專利名稱：喜樹堿衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通式(I)表示的喜樹堿衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽，其制備方法以及包含該物質(zhì)作為活性成分的抗腫瘤藥物
其中
R是氫或-(CH2)2-NR1R2，(R1是氫或胺地常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)；
n是1或2；R3是氫或-OR4[R4是氫或O＝C-R5(R5是甲基或CH3OCH2-)；O＝NHR6(R6是異丙基，苯基或-CH2CH2Cl.)；CH2OR7(R7是甲基，乙基或CH3OCH2CH2-)]；
其中，如果n是2，而R4是氫，則R不是氫；
如果n是2，而R3是H，則R不是氫；而且
如果R是-CH2CH2NHCH3，則R3不是氫。
背景技術(shù)：
自從Wall及其合作者從中國(guó)樹Camptotheca acuminata中分離出喜樹堿(J.Am.Chem.Soc.，1966，88，3888)以來，已有許多的合成喜樹堿的方法。但是由于在1970年進(jìn)行的第一次臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)喜樹堿的毒性非常大，開發(fā)喜樹堿作為有效的抗腫瘤藥物是不成功的。
此后，Liu等人于1985年報(bào)道，喜樹堿對(duì)抑制topoisomerase I具有特定的作用模式。因此，大家的興趣又都注意到此化合物。特別是因?yàn)閠opoisomerase I抑制劑本身沒有在臨床上使用，所以希望通過實(shí)際的研究，喜樹堿可以與其他具有不同作用模式的抗腫瘤化學(xué)治療劑非常有效地復(fù)合使用。
近來，為降低喜樹堿的毒性以及進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤活性，已有人提出各種的對(duì)喜樹堿衍生物的研究。在這些相關(guān)的研究中，日本的Yakurt-Honsha Co.于1986年合成了CPT-11(Irinotecan)，對(duì)此的臨床試驗(yàn)表明，該藥物具有優(yōu)異的抗腫瘤活性而毒性非常低(日本專利申請(qǐng)公開No.64-61482)，此后其他的制藥公司也開發(fā)出一些相關(guān)的藥物，如Smithkline Beecham的Topotecan以及Glaxo的MDO-喜樹堿和9-氨基喜樹堿。在它們之中，CPT-11已上市。特別令人矚目的是，所述的CPT-11化合物在治療不可治愈的固形腫瘤如肺癌中具有優(yōu)異的抗腫瘤活性。
由于此后開發(fā)的大多數(shù)喜樹堿衍生物都是半合成的，也就是說對(duì)喜樹堿進(jìn)行化學(xué)修飾而得到的，但是在獲得喜樹堿上有一定的困難，而且由于所述化學(xué)修飾的限制，研究各種結(jié)構(gòu)的衍生物也是比較困難的。另外，這些已報(bào)道的全合成方法從化學(xué)和光學(xué)收率來看不是令人滿意的。
本發(fā)明公開
因此，通過對(duì)由所述通式(I)表示的一系列新化合物的全合成以及隨后的體外試驗(yàn)，本發(fā)明者確認(rèn)這些具有不同作用模式的化合物都可用作有效的抗腫瘤藥物。由此，本發(fā)明得以實(shí)現(xiàn)。
喜樹堿是一個(gè)稠環(huán)系統(tǒng)，由喹啉(A和B)稠合吡咯烷環(huán)(C)、吡咯環(huán)再稠合α-吡啶酮環(huán)(D)、而α-吡啶酮環(huán)再按順序稠合內(nèi)酯環(huán)(E)而構(gòu)成的。
特別是，進(jìn)一步對(duì)喜樹堿抑制topoisomerase I的作用模式以及開發(fā)出的各種結(jié)構(gòu)的喜樹堿衍生物進(jìn)行了仔細(xì)的研究，而且試圖對(duì)喜樹堿之B環(huán)或E環(huán)的取代基進(jìn)行修飾。
考慮到通常開發(fā)出的衍生物由于水溶性極差而具有一些如惡心、嘔吐和膀胱炎之類的副作用，在喜樹堿的B環(huán)上引入側(cè)鏈，以增強(qiáng)其溶解度。因此，在喜樹堿的7位上引入包括氨基的側(cè)鏈。
Crow提出的作用模式是喜樹堿與topoisomerase I共價(jià)結(jié)合(J.Med.Chem.，1992，35，4160-4164)，所以試圖對(duì)喜樹堿的E環(huán)進(jìn)行修飾以增強(qiáng)其反應(yīng)性。
以下更為詳細(xì)地描述根據(jù)本發(fā)明制備喜樹堿衍生物及其中間體的方法。
基于實(shí)施例的化合物是根據(jù)如下路線1的本發(fā)明的實(shí)施方案來制備的。
路線1
其中，
R，n和R3與上述的相同，而R′是氫或-(CH2)2-NR1R2；R1是胺的常規(guī)保護(hù)基；R2與上述的相同。氨基酮化合物(II)與三環(huán)酮(III)進(jìn)行Friedlander縮合反應(yīng)生成通式(I)表示的化合物[Organic reactions，28，37-202，Wiley&Sons Inc，New York(1932)]。
化合物(II)與(III)的縮合通常是在室溫或加熱條件下，在有酸存在時(shí)進(jìn)行的。
以下惰性溶劑可用于反應(yīng)之中而不會(huì)影響反應(yīng)，例如芳香烴(甲苯、苯、二甲苯等)，鹵代烴(二氯甲烷、氯仿、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷等)，低級(jí)醇，胺(N，N-二甲基甲酰胺)，或乙酸。
該反應(yīng)還可使用無機(jī)酸(鹽酸或硫酸)或有機(jī)酸(甲磺酸，三氟甲磺酸，對(duì)甲苯磺酸，乙酸等)。
反應(yīng)時(shí)間范圍是1-48小時(shí)，反應(yīng)溫度為30-150℃。
作為典型的反應(yīng)條件，最優(yōu)選的是在對(duì)甲苯磺酸存在時(shí)在甲苯中進(jìn)行回流。
在合成通式(I)時(shí)，如果R是-CH2CH2NHR2(R1為氫)，所述的氨基保護(hù)基通過使用鉑或鈀的催化氫化來脫除。
如果在化合物(II)中R′是氫，化合物(I)是在根據(jù)已知方法(Chem.Ber.76，1099(1943))將化合物(II)的羰基通過用1，2-亞乙基二醇縮醛化或者是用對(duì)甲苯胺形成shiff堿保護(hù)之后得到的。
在化合物(III)中如果R3是羥基，如此得到的其中R3為羥基的化合物(I)與R5COCl、R6NCO和R7OCH2Cl等試劑反應(yīng)，使化合物(I)中的R3羥基得到相應(yīng)的修飾。
特別是，如果使用R6NCO，通式(I)表示的化合物可通過使用催化劑量的錫絡(luò)合物(如二正丁基錫二乙酸酯)來得到。
氨基酮(II)根據(jù)路線2來制備。
路線2
其中，R′，R1和R2與上述的相同。
如下制備本發(fā)明之新的氨基酮化合物(II)
2′-硝基乙酰苯與單烷基胺(如乙胺、丙胺或異丙胺)、單芳基胺(如芐胺)或二烷基胺(如嗎啉、哌啶或二乙胺)反應(yīng)，在濃乙酸存在下，通過與仲甲醛的Mannich反應(yīng)生成化合物(IV)。
該反應(yīng)在30-80℃下進(jìn)行1-48小時(shí)。
如果化合物(IV)具有單烷基胺或單芳基胺時(shí)，引入胺的常規(guī)保護(hù)基，生成所述化合物(IV)。
根據(jù)本發(fā)明，Cbz是優(yōu)選的胺保護(hù)基。
化合物(IV)用在低級(jí)醇溶劑中的連二亞硫酸鈉處理，生成化合物(II)。
反應(yīng)在30-100℃下進(jìn)行1-10小時(shí)。
如下述路線3，可由已知化合物(IX)制備本發(fā)明的新三環(huán)酮(III)。
對(duì)于化合物(III)，三環(huán)酮(n是2，R3是H)是根據(jù)常規(guī)方法(美國(guó)專利4，894，456(1990))制備的已知化合物。
路線3
其中，R3，n，R5和R6與上述的相同，而R8是羥基的常規(guī)保護(hù)基。
在α-烷基化反應(yīng)期間，如果n為2，化合物(IX)與堿如KOtBu或NaH在惰性溶劑中反應(yīng)，所述惰性溶劑包括N，N-二甲基甲酰胺和1，2-二甲氧基乙烷。然后，反應(yīng)混合物與用四氫吡喃基、甲氧基甲基或甲氧基乙氧基甲基保護(hù)的2-溴乙醇反應(yīng)，生成化合物(VIII)。
該反應(yīng)優(yōu)選在30-60℃下進(jìn)行18-48小時(shí)。
同時(shí)，如果n是1，使用甲醛在醇溶劑中進(jìn)行α-烷基化反應(yīng)，然后用羥基的常規(guī)保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)，生成化合物(VIII)。
本發(fā)明優(yōu)選的保護(hù)基是甲氧基甲基或甲氧基乙氧基甲基。
化合物(VII)是通過使用Raney鎳作為催化劑在乙酸和乙酐共溶劑中還原化合物(VIII)而得到的。
該反應(yīng)在30-80℃下進(jìn)行1-10小時(shí)。
