD；等電點6.2(PHAST-IEF)；在Protein-A和HPHT上從培養(yǎng)基上清液純化，并用PBS透析。反應(yīng)混合物A向1.2ml Der P1溶液(0.84mg)中加入23.4μl SPDP貯存溶液(20摩爾過量)，于室溫(22℃)下在2.5ml錐形反應(yīng)瓶(Pierce)中攪拌混合物45分鐘。反應(yīng)混合物用PBS和未綴合的SPDP添加至2.5ml。在9.1mlPharmacia PD-10一次性脫鹽柱(Sephadex G-25)(用50ml PBS平衡過)上經(jīng)脫鹽除去釋放的N-羥基琥珀酰亞胺。此后用3.5ml PBS洗脫并收集含有2-吡啶基二硫化物-活化的Der P1的組分。濃度約為0.17mg/ml，相當(dāng)于0.6mg。由2-吡啶基二硫化物取代的程度的估計100μl樣品用PBS添加至150μl，加入用PBS稀釋的50μl 150mMDTT。通過測定在343nm的吸光度(摩爾消光系數(shù)8080M-1cm-1)測定加入DTT后釋放的吡啶-2-硫酮的濃度，其相當(dāng)于引入的2-吡啶基-二硫化物殘基。對測定的OD 343nm增加0.074(校正稀釋)，計算出取代的程度為1.5Mol 2-吡啶基二硫化物/Mol Der P1。反應(yīng)混合物B向0.5ml Mc.a-CD32溶液(4.2mg)中加入5.5μl SPDP貯存溶液(5摩爾過量)，在室溫下攪拌混合物45分鐘。將反應(yīng)混合物加到2.5ml Pierce GF-5一次性脫鹽柱(用10ml 0.1M乙酸鈉/HAc緩沖液，0.1M NaCl，pH 4.5平衡過)上，此后，用1.5ml乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)洗脫并收集脫鹽的組分，用0.22μm MILLEX-GV(低蛋白結(jié)合)濾器過濾。SH-基團(tuán)的引入
通過用DTT還原將蛋白質(zhì)-結(jié)合的2-吡啶基二硫化物基團(tuán)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)-結(jié)合的巰基基團(tuán)。于室溫在攪拌下將1.5ml脫鹽樣品與1ml 62.5mMDTT(用乙酸鹽緩沖液稀釋)一起溫育30分鐘(最終DTT濃度25mM)。因為在酸性pH下，2-吡啶基二硫化物增加其親電性(electrophilicity)，在低的pH下還原仍能進(jìn)行，而天然蛋白質(zhì)二硫鍵不受影響。
對測定的OD 343nm增加0.447，計算出取代的程度為7Mol巰基基團(tuán)/Mol Mc.a-CD32。
將反應(yīng)混合物加到Pharmacia PD-10柱(用50ml PBS平衡過)上，此后，用3.5ml PBS洗脫并收集脫鹽的組分。用CENTRIPLUS-10(YM10膜)濃縮器將樣品濃縮到0.6ml。濃度約為3.1mg/ml，相當(dāng)于1.86mg。C)偶聯(lián)方法將3.3ml(0.56mg)Der P1(吡啶-二硫化物活化的)和0.6ml(1.86mg)Mc.a-CD32(SH-活化的)混合，在5ml Pierce反應(yīng)瓶中在室溫(22℃)下攪拌2小時，在+4℃攪拌15小時。在反應(yīng)混合物中Der P1/Mc.a-CD32的分子比是1.6/1。通過測定由于釋放的吡啶-2-硫酮的增加引起的OD 343nm的增加來監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)時間 OD(343nm)開始 0.111215分鐘 0.125730分鐘 0.134245分鐘 0.141260分鐘 0.147075分鐘 0.1519120分鐘 0.1590D)綴合物的純化Superose-12用一個0.22μm MILLEX-GV濾器過濾反應(yīng)混合物(3.9ml)，并用Centriplus-10濃縮器濃縮至0.5ml。綴合物的最終濃度是3.7mg/ml，相當(dāng)于1.9mg。
將樣品加到用PBS平衡過的Superose-12(HR10/30)柱(Pharmacia)上。柱床體積24ml；流速0.2ml/分鐘；體積/組分0.4ml；記錄圖表速度1.5mm/分鐘；壓力0.3MPa；掃描波長280nm。將洗脫的高分子量組分按照洗脫輪廓分成3組1.2ml A組 組分#21-231.2ml B組 組分#24-261.2ml C組 組分#29-31將各組無菌過濾(0.22μm MILLEX-GV)，并于+4℃在無菌條件下貯存?？偟鞍踪|(zhì)濃度約為A組100μg/ml；B組200μg/ml；C組390μg/ml。FPLC-Mono O1ml C組(390μg)用20mM乙醇胺/HCl，0.01％NaN3緩沖液pH 9.0透析，經(jīng)在FPLC-Mono Q(HR5/5)陰離子交換劑上的離子交換色譜純化。起始緩沖液A20mM乙醇胺/HCl，0.01％NaN3pH 9.0；限制緩沖液BA+0.5M NaCl pH 9.0；流速1ml/分鐘，體積/組分1ml；記錄圖表速度5mm/分鐘；壓力1.2Mpa；掃描波長280nm。此后，開始一個線性梯度程序30分鐘(傳導(dǎo)率50-1260μS/cm)。相關(guān)的峰在組分#8中洗脫(在340μS/cm下)。蛋白質(zhì)濃度約為45μg/ml(OD 280nm，E1％14.0)。用PBS透析樣品并無菌過濾。最終純化的物質(zhì)的蛋白質(zhì)濃度為20μg/ml(OD 280nm)。E)分析測定a)總蛋白質(zhì)濃度按照Bradford的方法，使用BIO-RAD蛋白質(zhì)測定試劑盒I估計總蛋白質(zhì)濃度；標(biāo)準(zhǔn)品牛IgG。b)經(jīng)ELISA測定Der P1、Mc.a-CD32和Der P1-Mc.a-CD32綴合物在PVC微滴板上進(jìn)行固相ELISA。將涂布緩沖液0.1MNaHCO3/Na2CO3，0.01％NaN3pH 9.6，具有0.05％Tween-20的PBS用作洗滌溶液，2％在洗滌緩沖液中的胎牛血清用作樣品、生物素和酶綴合物的稀釋劑。底物是用1M二乙醇胺/HCl緩沖液(pH 9.8)稀釋的1mg/mlp-NPP。終止溶液是2M NaOH。在人源化的腔室中進(jìn)行所有的溫育。樣品加工和在405nm的OD讀數(shù)的設(shè)備是Beckman Biomek-1000實驗室工作站。定量評價Beckman Immunofit；曲線擬合4-參數(shù)推理。b)1)測定Der P1(圖7)涂布100μl/孔Mc.a-Der P1(5H8)10μg/ml，在+4℃過夜。洗滌后，加入100μl/孔樣品a)Der P1(偶聯(lián)的起始物質(zhì))(250-0.49ng/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)品b)Superose-12A組(4000-7.81ng/ml)c)Superose-12B組(4000-7.81ng/ml)d)Superose-12C組(4000-7.81ng/ml)于+37℃溫育2小時。洗滌后，以100μl/孔加入1/500稀釋的Mc.a-DerP1(4C1/B8/3F8)-生物素綴合物，在+37℃溫育2小時。洗滌后，以50μl/孔加入1/1000稀釋的抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶綴合物，在+37℃溫育1小時。洗滌后，以100μl/孔加入底物，在37℃溫育60分鐘并終止。從標(biāo)準(zhǔn)曲線定量評價Superose-12A組16.1μg/mlSuperose-12B組54.9μg/mlSuperose-12C組135μg/mlb)2)測定Mc.a-CD32(小鼠IgG2b)(圖8)涂布100μl/孔山羊Pc.a-小鼠IgG2b(Southern)5μg/ml，在+4℃過夜。洗滌后，以100μl/孔加入樣品a)Mc.a-CD32(偶聯(lián)的起始物質(zhì))(1000-1.96ng/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)品b)Superose-12A組(8000-15.63ng/ml)c)Superose-12B組(8000-15.63ng/ml)d)Superose-12C組(8000-15.63ng/ml)在+37℃溫育2小時。洗滌后，以50μl/孔加入1/1000稀釋的山羊Pc.a-小鼠IgG2b-堿性磷酸酶綴合物(Southern)，在+37℃溫育2小時。洗滌后，以100μl/孔加入底物，在室溫下溫育15分鐘并終止。從標(biāo)準(zhǔn)曲線定量評價Superose-12A組17.7μg/mlSuperose-12B組58.8μg/mlSuperose-12C組190μg/ml按照ELISA評價Der P1/Mc.a-CD32在綴合物中的摩爾比Superose-12A組4.9/1