經(jīng)過亞硝基化合物的重排是通過化合物(VII)與亞硝酸鈉在乙酐和乙酸的共溶劑中在0-50℃下反應(yīng)1-24小時(shí)而進(jìn)行的。由此得到的亞硝基化合物在如CCl4的溶劑中于60-90℃下回流5-18小時(shí)，生成化合物(VI)。
如果n是1或2，二酯(VI)的反應(yīng)路線則略有不同。如果n是2，化合物(VI)于堿性水溶液如在甲醇中的LiOH、NaOH和KOH中水解，然后用酸性水溶液如乙酸和鹽酸處理，生成化合物(Vc)。
所述水解在0-50℃下進(jìn)行30分鐘-5小時(shí)。
在酸性水溶液中的內(nèi)酯化在0-50℃下進(jìn)行1-48小時(shí)。
化合物(Vc)用在胺溶劑如N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二甲基乙酰胺中的堿如KOtBu處理，然后在亞磷酸三乙基酯下用氧氣泡進(jìn)行氧化，生成化合物(V)。
該反應(yīng)在-10到50℃下進(jìn)行30分鐘-5小時(shí)。
同時(shí)，如果n是1，化合物(VI)在芳香烴溶劑如苯，甲苯或二甲苯中用有機(jī)堿如DBU、DBN或三乙基胺處理，生成化合物(Va)。
該反應(yīng)在0-100℃下進(jìn)行10分鐘-5小時(shí)。
化合物(Va)在吡啶溶劑中用OsO4處理，生成化合物(Vb)。該反應(yīng)在10-50℃下進(jìn)行1-10小時(shí)?；衔?Vb)的內(nèi)酯化如上所述進(jìn)行。
如果n是2，化合物(V)用酸處理，生成化合物(III)。該反應(yīng)在10-80℃下進(jìn)行30分鐘-10小時(shí)。如果化合物(V)中n是1，為制備化合物(III)，所述的去羧酮反應(yīng)(deketalization)是在通過用R5C＝OCl、R6NCO處理引入取代基之后進(jìn)行的。
如果本發(fā)明化合物(I)中R是CH2CH2NR1R2，二級(jí)胺轉(zhuǎn)化為無機(jī)酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等)或有機(jī)酸(如乙酸)的鹽，可制備生理上可接受的鹽。
附圖簡(jiǎn)要說明


圖1表示在各種劑量的實(shí)施例30中制備的化合物與喜樹堿之間ILS(％)的差異。
圖2表示根據(jù)實(shí)施例30制備的化合物對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的抑制作用。進(jìn)行本發(fā)明的最佳實(shí)施方案
通過以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，但權(quán)利要求并不僅限于這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1制備3-嗎啉基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
嗎啉(2.27g，0.026mol)在乙醇(10ml)中的溶液，用濃鹽酸(3ml)處理10分鐘，減壓濃縮，制得嗎啉鹽酸鹽。向該混合物中加入2′-硝基乙酰苯(3.3g，0.02mol)、仲甲醛(0.8g，0.029mol)、濃鹽酸(0.1ml)和無水乙醇(10ml)。反應(yīng)混合物在攪拌下回流30小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用10％碳酸鈉溶液堿化，再用二氯甲烷(3×50ml)萃取。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物通過閃柱色譜用在二氯甲烷中的5％乙醇純制，得到油狀的所需產(chǎn)物(1.5g，35％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.1(m，3H)，3.5(m，4H)，3.75(m，3H)，3.99(m，2H)，7.85(m，3H)，8.15(d，1H，J＝8Hz)實(shí)施例2制備3-哌啶子基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
按與實(shí)施例1相同的方法，使用哌啶(515mg，6.06mmol)、2′-硝基乙酰苯(1g，6.06mmol)、仲甲醛(260mg，8.67mmol)、濃鹽酸(1ml)和無水乙醇制得所需產(chǎn)物(458mg，29％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
1.5(m，6H)，2.38(t，4H，J＝5Hz)，2.76(t，2H，J＝6Hz)，3.00(t，2H，J＝6Hz)，3.99(m，2H)，7.40-7.75(m，3H)，8.13(d，1H，J＝8Hz)實(shí)施例3制備3-吡咯烷基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
按與實(shí)施例1相同的方法，使用吡咯烷(560mg，7.88mmol)、2′-硝基乙酰苯(1g，6.06mmol)、仲甲醛(260mg，8.67mmol)、濃鹽酸(1ml)和無水乙醇(5ml)制得所需產(chǎn)物(347mg，23％)。實(shí)施例4制備3-(N-芐基-N-芐氧羰基氨基)-1-(2′-氨基苯基)丙酮-1
芐胺(2.79g，0.026mol)在乙醇(10ml)中的溶液用濃鹽酸(3ml)處理10分鐘，減壓濃縮，制得芐胺鹽酸鹽。
向該溶液中加入2′-硝基乙酰苯(3.3g，0.02mol)、仲甲醛(0.8g，0.029mol)、濃鹽酸(0.1ml)和無水乙醇(10ml)。
反應(yīng)混合物在攪拌下回流30小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用10％碳酸鈉溶液堿化，再用二氯甲烷(3×50ml)萃取。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物溶解在二氯甲烷中，然后冷卻至0℃。向該混合物中加入三乙胺(1.2g，0.012mol)，然后再滴加氯甲酸芐基酯(2ml)。反應(yīng)混合物在氮?dú)饬飨掠?℃攪拌1小時(shí)，加熱至室溫，然后再攪拌5小時(shí)。
在減壓下除去溶劑后，混合物溶解在乙酸乙酯(100ml)中。有機(jī)層用水(3×30ml)和鹽水(30ml)洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。過濾后，通過除去溶劑得到粗產(chǎn)物。殘留物通過閃柱色譜用正己烷-乙酸乙酯(1∶10)純制，得到所需產(chǎn)物(1.5g，36％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.0(m，2H)，3.70(t，2H，J＝7Hz)，4.60(s，2H)，5.17(s，2H)，7.10-7.70(m，13H)，8.10(d，1H，J＝8Hz)按與實(shí)施例4相同的方法制備實(shí)施例5-8的化合物，結(jié)果如下
實(shí)施例9制備3-(N-2′乙酰氧基乙基-N-芐氧羰基氨基)-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
將3-[(N-2′-羥乙基-N-芐氧羰基氨基)]-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1(40mg，0.107mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.2mg，0.01mmol)的混合物溶解在無水二氯甲烷(2ml)中，然后加入三乙胺(0.02ml，0.160mmol)和醋酐(0.02ml，0.214mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，然后相繼用飽和氯化銨水溶液、水和鹽水洗滌。接著，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。如此得到的殘留物通過閃柱色譜用正己烷-乙酸乙酯(3∶1)純制，得到黃色油狀的所需產(chǎn)物(40mg，90％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
8.123(d，1H，J＝8.4Hz)，7.607-7.261(m，8H)，5，136(s，2H)，4.194(m，H)，3.784-3.754(m，2H)，3.660-3.646(m，2H)，3.172(m，2H)，2.047(s，3H)實(shí)施例10制備3-嗎啉基-1-(2′-氨基苯基)丙酮-1
向溶解在10ml95％乙醇中的3-嗎啉基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1(200mg，0.785mmol)溶液中加入連二亞硫酸鈉(660mg，3.79mmol)，反應(yīng)混合物在攪拌下回流3小時(shí)。反應(yīng)混合物減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用乙醇-二氯甲烷-三乙胺純制，得到油狀的所需產(chǎn)物(174mg，89％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.20(m，3H)，3.50(m，3H)，3.5(m，4H)，3.99(m，2H)，7.5-7.8(m，3H)，8.08(d，1H，J＝8Hz)實(shí)施例11制備3-哌啶子基-1-(2′-氨基苯基)丙酮-1