Superose-12B組5.0/1Superose-12C組3.8/1b)3)Der P1--Mc.a-CD32綴合物的檢測b)3)1)涂布Mc.a-Der P1(小鼠IgG2a)(圖9)涂布100μl/孔Mc.a-Der P1(5H8)10μg/ml，在+4℃過夜。洗滌后，以100μl/孔加入樣品a)Der P1(偶聯(lián)的起始物質(zhì))(4000-7.81ng/ml)b)Superose-12A組(4000-7.81ng/ml)c)Superose-12B組(4000-7.81ng/ml)d)Superose-12C組(4000-7.81ng/ml)在+37℃溫育2小時。洗滌后，以50μl/孔加入1/1000稀釋的山羊Pc.a-小鼠IgG2b-堿性磷酸酶綴合物(Southern)，在+37℃溫育2小時。洗滌后，以100μl/孔加入底物，在室溫下溫育30分鐘并終止。通過Mc.a-CD32在各Superose-12純化組分組中的分配檢測Mc.a-Der P1-結(jié)合的Der P1--Mc.a-CD32綴合物。b)3)2)涂布Pc.a-小鼠1gG2b(圖10)涂布100μl/孔山羊Pc.a-小鼠IgG2b(Southern)5μg/ml，在+4℃過夜。洗滌后，以100μl/孔加入樣品a)Der P1(偶聯(lián)的起始物質(zhì))(1000-1.95ng/ml)b)Superose-12A組(8000-15.63ng/ml)c)Superose-12B組(8000-15.63ng/ml)d)Superose-12C組(8000-15.63ng/ml)在+37℃溫育2小時。洗滌后，以100μl/孔加入1/500稀釋的Mc.a-DerP1(4C1/B8/3F8)-生物素綴合物(小鼠IgGI)，在+37℃溫育2小時。洗滌后，以50μl/孔加入1/1000稀釋的抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶綴合物，在+37℃溫育1小時。洗滌后，以100μl/孔加入底物。在37℃溫育60分鐘并終止。通過Der P1在各Superose-12純化組分組中的分配檢測Pc.a-小鼠IgG2b-結(jié)合的Der P1--Mc.a-CD32綴合物。c)經(jīng)天然聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳測定Der P1--Mc.a-CD32綴合物的分子量用天然PHAST凝膠4-15％梯度(Pharmacia)(分離范圍1000kD-150kD)，與天然高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(試劑盒，Pharmacia)比較估測在Superose-12純化組分組中的Der P1--Mc.a-CD32綴合物的分子量。檢測銀染(銀染試劑盒，Pharmacia)(圖.11)評價Superose-12A組在MW 700kD的帶Superose-12B組在MW 460kD，330kD的帶Superose-12C組在MW 330kD，170kD的帶最終FPLC-Mono Q純化的Der P1--Mc.a-CD32綴合物的分子量估計為330kD(圖12)。F)試驗結(jié)果a)采用aCD32 Der P1融合蛋白的T細(xì)胞克隆CFTS43.1的抗原-特異性刺激作用用標(biāo)準(zhǔn)的LST以不同濃度將以上與純化的Der P1化學(xué)交聯(lián)的aCD32(Medarex克隆IV.3)用于刺激Der P1-特異性T細(xì)胞克隆CFTS43.1。在第一組試驗中，使用化學(xué)融合制備的A組和B組，A組含有700kD(與10個Der P1分子融合的2個aCD32分子)的單一帶，B組由460kD和330kD的兩個帶(分別為1個aCD32與10個Der P1，和1個aCD32與5個Der P1分子)組成。