將與實(shí)施例10相同的方法應(yīng)用于實(shí)施例2的化合物(200mg，0.758mmol)和連二亞硫酸鈉(660mg，0.758mmol)中，得到所需產(chǎn)物(174mg，89％)。實(shí)施例12制備3-吡咯烷基-1-(2′-氨基苯基)丙酮-1
將與實(shí)施例10相同的方法應(yīng)用于實(shí)施例3的化合物(400mg)和連二亞硫酸鈉(1.052g，6.05mmol)中，得到所需產(chǎn)物(235mg)。
按與實(shí)施例10相同的方法，制備實(shí)施例13-17的化合物，結(jié)果如下
實(shí)施例18制備d1-7-[2-(N-芐基-N-芐氧羰基氨基)乙基]喜樹堿
將3-(N-芐基-N-芐氧羰基氨基)-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1(543mg，1.4mmol)和4-乙基-6-氧-1，4，7，8-四氫-4-羥基-吡喃基[3，4-f]中氮茚-3，10(6H)-二酮(263mg，1.0mmol)的混合物溶解在甲苯(50ml)中。反應(yīng)混合物在攪拌下回流30分鐘，然后在混合物中加入對(duì)甲苯磺酸(25mg，0.13mmol)。反應(yīng)混合物在Dean-Stark trap中攪拌回流9小時(shí)。減壓除去溶劑，殘留物通過閃柱色譜用乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)純制，得到黃色粉末狀的所需產(chǎn)物(507mg，59％)。
1H-NMR(CDCl3)δ
1.04(t，2H，J＝8Hz)，1.90(m，2H)，3.10-3.90(m，4H)，4.53(s，1/2x2H)，4.61(s，1/2X2H)，4.95(s，1/2X2H)，5.07(s，1/2x2H)，5.30(s，2H)，5.31(d，1H，J＝16Hz)，5.75(d，1H，J＝16Hz)，7.20-8.20(m，15H)按與實(shí)施例18相同的方法，制備實(shí)施例19-24的化合物，結(jié)果如下
實(shí)施例25制備d1-7-[2-(N-羥乙基-N-芐氧羰基氨基)乙基]喜樹堿
將d1-7-[2-(N-乙酰氧基乙基-N-芐氧羰基氨基)乙基]喜樹堿(28.2mg，0.05mmol)和碳酸鉀(25mg，0.15mmol)溶解在甲醇與水(1∶1，1.5ml)的混合溶劑中，反應(yīng)混合物溶液在室溫下攪拌3小時(shí)。反應(yīng)混合物用1N鹽酸溶液酸化，再用二氯甲烷萃取，然后用鹽水洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到黃色固體的所需產(chǎn)物(17mg，60％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
8.171-7.762(m，10H)，5.710(d，2H，J＝16.8Hz)，5.308(d，2H，J＝16.8Hz)，5.301(s，2H)，5.207(s，2H)，3.868-3.466(m，8H)，1.926-1.832(m，2H)，1.033(t，3H，J＝7.6Hz)實(shí)施例26制備d1-7-[ 2-(N-芐基氨基)乙基]喜樹堿
將d1-7-[2-(N-芐基-N-芐氧羰基氨基)乙基]喜樹堿(50mg，0.08mmol)溶解在冰醋酸(20ml)中，然后用10％Pd/C(25mg)處理。反應(yīng)混合物在40psi的氫氣流下攪拌9小時(shí)，然后通過cellitepad過濾除去催化劑。濾液減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用10％甲醇-二氯甲烷純制，得到黃色粉末狀的所需產(chǎn)物(24mg，63％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
0.89(t，3H，J＝8Hz)，1.87(m，2H)，2.90(m，2H)，3.5(m，4H)，3.73(s，1H)，5.33(s，2H)，5.43(s，2H)，6.52(s，1H)，7.25(m，6H)，7.70-8.30(m，4H)實(shí)施例27制備d1-7-[2-(N-乙酰氧基乙基氨基)乙基]喜樹堿
進(jìn)行與實(shí)施例26相同的步驟。
1H-NMR(400MHz，CDCl3+MeOH-d4)δ
8.323(d，1H，J＝8.8Hz)，8.18(d，1H，J＝8.4Hz)，7.812(t，1H，J＝6.8Hz)，7.675(t，1H，J＝6.8Hz)，7.647(s，1H)，5.742(d，1H，J＝16.4Hz)，5.324-5.284(m，2H)，4.169-4.122(m，2H)，3.373(t，2H，J＝7.6Hz)，3.1 08-3.040(m，4H)，2.090(s，3H)，2.024(s，3H)，1.955-1.803(m，2H)，1.033(t，3H，J＝7.6Hz)實(shí)施例28制備d1-7-[2-(N-羥乙基氨基)乙基]喜樹堿
進(jìn)行與實(shí)施例26相同的步驟。
1H-NMR(400MHz，CDCl3+MeOH-d4)δ
8.284(d，1H，J＝8.0Hz)，8.226(d，1H，J＝8.8Hz)，7.863(t，1H，J＝6.8Hz)，7.756(t，1H，J＝6.8Hz)，7.730(s，1H)，5.682(d，1H，J＝13.6Hz)，5.641(d，1H，J＝13.6Hz)，5.130(s，2H)，3.800-3.190(m，8H)，1.962-1.898(m，2H)，1.031(t，3H，J＝4.4Hz)，2.035(s，3H)實(shí)施例29制備d1-7-[2-(N-乙基氨基)乙基]喜樹堿
將2′-氨基-2-(N-芐氧羰基-N-乙基氨基)苯丙酮(34mg，0.11mmol)和4-乙基-6-氧-1，4，7，8-四氫-4-羥基-吡喃基[3，4-f]中氮茚-3，10(6H)-二酮(34mg，0.1mmol)的混合物溶解在甲苯中，并回流30分鐘。在加入對(duì)甲苯磺酸(19.2mg，0.1mmol)后，反應(yīng)混合物在Dean-Stark trap中攪拌回流3小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(10∶ 1)純制，得到固體的所需產(chǎn)物(40mg，67％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ
8.280(d，1H，J＝8.6Hz)，8.184(d，1H，J＝7.4Hz)，7.873-7.753(m，2H)，7.471(d，2H，J＝7.2Hz)，7.111(d，2H，J＝7.2Hz)，7.356(s，1H)，6.523(s，1H)，5.439(s，2H)，3.534-2.753(m，6H)，2.217(s，3H)，1.671-1.643(m，2H)，1.230(t，3H，J＝6.8Hz)，0.743(t，3H，J＝7.2Hz)實(shí)施例30制備d1-7-[ 2-(N-2-甲基-乙基氨基)乙基]喜樹堿
進(jìn)行與實(shí)施例29相同的步驟。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ
8.870-8.567(m，2H)，8.298-8.155(m，2H)，7.867(d，2H，J＝7.6Hz)，7.741(s，1H)，7.500(d，2H，J＝7.6Hz)，5.828(s，2H)，5.795(s，2H)，3.958-3.820(m，2H)，2.666(s，3H)，2.320-2.200(m，2H)，1.614(d，6H，J＝6.4Hz)，1.533(t，2H)，1.267(t，3H)實(shí)施例31制備d1-7-[2-(嗎啉基)乙基]喜樹堿三氟乙酸鹽
進(jìn)行與實(shí)施例24相同的步驟，不同之處在于用三氟乙酸代替對(duì)甲苯磺酸。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ
0.92(t，J＝6Hz，3H)，1.94(m，2H)，2.90(m，4H)，3.30-3.65(m，8H)，5.47(s，2H)，5.48(s，2H)，6.56(s，1H)，7.70-8.30(m，4H)實(shí)施例32制備6-氰基-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-3′-(甲氧基甲基氧丙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將6-氰基-1，1-(亞乙二氧基)-7-[(乙氧基羰基)甲基]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚(608.6mg，2mmol)溶解在無水二甲基甲酰胺(3ml)中，冷卻至5℃，加入KOtBu(258.1mg，2.3mmol)，然后在相同的溫度下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。向該混合物中加入2-溴乙醇甲氧基-甲基醚(1.352g，8mmol)，反應(yīng)混合物在45-50℃下攪拌20小時(shí)。反應(yīng)混合物用水(50ml)稀釋，用二氯甲烷(100ml)萃取。有機(jī)層用水(80ml)和鹽水(80ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，再減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用乙酸乙酯-正己烷(2∶1)純制，得到淡黃色固體的所需產(chǎn)物(734.8mg，95％)。