在第二組試驗中，使用C組的純化蛋白質(zhì)，其由約330kD的單一帶(1個aCD32分子與5個分子的Der P1融合)組成。將單核細(xì)胞和B細(xì)胞在室溫下與圖13a和13b所示的各種組分一起預(yù)溫育1小時。作為對照刺激，在完全培養(yǎng)期間將100μg/ml DPT加入到T細(xì)胞加抗原呈遞細(xì)胞中。B細(xì)胞能夠刺激具有DPT但不具有A組，B組或C組的CFTS43.1，而單核細(xì)胞能夠刺激具有DPT和具有A組，B組和C組的CFTS43.1。這證實了有關(guān)以上所稱的天然IgG變應(yīng)原復(fù)合物的以前的發(fā)現(xiàn)。此外，這也表明，對由單核細(xì)胞CD32引起的抗原刺激，交聯(lián)不是必需的，因為所有組分完全等同地刺激T細(xì)胞。b)IgE合成的抑制在存在和不存在市售的aCD32抗體(以所示的濃度(圖14)添加)下用aCD40和IL-4刺激純化的人類扁桃體B細(xì)胞。9天后，將培養(yǎng)物上清液用于試驗IgE和IgG1含量。所有aCD32抗體以劑量依賴性方式抑制IgE以及IgGI產(chǎn)生。圖15顯示，即使是Medarex克隆IV.3的Fab片段也能夠抑制IgE合成。這說明，不由其BCD活化的B細(xì)胞經(jīng)與CD32的單體相互作用阻斷其抗體產(chǎn)生。對以抗原-特異性方式刺激的B細(xì)胞，在CD32和BCR之間的共交聯(lián)是必需的。這意味著，在例如B細(xì)胞通過IgE和CD23吸收抗原(如Der F1)，接著成為刺激的Der P1-特異性Th2細(xì)胞，導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生IgE的變態(tài)反應(yīng)中，在B細(xì)胞表面的與CD32的相互作用可以使得這些B細(xì)胞停止產(chǎn)生。事實上，即使在相關(guān)的B細(xì)胞T細(xì)胞相互作用中，aCD32抗體阻斷抗體合成(圖16)。
表1
在存在或不存在5μg/ml聚集的人類IgG(涂布到各孔，在4℃下過夜)和/或10μg/ml單克隆小鼠抗-人類aCD32(Medarex IV.3)下，將經(jīng)淘析來源于正常供體的單核細(xì)胞(91％CD14陽性)與100 U/ml IFN-γ溫育24小時，接著染色用于指示標(biāo)記的FACS分析。IFN-γ-誘導(dǎo)的CD80和CD40上調(diào)作用可以被強(qiáng)的受體與單核細(xì)胞上的聚集的人類IgG交聯(lián)抑制。用aCD32的預(yù)溫育被聚集的人類IgG抵消，說明1)由聚集的人類IgG引起的抑制通過CD32介導(dǎo)，和2)僅僅對CD32的結(jié)合不引起輔助受體的下調(diào)。
HLA-DR表達(dá)不受處理的影響。


圖1Der-P1-(3)NIP復(fù)合物對有關(guān)抗原呈遞的CD23的結(jié)合A圖＝熒光；B圖＝增殖。
用預(yù)形成的IC′s脈沖EBV B細(xì)胞，所述IC′s由恒定濃度的IgE(▲7.5μg/ml，●5.0μg/ml，■2，5μg/ml)和可變濃度的Der-P1-(3)NIP組成。
A圖顯示了預(yù)形成的IC′s與B細(xì)胞的結(jié)合。具有相同MR的IC′s用一條線連接，實際MR(0.1，0.25，0.5，1，7)以靠近線的阿拉伯?dāng)?shù)字表示。在Der P1濃度約為0.2μg/ml時，IgE結(jié)合達(dá)到平臺(plateau)。不存在DerP1-(3)NIP時的IgE結(jié)合用右邊Y-軸上的有點方框表示。
B圖顯示了由用相同的IC′s脈沖的照射的EBV-B細(xì)胞的抗原呈遞。這里，連接線表示用相同IgE濃度制成的復(fù)合物，以強(qiáng)調(diào)抗原呈遞不受IC′s的MR影響(相關(guān)系數(shù)＝0.96)。單體復(fù)合物[各線的最高Der P1-(3)NIP濃度]也被有效地呈遞給T細(xì)胞。在不存在IgE分子時，用任何使用的DerP1-(3)NIP濃度(黑色區(qū)域)都沒有T細(xì)胞刺激。數(shù)據(jù)顯示在第5天的3H-胸苷摻入(三重孔的平均值±sd)。圖2與非脈沖的B細(xì)胞的抗原呈遞比較在整個刺激期間留在培養(yǎng)介質(zhì)中的游離Der P1-(2)NIP誘導(dǎo)T細(xì)胞的劑量依賴性刺激。將自體固有的(照射的)EBV-B細(xì)胞用作抗原-呈遞細(xì)胞。存在于復(fù)合物中的IgE不明顯增強(qiáng)抗原呈遞，但I(xiàn)gGI和IgG3兩者存在于IC′s中阻止Der P1-(2)NIP的抗原呈遞給T細(xì)胞(與游離的Der P1-(2)NIP比較)。結(jié)果以第5天的3H-胸苷摻入表示(三重孔的平均值±sd)。圖3IgG-Der P1-(3)NIP復(fù)合物的抗原呈遞抑制作用在不存在IgG3時，使用IgE-Der P1-(3)NIP復(fù)合物發(fā)現(xiàn)良好的T細(xì)胞刺激作用。以相同(1∶1)比率的預(yù)先形成的IgG3-Der P1-(3)NIP復(fù)合物滴定導(dǎo)致IgE-介導(dǎo)的抗原呈遞的劑量依賴性抑制作用。為了獲得這一作用，在T細(xì)胞刺激時需要IgG3復(fù)合物存在于培養(yǎng)基中。由于IgG3對B細(xì)胞上的CD32的低親和性，用IgG3復(fù)合物B細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)或“脈沖”是不成功的。不存在IgE和也用IgG3-BSA-(3)NIP復(fù)合物時，觀察到類似的抗原呈遞抑制作用。圖4新鮮人類單核細(xì)胞的IgG3-介導(dǎo)的抗原呈遞在不存在或存在非相關(guān)的聚集人類IgG時，在冰上用預(yù)先形成的IgG3-Der P1-(3)NIP復(fù)合物脈沖人類單核細(xì)胞(比率1∶1)1小時。接著洗滌脈沖的單核細(xì)胞，并與Der P1特異性HLA-DP相配的T細(xì)胞克隆混合。5天后，以3H-胸苷摻入測定增殖。由人類單核細(xì)胞呈遞的IgG3復(fù)合物誘導(dǎo)變應(yīng)原-特異性T細(xì)胞反應(yīng)，其可以被聚集的IgG阻斷，說明IgG3與單核細(xì)胞相互作用的特異性。數(shù)據(jù)以三重孔的平均值±sd表示。圖5DPT-特異性T細(xì)胞增殖；aCD32或聚集的人類IgG對抗原呈遞的影響用(實心條)或不用(空心條)250μg/ml DPT脈沖人類EBV B細(xì)胞一夜。照射后，將B細(xì)胞與Der P1-特異性T細(xì)胞克隆的T細(xì)胞混合，使細(xì)胞增殖5天。在存在不同濃度的由GaM交聯(lián)的aCD32抗體時，觀察到劑量依賴性增殖抑制作用。當(dāng)aCD32或非-特異性聚集人類IgG涂布到培養(yǎng)孔時觀察到相同的作用。圖6來源于噬菌體展示文庫的aCD32 scFv(Fab)片段之間的重組融合蛋白的例子可以從噬菌體展示文庫(例如De Kruif等，美國科學(xué)院學(xué)報，92(1995)3938-3942所描述的)獲得Fab片段。然而，與人類CD32有效相互作用的任何分子(或分子的一部分)可以替代aCD32 Fab片段。變應(yīng)原可以是任何引起變態(tài)反應(yīng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組合體。此外，變應(yīng)原可以由含有T細(xì)胞表位的變應(yīng)原片段替代。重組蛋白質(zhì)可以由任何可用的不依賴于糖基化和其它翻譯后修飾的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。這種融合蛋白質(zhì)也可以用于以(過度)產(chǎn)生不希望的Ig分子為特征的疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，移植物宿主排斥(graft-versus-host)病)或其中自身抗體發(fā)揮作用的任何其它疾病。在這些情況下，變應(yīng)原可以由簡單的非限定的接頭替代，以組合兩種aCD32部分。然而，當(dāng)變應(yīng)原由引起疾病的“自身抗原”替代時可以獲得最好的結(jié)果。圖7經(jīng)夾心-ELISA測定Superose-12純化的Der P1--Mc.a-CD32綴合物組分組中的Der P1圖8經(jīng)夾心-ELISA測定Superose-12純化的Der P1--Mc.a-CD32綴合物組分組中的Mc.a-CD32圖9經(jīng)夾心-ELISA測定Superose-12純化的組分組中的Der P1--Mc.a-CD32綴合物涂布Mc.a-Der P1。圖10經(jīng)夾心-ELISA測定Superose-12純化的組分組中的Der P1--Mc.a-CD32綴合物涂布Pc.a-小鼠IgG2b。圖11A.、B和C組組分的銀染泳道1350ng Der P1泳道250ng Mc.a-CD32泳道3500ng 高分子量標(biāo)記泳道4500ng Superose-12的起始物質(zhì)泳道5100ng Superose-12A組泳道6100ng Superose-12B組泳道7200ng Superose-12C組泳道8250ng 高分子量標(biāo)記高分子量標(biāo)記669kD甲狀腺球蛋白440kD鐵蛋白232kD過氧化氫酶140kD乳酸脫氫酶67kD牛血清白蛋白圖12C組純化的融合蛋白的銀染泳道1250ng高分子量標(biāo)記泳道245ng FPLC Mono-S純化的物質(zhì)。