IR(凈)2224，1734，1656cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.254(t，3H，J＝6.8Hz)，1.987-2.020(m，1H)，2.410(t，2H，J＝6.8Hz)，2.43-2.449(m，1H)，3.447-3.485(m，1H)，3.564-3.603(m，1H)，4.117-4.201(m，7H)，4.225(q，2H，J＝7.6Hz)，4.584，4.609(Abq，2H，J＝6.8Hz)，6.367(s，1H)
MS(EI)m/e
392(M+)，377(M+-CH3)，361(M+OCH3)，347(M+-C2H5O)實(shí)施例33制備6-(乙酰胺基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-3′-(甲氧基甲基氧丙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
250滴Raney鎳(50％水漿)用水(5ml)和乙酸(10ml)分別洗滌10次，然后放人parr瓶中。
在上述溶液中添加實(shí)施例32中得到的化合物(743.8mg，1.9mmol)、醋酐(30ml)和乙酸(10ml)，反應(yīng)化合物在45psi的壓力、45-50℃下氫化3小時(shí)。過濾除去催化劑，濾液減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到黃色油狀的所需產(chǎn)物(789.5mg，95％)。
IR(凈)1733，1660，1635 cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.214(t，3H，J＝6.8Hz)，1.924(s，3H)，1.939-1.98(m，1H)，2.382(t，2H，J＝6.8Hz)，2.399-2.40(m，1H)，3.343(s，3H)，3.44-3.58(m，2H)，4.075-4.131(m，7H)，4.145(q，2H)，4.34，4.39(d，d，2H)，4.571，4.592(Abq，2H，J＝6.8Hz)，6.306(s，1H)，6.61(brs，1H)
MS(EI)m/e
438(M+)，423(M+CH3)，407(M+OCH3)，395(M+COCH3)，393(M+-C2H5O)實(shí)施例34制備6-(乙酰氧基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-3′-(甲氧基甲基氧丙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
在實(shí)施例33中制得的化合物(789.5mg，1.8mmol)中加入醋酐(15ml)、乙酸(5ml)和亞硝酸鈉(621.2mg，9mmol)，反應(yīng)混合物在5-10℃下攪拌6小時(shí)。在通過過濾除去所形成的無機(jī)物質(zhì)后，減壓濃縮濾液形成亞硝基化合物。添加四氯化碳(50ml)，混合物加熱回流18小時(shí)。反應(yīng)混合物用水(10ml)和鹽水(10ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到無色油狀的所需產(chǎn)物(720mg，90％)。
IR(凈)1740，1733，1654cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.217(t，3H，J＝6.8Hz)，1.86-1.95(m，1H)，2.056(s，3H)，2.368(t，2H)，2.38-2.43(m，1H)，3.333(s，3H)，3.41-3.57(m，2H)，4.087-4.119(m，9H)，4.569(s，2H)，5.259(s，2H)，6.304(s，1H)
MS(EI)m/e 439(M+)，408(M+OCH3)，396(M+-COCH3)實(shí)施例35制備1，1-(亞乙二氧基)-(5′-甲氧基甲基氧乙基-2′H，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[3′，4′-f ]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將實(shí)施例34中得到的化合物(720mg，1.64mmol)與甲醇(15ml)的混合物加入到溶解在水(5ml)中的LiOH.H2O(172mg，4.1mmol)中，然后在25-30℃下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，以除去甲醇，然后添加水(15ml)、二氯甲烷(50ml)和乙酸(5ml)，反應(yīng)混合物在25-30℃下攪拌10小時(shí)。從反應(yīng)混合物中分離有機(jī)層，該有機(jī)層用水(10ml)和鹽水(10ml)洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。減壓濃縮有機(jī)層。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(30∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(720mg，91％)。
IR(凈)1747，1662 cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
2.178-2.216(m 2H)，2.404(t，2H，J＝6.8Hz)，3.371(s，3H)，3.599-3.643(m，2H)，3.701(t，1H，J＝6.8Hz)，4.109-4.192(m，6H)，4.618(s，2H)，5.278，5.43(Abq，2H，J＝16.4Hz)，6.169(s，1H)
MS(EI)m/e 351(M+)，320(M+OCH3)，307(M+-CO2)實(shí)施例36制備1，1-(亞乙二氧基)-(5′-甲氧基甲基氧乙基-5′-羥基-2′H，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[3′，4′-f ]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將在實(shí)施例35中制得的化合物(570.3mg，1.63mmol)溶解在無水DMF(20ml)中，在該混合物中添加KOtBu(273mg，2.43mmol)，然后在0-5℃下攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物冷卻至-10到-5℃，添加三乙基亞磷酸酯(974μl，5.68mmol)，混合物攪拌2.5小時(shí)，同時(shí)向其中吹入氧氣泡。在混合物中加入水(10ml)，用1N鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至3.5。然后用二氯甲烷(30ml×2次)萃取反應(yīng)混合物，用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥。有機(jī)層減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(25∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(416.4mg，69.8％)。
IR(凈)3503，1749，1654cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.919-1.974(m，1H)，2.010-2.063(m，1H)，2.348(t，2H，J＝6.8Hz)，3.30(s，3H)，3.542-3.597(m，1H)，3.639-3.684(m，1H)，4.002-4.1541(m，7H)，4.516，4.494(Abq，2H，J＝6.4Hz)，5.111，5.557(Abq，2H，J＝16Hz)，6.541(s，1H)
MS(EI)m/e 367(M+)，336(M+OCH3)，323(M+-CO2)實(shí)施例37制備1，5-二氧-(5′-羥乙基-5′-羥基-2′H，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[3′，4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
在實(shí)施例36中制得的化合物(146.1mg，0.4mmol)中加入THF(200ml)、水(1ml)和6N鹽酸(2.5ml)的混合物，在50-55℃下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)混合物減壓濃縮。殘留物通過DianionRHP-20(Mitsubishi)用乙腈-水(4∶1)純制，然后減壓濃縮，得到黑色樹脂狀的所需產(chǎn)物(93.2mg，84％)。
IR(KBr)3470，1749，1654cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.92-2.11(m，2H)，2.962(t，2H，J＝6.0Hz)，3.674-3.86(m，2H)，4.326(t，2H，J＝6.0Hz)，5.259，5.627(Abq，2H，J＝16.8Hz)，5.287(s，1H)，7.284(s，1H)
MS(EI)m/e 279(M+)，261(M+-H2O)，235(M+-C2H5OH)實(shí)施例38制備d1-18-羥基喜樹堿
將2-氨基苯甲醛縮乙二醇(75.6mg，0.46mmol)和甲苯(8ml)的溶液加至實(shí)施例37中制得的化合物(85.2mg，0.31mmol)中，在Dean-Stark裝置中回流1小時(shí)。將對(duì)甲苯磺酸(催化劑量)加入至反應(yīng)混合物中，再回流3小時(shí)。過濾所形成的固體，并通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(15∶1)純制，得到淡棕色固體的所需產(chǎn)物(57.8mg，52％)。
IR(凈)3400，1743，1658cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3DMSO-d6＝3∶1)δ
2.01-2.20(m，2H)，3.51-3.86(m，2H)，5.315(s，2H)，5.34，5.55(Abq，2H)，6.418(s，1H)，7.557(s，1H)，7.676(t，1H)，7.83(t，1H)，8.03(d，1H)，8.18(d，1H)，8.570(s，1H)
MS(EI)m/e 364(M+)，320(M+-CO2)實(shí)施例39制備d1-18-甲氧基甲基氧喜樹堿
將甲氧基甲基氯(6μl，0.08mmol)和二異丙基乙胺(12μl，0.07mmol)加至d1-18-羥基喜樹堿在二氯甲烷(2ml)中的懸浮液中，然后在25-30℃下攪拌48小時(shí)。
添加二氯甲烷(25ml)，反應(yīng)混合物相繼用飽和氯化銨(10ml)、水(10ml)、10％硫酸氫鉀(10ml)、水(10ml)和鹽水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(30∶1)以及通過PTLC用二氯甲烷-乙醇(20∶1)純制，得到黃色固體的所需產(chǎn)物(5mg，23％)。
IR(KBr)3566，1733，1652 cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
2.15-2.34(m 2H)，3.387(s，3H)，4.08-4.22(m，2H)，4.604(d，d，2H)，5.313(s，2H)，5.62，5.78(Abq，2H)，6.6(s，1H)，7.68(t，1H)，7.726(s，1H)，7.84(t，1H)，7.96(d，1H)，8.24(d，1H)，8.41(s，1H)
MS(EI)m/e 408(M+)
HRMS m/e M+計(jì)算408.1321；觀察到的408.1336
按與實(shí)施例39相同的方法，制備實(shí)施例40-46之通式(I)表示的化合物(R＝H，n＝2)。實(shí)施例47制備6-氰基-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-羥乙基]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將35％甲醛(30ml)、二氧六環(huán)(50ml)、水(20ml)和乙醇(20ml)的混合物加入到6-氰基-1，1-(亞乙二氧基)-7-[(乙氧基羰基)甲基]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚(500mg，1.64mmol)中，在25-30℃下攪拌15小時(shí)。添加二氯甲烷(120ml)，反應(yīng)混合物用水(120ml×3次)和鹽水(120ml)洗滌。分離的有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(25∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(318mg，58％)。
IR(KBr)3310，2224，1735，1647cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.275(t，3H，J＝7.2Hz)，2.407(t，2H，J＝6.8Hz)，4.029-4.221(m，9H)，4.239(q，2H)，6.383(s，1H)
MS(EI)m/e
334(M+)，316(M+-H2O)，304(M+-CH3OH)實(shí)施例48制備6-氰基-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將二氯甲烷(0.7ml)加至實(shí)施例47中制得的化合物(51.6mg，0.15mmol)中，在冰浴中冷卻。然后緩慢加入二異丙基乙胺(30μl，0.17mmol)和MEM-Cl(35μl，0.31mmol)，所得溶液在25-30℃下攪拌20小時(shí)。向反應(yīng)混合物中添加二氯甲烷(15ml)，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mlX2次)、水(10ml)和鹽水(10ml)洗滌。分離的有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(25∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(41mg，62％)。
IR(凈)2224，1734，1661cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.289(t，3H，J＝6.8Hz)，2.422(t，2H，J＝6.8Hz)，3.410(s，3H)，3.548-3.598(m 2H)，3.653-3.680(m，1H)，3.725-3.748(m，1H)，3.912(dd，1H，J＝10Hz，J＝6.8Hz)，4.098(dd，1H，J＝10Hz，J＝6.8Hz)，4.129-4.216(m，6H)，4.236(q，2H)，4.336(t，1H，J＝6.8Hz)，4.706，4.742(Abq，2H，J＝6.8Hz)，6.441(s，1H)
MS(EI)m/e
423(M++H)，422(M+)，392(M+OCH3)，378(M+-C2H5O)實(shí)施例49制備6-(乙酰氨基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)]-5-氧Δ6(8)-四氫中氮茚
使用實(shí)施例48中制得的化合物(39.6mg，0.09mmol)，按與實(shí)施例33相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，而殘留物通過閃柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到無色油狀的所需產(chǎn)物(42mg，96％)。
IR(凈)1733，1661，1656cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.247(t，3H，J＝7.2Hz)，1.934(s，3H)，2.393(t，2H，J＝6.8Hz)，3.405(s，3H)，3.546-3，569(m，2H)，3.660-3.686(m，2H)，3.809(dd，1H，J＝6.4Hz，J＝9.2Hz)，4.093-4.192(m，7H)，4.205(q，2H)，4.467(dq，2H，J＝6.4Hz)，4.652(t，2H，J＝6.8Hz)，4.719，4.750(Abq，2H，J＝6.8Hz)，6.349(s，1H)，6.658(s，1H)
MS(EI)m/e
468(M+)，453(M+CH3)，425(M+-C2H5O)實(shí)施例50制備6-(乙酰氧基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
使用實(shí)施例49中制得的化合物(359mg，0.76mmol)，按與實(shí)施例34相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，而殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(30∶1)純制，得到無色油狀的所需產(chǎn)物(234mg，65％)。
IR(凈)1733，1740，1661cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