圖13a和13bAg-特異性T細(xì)胞增殖圖13aAPC-Mo 250495和CFB42圖13b單體純化的CD32/Der P1的影響使用標(biāo)準(zhǔn)的LST[Van Reijsen，F(xiàn).C.等，(1992)變態(tài)反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志，90 184]，以不同的濃度將與純化的Der P1化學(xué)交聯(lián)的aCD32(Medarex克隆IV.3)用于刺激Der P1-特異性T細(xì)胞克隆CFTS43.1。在第一組實驗(圖13a)中，使用化學(xué)融合制備的A組和B組A組含有700kD的單一帶(為2個aCD32分子與10個Der P1分子融合)，B組由在460kD和330kD(分別為1個aCD32與10個Der P1，和1個aCD32與5個Der P1分子融合)的兩個帶組成。
在第二組實驗(圖13b)中，使用C組純化蛋白質(zhì)(CP230595)，由約330kD(1個aCD32分子與5個分子的Der P1融合)的單一帶組成。
將單核細(xì)胞和B細(xì)胞在室溫下與圖中所示各種組分一起預(yù)溫育1小時。作為對照刺激，在完整的培養(yǎng)期間將100μg/ml DPT加入到T細(xì)胞加抗原-呈遞細(xì)胞中。按照描述(Van Reijsen等，同上)，在5天后以3H-胸苷摻入測定T細(xì)胞刺激(4孔平均值±sd)。B細(xì)胞能夠刺激CFTS43.1(有DPT但沒有A組，B組，或C組)，而單核細(xì)胞能夠刺激CFTS43.1(有DPT和有A組，B組，和C組)。這相應(yīng)于用天然IgG變應(yīng)原復(fù)合物的以前的發(fā)現(xiàn)[Bheekha Escura，R.等，免疫學(xué)(1995)86 343]。此外，這說明，對單核細(xì)胞的抗原刺激，多于兩個CD32分子的交聯(lián)不是必需的，因為所有組分在刺激T細(xì)胞上是等效的。圖14IgE和IgG1各自的合成抑制作用在存在和不存在市售的aCD32抗體(以所示的濃度添加)下，如Armerding，D.等，免疫生物學(xué)，188(1993)259-273所述，用aCD40和IL-4刺激純化的人類扁桃體B細(xì)胞。9天后，按照描述(Armerding，D.等，同上)將培養(yǎng)物上清液用于試驗IgE和IgG1含量。結(jié)果以9次重復(fù)的3組組分的抗體產(chǎn)生表示(平均值±sd)。所有aCD32抗體以劑量依賴性方式抑制IgE以及IgG1產(chǎn)生。IgM和IgA的抑制作用是相似的。圖15IgE合成的抑制在存在和不存在市售的aCD32抗體(Medarex IV.3)或其Fab片段(以所示的濃度添加)下，如Armerding，D.等，同上所述，用aCD40和IL-4刺激純化的人類扁桃體B細(xì)胞。9天后，按照描述(Armerding，D.等，同上)將培養(yǎng)物上清液用于試驗IgE和IgG1含量。結(jié)果以9次重復(fù)的3組組分的抗體產(chǎn)生表示(平均值±sd)。完整的Medarex克隆IV.3或其Fab片段兩者都能夠抑制IgE合成(IgG1，IgM和IgA)。圖16DPT特異性IgE誘導(dǎo)；aCD32的影響用(實心條)或不用(空心條)250μg/ml DPT脈沖人類扁桃體B細(xì)胞一夜。在照射后，將B細(xì)胞與Der P1-特異性T細(xì)胞克隆(CFTS43.1)的T細(xì)胞混合，使細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗體9天。9天后，按照Armerding，D.等，同上的描述將培養(yǎng)物上清液用于試驗IgE和IgG1含量。結(jié)果以9次重復(fù)的3組組分的抗體產(chǎn)生表示(平均值±sd)。在存在不同濃度的aCD32抗體時，觀察到劑量依賴性IgE產(chǎn)生抑制作用。這說明即使是相關(guān)的B細(xì)胞T細(xì)胞相互作用，aCD32抗體也阻斷抗體合成。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Sandoz有限公司。
(B)街道Lichtstrasse 35(C)城市Basle(E)國家瑞士(F)郵區(qū)代碼(ZIP)CH-4002(G)電話61-324 5269(H)傳真61-322 7532(A)姓名Mudde，Geert C.