1.230(t，3H，J＝7.2Hz)，2.057(s，3H)，2.361(t，2H，J＝6.8Hz)，3.381(s，3H)，3.521-3，542(m，2H)，3.620-3.653(m，2H)，3.723(dd，1H，J＝6.0Hz，J＝9.2Hz)，4.082-4.209(m，8H)，4.225(s，2H)，4.716-4.675(Abq，2H，J＝6.8Hz)，5.259(s，2H)，6.313(s，1H)
MS(EI)m/e
469(M+)，426(M+-COCH3)實(shí)施例51制備6-(乙酰氧基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)乙烯基]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將干苯(8m1)和DBU(416μ1)加至在實(shí)施例50中制得的化合物(522mg，1.1mmol)中，然后在室溫下攪拌3小時(shí)。加入二氯甲烷(20ml)，然后用飽和氯化銨水溶液(15ml×2次)和水(15ml)洗滌。分離的有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(30∶1)純制，得到黃白色固體的所需產(chǎn)物(363mg，90％)。
IR(凈)1729，1719，1655cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
6.551(s，1H)，6.109，5.773(s，s，1H×2)，5.008(s，2H)，4.243(q，2H，J＝7.2Hz)，4.104-4.161(m，6H)，2.398(t，2H，J＝6.8Hz)，2.021(s，3H)，1.293(t，3H，J＝7.2Hz)
MS(EI)m/e 363(M+)，320實(shí)施例52制備6-(乙酰氧基甲基)-1，1-(亞乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-1′-(羥基)-2′-(羥基)乙基]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將吡啶(3.9m1)加至實(shí)施例51中制得的化合物(285mg，1.79mmol)中，注射加入OsO4(240mg，0.94mmol)(0.08M甲苯，11.8ml)，在黑暗中于室溫下攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)混合物中添加亞硫酸氫鈉(480mg)與水(7ml)的溶液，然后攪拌1小時(shí)。反應(yīng)混合物用二氯甲烷(30ml×5)萃取，合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。
有機(jī)層然后減壓濃縮。殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(280mg，90％)。
IR(凈)3307，1735，1654cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
6.455(s，1H)，5.303(Abq，2H，J＝11.7Hz)，4.611(s，1H)，4.085-4.611(m，9H)，3.855，3.826(dd，1H，J＝6.8，11.2Hz)，2.641(brt，1H，J＝6.8Hz)，2.384(t，2H，J＝6.8Hz)，2.063(s，3H)，1.290(t，3H，J＝6.8Hz)
MS(EI)m/e 397(M+)，354實(shí)施例53制備1，1-(亞乙二氧基)-(5′-羥甲基-5′-羥基-2′H，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[ 3′，4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
使用實(shí)施例52中制得的化合物(325mg，0.82mmol)，按與實(shí)施例35相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，而殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(211mg，84％)。
IR(凈)3421，1750，1654cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
6.599(s，1H)，5，564，5.255(Abq，2H，J＝16.0Hz)，4.072-4.238(m，7H)，3.772，3.733(dd，2H，J＝1 1.6Hz)，2.41 8(t，2H，J＝6.8Hz)
MS(EI)m/e
309(M+)，293，280，279，265
HRMS m/e(M+)計(jì)算 309.0849；觀察到的309.0847實(shí)施例54制備1，1-(亞乙二氧基)-(5′-乙酰氧基甲基-5′-羥基-2′H-，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[3′，4′-f ]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將在實(shí)施例53中制得的化合物(119mg，0.38mmol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，然后添加吡啶(93μl，1.15mmol)和醋酐(47μl，0.50mmol)，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時(shí)。反應(yīng)混合物用二氯甲烷(20ml)稀釋，用35％硫酸氫鉀水溶液(20ml)、水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。
有機(jī)層減壓濃縮。殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到白色固體的所需產(chǎn)物(127mg，94％)。
IR(凈)3437，1751，1657cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
6.586(s，1H)，5.6336，5.295(Abq，2H，J＝16.4Hz)，4.302(d，1H，J＝11.2Hz)，4.116-4.215(m，7H)，4.004(s，1H)，2.427(t，2H，J＝6.8Hz)，2.084(s，3H)
按與實(shí)施例54相同的方法，制備實(shí)施例55-57的化合物，結(jié)果如下
實(shí)施例58制備1，5-二氧-(5′-乙酰氧基甲基-5′-羥基-2′H，5′H，6′H-6-氧吡喃基)[3′，4′-f ]-5-氧-Δ6(8)-四氫中氮茚
將80％三氟乙酸(1.3ml)加至在實(shí)施例54中制得的化合物(127mg，0.36mmol)中，然后在室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合物減壓濃縮，添加鹽水，反應(yīng)混合物用二氯甲烷(20ml×3)萃取，然后用無水硫酸鎂干燥。有機(jī)層減壓濃縮。殘留物通過柱色譜用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到黃色固體的所需產(chǎn)物(理論產(chǎn)率)。
IR(KBr)3412，1746，1660cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ
7.318(s，1H)，5.687，5.388(Abq，2H，J＝17.1Hz)，4.405(t，2H)，4.370(d，1H，J＝1 1.7Hz)，4.155(d，1H，J＝11.7Hz)，3.007(t，2H，J＝6.8Hz)，2.080(s，3H)
MS(EI)m/e 307(M+)
按與實(shí)施例58相同的方法，制備實(shí)施例59-61之通式(I)表示的化合物(R＝H，n＝2)。
實(shí)施例62制備d1-20-去乙基-20-乙酰氧基甲基喜樹堿
使用實(shí)施例58中制得的化合物(19mg，0.06mmol)和N-(2-氨基苯亞甲基)-對(duì)甲苯胺(20mg，0.09mmol)，按與實(shí)施例38相同的步驟進(jìn)行反應(yīng)，而殘留物通過PTLC用二氯甲烷-甲醇(20∶1)純制，得到棕色固體的所需產(chǎn)物(9mg，36％)。
IR(CHCl3)3400，1749，1740，1654 cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD＝41)δ
8.493(s，1H)，8.223(d，1H，J＝8.4Hz)，7.988(d，1H，J＝8.0Hz)，7.867(t，1H，J＝7.2Hz)，7.767(s，1H)，7.703(t，1H，J＝7.2Hz)，5.697，5.433(Abq，2H，J＝16.4Hz)，5.334(s，2H)，4.460(d，1H，J＝1 1.2Hz)，4.330(d，1H，J＝11.2Hz)，2.087(s，3H)
LRMS(EI) m/e
392(M+)，331，320，305
HRMS m/e(M+)計(jì)算392.1008；觀察到的392.1006
按與實(shí)施例38相同的方法制備實(shí)施例63-65之通式(I)表示的化合物(R＝H，n＝1)。
實(shí)施例66制備d1-20-去乙基-20-羥甲基喜樹堿
在d1-20-去乙基-20-乙酰氧基甲基喜樹堿中加入甲醇(6ml)、水(2ml)和LiOH.H2O(33mg，0.78mmol)的混合物，然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1.5小時(shí)。
減壓濃縮反應(yīng)混合物，以除去甲醇，然后在冰浴中攪拌30分鐘，直到溶液的pH值用1N鹽酸控制在3.5。過濾所形成的固體，然后相繼用水、異丙醇和乙醚洗滌，在P2O5下，真空干燥3小時(shí)，制得黃白色固體的所需產(chǎn)物(83mg，66％)。
IR(KBr)3436，1743，1657cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3+DMSO-d6＝1∶1)δ
8.608(s，1H)，8.157(d，1H，J＝8.0Hz)，8.106(s，1H)，8.050(d，1H，J＝8.0Hz)，7.829(t，1H，J＝7.3Hz)，7.673(t，1H，J＝7.3Hz)，6.7 14(s，1H)，5.441，5.360(Abq，2H，J＝16.1Hz)，5.304(s，2H)，3.850-3.89(m，1H)，3.681-3.722(m，1H)
LRMS(EI)m/e 350(M+)，320，306
HRMS m/e(M+)計(jì)算350.0903，觀察到的350.0917
按與實(shí)施例39相同的方法，制備實(shí)施例67-69之通式(I)表示的混合物(R＝H，n＝1)。實(shí)驗(yàn)1本發(fā)明化合物的細(xì)胞毒性1)材料癌細(xì)胞株
在確定細(xì)胞毒性時(shí)，使用購(gòu)自ATCC(USA)的下列細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)中的靶生物體L1210(ATCC CCL 219)、A172(ATCC CRL 1620)、A427(ATCCHTB 53)、A549(ATCC CCL185)、SK-NEP-1(ATCC HTB 48)、CAOV-3(ATCC HTB 75)、HEC-1-B(ATCC HTB 113)、DLD-1(ATCCCCL 221)和KATO-III(ATCC HTB 103)、CAKI-2(ATCC HTB 47)。癌細(xì)胞培養(yǎng)基的制備
使用蒸餾水來制備培養(yǎng)基。將1升的RPMI 1640粉末培養(yǎng)基溶解在蒸餾水中，然后添加碳酸氫鈉(2.0g)，攪拌所得溶液。在將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8-7.4后，用0.22μm的過濾器過濾培養(yǎng)基。在使用前將胎牛血清于56℃下熱處理30分鐘。試劑
從Gibco Co.購(gòu)買用于癌細(xì)胞株的RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、碳酸氫鈉和胰蛋白酶-EDTA緩沖液。由Sigma Co.購(gòu)得MTT[(3，4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基雙偶氮溴]，而其他的試劑都是GR級(jí)的。測(cè)試材料
將購(gòu)自Sigma Co.的喜樹堿溶解在二甲基亞砜中，添加購(gòu)自Dulbec Co的磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)，在使用前將二甲基亞砜的濃度調(diào)節(jié)至10％。如果是將合成的測(cè)試物質(zhì)溶解在二甲基亞砜中，二甲基亞砜的濃度也要調(diào)節(jié)到10％，而其他的添加DPBS。給予癌細(xì)胞的二甲基亞砜的最終濃度調(diào)節(jié)至低于1％，這對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響。2)方法
使癌細(xì)胞在37℃、5％CO2下，于包含10％(V/V)胎牛血清(FBS)、50μg/ml艮地霉素和2g/L碳酸氫鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(為除去支持物依賴性細(xì)胞株通過附著在培養(yǎng)燒瓶上的生長(zhǎng))除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌-次，然后添加2-30ml的胰蛋白酶-EDTA緩沖液，單層癌細(xì)胞全部覆蓋住，并靜止-段時(shí)間。然后制備經(jīng)培養(yǎng)的癌細(xì)胞的懸浮液，用培養(yǎng)基稀釋，然后接種在96孔板中，使細(xì)胞的數(shù)量與表1中所述的相同。
將20μl樣品(在對(duì)照孔中為PBS溶液)接種在96孔微板中，并培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)后，通過SRB測(cè)定法(測(cè)試方法1)測(cè)定抗腫瘤活性。
對(duì)于如L1210的非支持物依賴性細(xì)胞，也接種細(xì)胞，使細(xì)胞的數(shù)量與下表1中所述的相同。在培養(yǎng)2天后，通過MMT測(cè)定法(測(cè)試方法2)測(cè)定對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
使用自動(dòng)微板讀數(shù)器測(cè)定光密度。計(jì)算細(xì)胞抑制率為50％的濃度作為GI50(計(jì)算機(jī)PCS，4.1版，用Probit法)。對(duì)于每-次的實(shí)驗(yàn)，在約2-3個(gè)孔中的光密度用于計(jì)算之中。
表1接種細(xì)胞的數(shù)量測(cè)定方法1SRB測(cè)定法細(xì)胞在培養(yǎng)基中的懸浮液180μl+樣品或PBS20μl
在37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天
用TCA沉淀
用蒸餾水洗滌5次，然后干燥
用0.4％SRB溶液染色30分鐘
用1％HAc溶液洗滌5次
溶解在10mMTris緩沖液中
在520nm處測(cè)量光密度
計(jì)算GI50測(cè)定方法2MTT測(cè)定法細(xì)胞在培養(yǎng)基中的懸浮液180μl+樣品或PBS20μl
在37℃、5％CO2下培養(yǎng)2天
添加50μlMTT溶液(2mg/ml在PBS溶液中)
培養(yǎng)4小時(shí)
在2000rpm下離心10分鐘
去除上清液
將formazan溶解在DMSO中
在570nm處測(cè)量光密度
計(jì)算GI503)結(jié)果
各細(xì)胞株的細(xì)胞毒性結(jié)果見表2和3表2
表3實(shí)驗(yàn)2根據(jù)本發(fā)明之化合物的抗腫瘤活性
抗腫瘤活性通常是通過測(cè)定對(duì)固形腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用以及對(duì)人為腫瘤攜帶動(dòng)物的壽命延長(zhǎng)作用來證明的。
抗腫瘤活性是通過對(duì)L1210攜帶小鼠的壽命延長(zhǎng)作用以及對(duì)B16攜帶小鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用之實(shí)驗(yàn)來測(cè)定的。為估測(cè)對(duì)L1210白血病的抗腫瘤活性，腹膜內(nèi)接種一定數(shù)量的L1210細(xì)胞(體外)以使其繁殖，在移植腫瘤后的第7天將宿主動(dòng)物拉頸處死，從腹水中獲得L1210細(xì)胞。
為調(diào)查對(duì)B16黑色素瘤的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，將一定數(shù)量的B16細(xì)胞(體外)進(jìn)行皮下接種以使其繁殖，在腫瘤移植后的第14天將宿主動(dòng)物拉頸處死，重新切下腫瘤細(xì)胞。
以下將詳細(xì)描述抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
使用重約20克的雄性BDF1小鼠。動(dòng)物室控制在23+2℃和60+5％的相對(duì)濕度，使用HEPA過濾器，并維持無特定的病原體(SPF)。實(shí)驗(yàn)2-1根據(jù)本發(fā)明的化合物對(duì)L1210攜帶小鼠的壽命延長(zhǎng)作用
將在體外得到的5X105個(gè)L1210白血病細(xì)胞腹膜內(nèi)接種在BDF1小鼠中以使其繁殖。在移植腫瘤后的第7天將BDF1小鼠拉頸處死，從腹水中獲得L1210腫瘤細(xì)胞。
在使用于測(cè)試之前，將腫瘤細(xì)胞至少傳代3次。
在第0天將5×105個(gè)細(xì)胞腹膜內(nèi)接種于BDF1小鼠，在第1、3和5天將樣品腹膜內(nèi)給藥。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用6只小鼠。