(B)街道Ruzickagasse 88-104/Haus 39(C)城市維也納(E)國家奧地利(F)郵區(qū)代碼(ZIP)A-1230(ii)發(fā)明名稱融合蛋白(iii)序列數(shù)2(iv)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0版本#1.25(EPO)(v)當(dāng)前申請的數(shù)據(jù)申請?zhí)朩O PCT/EP96/......
(vi)在先申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朑B 9516760.7(B)申請日16-8-1995(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(iii)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)有機(jī)體Dermatophagoides pteronyssinus(xi)序列描述SEQ ID NO1Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1 5 10 15Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala20 25 30Gln Pro Gln Arg Tyr Cys Arg His Tyr Trp Thr35 40(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)否(iii)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)有機(jī)體Dermatophagoides pteronyssinus(xi)序列描述SEQ ID NO2Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1 5 10 15Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu20 25 30
權(quán)利要求
1.融合蛋白，其包含a)一種或多種抗原和b)一種或多種與人類Fcγ受體II(FcγRII)(CD32)相互作用的部分。
2.按照權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說的抗原是在特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻炎或變應(yīng)性結(jié)膜炎中的變應(yīng)原。
3.按照權(quán)利要求1的融合蛋白，其是從一種或多種包含T細(xì)胞表位的DNA骨架產(chǎn)生的，而不是從完全抗原的基因產(chǎn)生的。
4.按照權(quán)利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所說的與FcγRII相互作用的部分是人類或人源化aCD32抗體，或仍然特異性地識別并結(jié)合到FcγRII(CD32)抗原上的這些抗體的部分。
5.按照權(quán)利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所說的與FcγRII相互作用的部分是人類或人源化IgG抗體，或仍然特異性地識別并結(jié)合到FcγRII(CD32)抗原上的這些抗體的部分。
6.按照權(quán)利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所說的與FcγRII相互作用的部分是操作過的人類或人源化aCD32或IgG抗體或其部分，其以比天然aCD32或IgG抗體更高的親和性識別FcγRII(CD32)。
7.藥物組合物，其包含按照權(quán)利要求1的融合蛋白以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
8.生產(chǎn)按照權(quán)利要求1的融合蛋白的方法，該方法包括使用重組基因技術(shù)或化學(xué)交聯(lián)。
9.按照權(quán)利要求1的融合蛋白在預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))上的用途。
10.按照權(quán)利要求1的融合蛋白在制造預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))的藥物上的用途。
11.用作藥物的按照權(quán)利要求1的融合蛋白。
12.治療變態(tài)反應(yīng)的方法，該方法包括對需要這種治療的受治療者施用預(yù)防或治療上有效量的按照權(quán)利要求1的融合蛋白以及至少一種常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
13.制備針對變態(tài)反應(yīng)的藥物的方法，該方法包括將按照權(quán)利要求1的融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。
全文摘要
包含一種或多種抗原和一種或多種與人類Fcγ受體Ⅱ(FcγRⅡ)(CD32)相互作用的部分的融合蛋白。
文檔編號A61K31/00GK1193353SQ96196311
公開日1998年9月16日 申請日期1996年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月16日
發(fā)明者G·C·穆德 申請人:諾瓦提斯公司