通過每組小鼠的平均存活時(shí)間估測(cè)抗腫瘤活性，并用ILS(％)值和第1和5天時(shí)的平均動(dòng)物重量來表示。增加的壽命(ILS)
ILS(％)＝[(樣品處理組的平均存活時(shí)間/溶劑組的平均存活時(shí)間)-1]×100結(jié)果
在接種腫瘤后的第1、3和5天給以實(shí)施例18的化合物，總劑量為10mg/kg和50mg/kg時(shí)，分別增加L1210攜帶小鼠的壽命33％和64％(表4)。
表4實(shí)施例18化合物對(duì)L1210的壽命延長(zhǎng)作用
在接種腫瘤后的第1、3和5天給以實(shí)施例26的化合物，總劑量為10mg/kg和50mg/kg時(shí)，分別增加L1210攜帶小鼠的壽命72％和75％(表5)。
表5實(shí)施例26化合物對(duì)L1210的壽命延長(zhǎng)作用
在接種腫瘤后的第1、3和5天給以實(shí)施例30的化合物，總劑量為10mg/kg和50mg/kg時(shí)，分別增加L1210攜帶小鼠的壽命(ILS)42％和119％(表6)。
表6實(shí)施例30化合物對(duì)L1210的壽命延長(zhǎng)作用
因?yàn)閷?shí)施例30的化合物比其他化合物表現(xiàn)出更好的劑量依賴性和ILS(％)，本發(fā)明者等人嘗試對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予高劑量的藥物，來闡明更高劑量和抗腫瘤活性的關(guān)系。
如果在腫瘤接種后的第1、3和5天給予實(shí)施例30的化合物總劑量為8.75、17.5、35、70和140mg/kg，則ILS(％)分別為58.7、79.7、92.4、143和110％。
表7各種劑量的實(shí)施例30化合物對(duì)L1210的壽命延長(zhǎng)作用
如果在腫瘤接種后的第1、3和5天給予實(shí)施例30的化合物，在總劑量為70mg/kg時(shí)得到最大ILS為143％。
如圖1所示，實(shí)施例30化合物對(duì)于腹膜內(nèi)移植的L1210之抗腫瘤活性與喜樹堿的抗腫瘤活性平行地進(jìn)行估測(cè)。實(shí)施例30化合物的ILS(％)更高而且其范圍更寬，表明作用更明顯。實(shí)驗(yàn)2-2本發(fā)明化合物對(duì)B16攜帶小鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用
將體外得到的106個(gè)B16黑色素瘤細(xì)胞皮下移植在BDF1小鼠內(nèi)以使其繁殖。在第14天B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移。將腫瘤攜帶小鼠拉頸處死，從其上重新切下除壞死中心的新鮮腫瘤。
在使用于測(cè)試之前，腫瘤細(xì)胞至少注射傳代3次。
將1g待皮下接種的皮下宿主腫瘤在冷的滅菌鹽水中均化，最終濃度為1g/10ml。將110的腫瘤懸浮液皮下注射在所有的BDF1小鼠中，劑量為0.2ml/鼠。
用如此均化的溶液對(duì)小鼠進(jìn)行皮下移植，在腫瘤移植7和8天時(shí)，選擇具有一定大小腫瘤的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在接種腫瘤后的第8、12和16天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組給予樣品(0.1ml/10g)。每實(shí)驗(yàn)組使用8只小鼠。
通過直接測(cè)量腫瘤的直徑使用下式計(jì)算腫瘤尺寸。
腫瘤尺寸＝(a2b)/2
其中，b是最大的直徑，a是垂直于b的直徑，由此得到生長(zhǎng)曲線。(圖2)
以腫瘤尺寸為基礎(chǔ)，根據(jù)下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率
IR(％)＝(1-Twt/TWc)×100
其中，TWt是樣品處理組的平均腫瘤體積(重量)。
TWc是對(duì)照組的平均腫瘤體積(腫瘤)。測(cè)試結(jié)果
如果在腫瘤接種后的第8、12和16天時(shí)，所給實(shí)施例30化合物的總劑量為35、70和140mg/kg，則IR(％)分別為27、54.8和67.72％(表8)。
表8實(shí)施例30制備的化合物對(duì)B16黑色素瘤的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用
而且，在給予實(shí)施例30化合物后的第20天，切下的腫瘤重量之IR百分?jǐn)?shù)分別為40、56和71.6％。
在總劑量為140mg/kg時(shí)得到最大IR為67.72％。腫瘤體積的變化概述于圖2之中。如此的結(jié)果明確地說明，與喜樹堿相比，實(shí)施例30的化合物不僅對(duì)腹水腫瘤具有非常好的抗腫瘤活性，而且毒性還非常小，安全范圍較寬。
權(quán)利要求
1、下列通式(I)表示的喜樹堿衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽
其中
R是氫或-(CH2)2-NR1R2，(R1是氫或胺的常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)；
n是1或2；R3是氫或-OR4[R4是氫或O＝C-R5(R5是甲基或CH3OCH2-)；O＝NHR6(R6是異丙基，苯基或-CH2CH2Cl.)；CH2OR7(R7是甲基，乙基或CH3OCH2CH2-)]；
其中，如果n是2，而R4是氫，則R不是氫；
如果n是2，而R3是H，則R不是氫；而且
如果R是-CH2CH2NHCH3，則R3不是氫。
2、下列通式(II)表示的喜樹堿合成中的中間體
其中
R′是-(CH2)2-NR1R2，(R1是胺的常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)。
3、下列通式(III)表示的喜樹堿合成中的中間體
其中
n是1或2；R3是氫或-OR4[R4是氫或O＝C-R5(R5是甲基或CH3OCH2-)；O＝NHR6(R6是異丙基，苯基或-CH2CH2Cl.)；CH2OR7(R7是甲基，乙基或CH3CH2OCH2-)]；
其中，如果n是2，而R4是氫，則R不是氫；
如果n是2，而R3是H，則R不是氫；而且
如果R是-CH2CH2NHCH3，則R3不是氫。
4、制備以下列通式(I)表示的化合物的方法，其中，在酸性條件下通式(II)表示的化合物與通式(III)表示的化合物反應(yīng)，
其中
R是氫或-(CH2)2-NR1R2，(R1是氫或胺的常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)；
R′是氫或-(CH2)2-NR1R2，(R1是胺的常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)
n是1或2；R3是氫或-OR4[R4是氫或O＝C-R5(R5是甲基或CH3OCH2-)；O＝NR6(R6是異丙基，苯基或-CH2CH2Cl.)；CH2OR7(R7是甲基，乙基或CH3OCH2CH2-)]；
其中，如果n是2，而R4是氫，則R不是氫；
如果n是2，而R3是H，則R不是氫；而且
如果R是-CH2CH2NHCH3，則R3不是氫。
5、包含下列通式(I)表示的喜樹堿衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽的抗腫瘤藥物，
其中
R是氫或-(CH2)2-NR1R2，(R1是氫或胺的常規(guī)保護(hù)基；R2是低級(jí)烷基，羥乙基或乙酰氧基乙基；而且R2可與相鄰的氮形成雜環(huán)化合物)；
n是1或2；R3是氫或-OR4[R4是氫或O＝C-R5(R5是甲基或CH3OCH2-)；O＝NHR6(R6是異丙基，苯基或-CH2CH2Cl.)；CH2OR7(R7是甲基，乙基或CH3OCH2CH2-)]；
其中，如果n是2，而R4是氫，則R不是氫；
如果n是2，而R3是H，則R不是氫；而且
如果R是-CH2CH2NHCH3，則R3不是氫。
全文摘要
本發(fā)明涉及喜樹堿衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽，其制備方法和包含該物質(zhì)的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的化合物是對(duì)喜樹堿的B環(huán)和E環(huán)進(jìn)行修飾的喜樹堿衍生物，其具有更好的水溶性和更強(qiáng)抗腫瘤活性。
文檔編號(hào)A61K31/44GK1168139SQ9619139
公開日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1996年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月9日
發(fā)明者朱尚涉, 李熙淳, 金俊謙, 玉光大, 車庚會(huì), 金命九, 李剛均, 金鐘旼, 金姬辰, 河廷美 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘根堂