專利名稱：心血管活性多肽以及它們的合成和在醫(yī)學中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一系列具有靶向作用的心血管活性多肽以及它們的化學合成和在醫(yī)學方面的應用。
心血管疾病對人類健康有重要影響。在心血管疾病中有許多嚴重病癥與血管栓塞有關。例如，眾所周知的中風，腦卒中，心肌梗死，半身不遂等都源于血管栓塞。八十年代治療血栓性疾病的手段都存在不同程度的不足，例如血管成型術、激光再通術，以及以尿激酶、tPA、鏈激酶為代表的藥物溶栓等手段除再栓塞傾向大和費用高之外，外源性藥物(例如tPA)還可以引起免疫源性反應。尋找新型的多肽抗血栓藥物具有重要價值。
P6A是纖維蛋白降解產物，在電刺激造成的狗冠脈血栓模型上可以恢復冠脈血流(Metha et al.，J.Cadiovasc，Pharmacol.，1991，18，231)，申請者采用化學方法合成的P6A(趙明，彭師奇等，化學通報，1990，12，31)的生物學檢測表明，P6A是一種有前途的抗血栓藥物(唐朝樞，趙明，彭師奇等，北京醫(yī)科大學學報，1990，22，416)。
血小板活化在血栓形成中有重要作用，當纖維蛋白與血小板表面GPIIb/IIIa受體結合時，纖維蛋白中的RGD序列是GPIIb/IIIa受體識別的關鍵序列。含RGD多肽具有明顯的抗血小板聚集和抗血栓作用(Andrieax A et al.，J，Biol.Chem.，1988，264，9258；Parker R.I.，Blood.，1989，74，1226)。申請者采用化學方法合成的RGDS的生物學檢測表明，RGDS不僅具有明確的抗血小板聚集作用(趙明，彭師奇等，J.Chines Pharm.，1993，2，18)還具有明確的靶向作用(唐朝樞，趙明，彭師奇，北京醫(yī)科大學學報，1994，26，174)。
本發(fā)明的根本目標是把P6A及類似物與含RGD四肽綴合，提供一系列具有靶向作用的心血管活性多肽，它們將顯示作用強，選擇性高，毒副作用小等特征。
申請者以P6A為先導化合物，對P6A的N端氨基酸進行替換，實施結構修飾，合成了一系列通式(1)的多肽AA-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(1)其中AA為L構型的氨基酸，例如為Ala，Gln，Glu，Gly，Asp，Arg，Asn，Lys以及Tyr-Ala。本發(fā)明的這類多肽顯示很強的舒血管活性，其中有些化合物優(yōu)于P6A，例如Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的舒血管活性明顯比P6A強。
本發(fā)明這類多肽顯示很強的降血壓和抗血栓活性，其中有些化合物優(yōu)于P6A，例如Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的降壓作用和抗血栓作用明顯強于P6A。
本發(fā)明在RGDS的基礎上進一步合成了RGDV和RGDF，比較了RGDS，RGDV和RGDF的抗血小板聚集，舒血管和抗血栓活性。
申請者根據(jù)脂質體包裹尿激酶用RGDS修飾之后具有向血栓形成部位選擇性分布的特點，提出含RGD四肽具有靶向作用。
本發(fā)明根據(jù)P6A及類似物的抗血栓作用及含RGD四肽的靶向特點，設計并合成了一系列通式(2)的雜交肽AA-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-AA′(2)其中AA為L構型的氨基酸，例如為Ala，Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe。
本發(fā)明的這類雜交肽顯示明確的抗血小板聚集活性，舒血管活性以及抗血栓活性。離體和整體動物實驗表明，本發(fā)明的化合物具有作用強，選擇性高，毒副作用小等優(yōu)點，是優(yōu)秀的抗血栓劑。
通式(1)和通式(2)的多肽可以具體化為Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(3)Lys-Arg-Pre-Ala-Lys-OH(4)Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(5)Asp-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(6)Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(7)Gla-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(8)Gla-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(9)Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(10)Tyr-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(11)Arg-Gly-Asp-Ser-OH (12)
Arg-Gly-Asp-Val-OH(13)Arg-Gly-Asp-Phe-OH(14)Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser-OH(15)Gla-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser-OH (16)Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val-OH(17)Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val-OH(18)Ala-Arg-Pro-Ala-Lya-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(19)Gla-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(20)上述多肽是以化合物3和12，13，14為先導化合物制備的一系列類似物。這類多肽的特點是具有靶向作用，因而作用強，選擇性高，毒副作用小，與臨床應用的尿激酶或tPA相比，這類心血管活性多肽結構簡單，易于化學合成，便于純化，價格低康，無免疫源性反應，具有良好的應用前景。
為了全面解釋本發(fā)明，下面給出一系列實施例，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。制備實施例1，Boc-Ala-Lys(ClZ)·OCH347mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入31mg(0.27mmol)N-羥基丁二酰亞胺和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液在室溫下減壓濃縮，殘留物用石油醚析晶，得對應的活潑酯。
91mg(0.25mmol)HCl·Lys(ClZ)·OCH3，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的活潑酯中間體，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。37℃下減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化鈉水溶液，飽和檸檬酸水溶液，飽和氯化鈉水溶液洗滌，分出有機層，并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液37℃下減壓濃縮(上述操作在下文中統(tǒng)稱常規(guī)處理)，得標題化合物120mg(96％)，mp78-79℃，[α]D20-6(c0.2，CHCl3)，F(xiàn)AB-MS(m/e)501[M＋H]+。制備實施例2，HCl·Ala-Lys(ClZ)·OCH3125mg(0.25mmol)Boc-Ala-Lya(ClZ)·OCH3與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶解，室溫攪拌4小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物在室溫下減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解并室溫下濃縮，如此反復數(shù)次，直至除凈游離的氯化氫(上述操作在下文中統(tǒng)稱常規(guī)處理)。殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例3，Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH322mg(0.25mmol)Boc-Pro-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入31mg(0.27mmol)N-羥基丁二酰亞胺和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液在室溫下減壓濃縮，殘留物用石油醚析晶，得對應的活潑酯。
109mg(0.25mmol)HCl·Ala-Lys(ClZ)·OCH3，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的活潑酯中間體，室溫反應26小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物135mg(90％)，mp89-91℃，[α]D20-8(c0.2，CHCl3)，F(xiàn)AB-MS(m/e)598 [M+H]+。制備實施例4，HCl·Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3150mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混溶，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)方法處理，殘留物用無水乙醚析晶，直接用于下步反應。制備實施例5，Boc-Arg(Tos)-Pre-Ala-Lys(ClZ)·OCH3107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入31mg(0.27mmol)N-羥基丁二酰亞胺和27mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液在室溫下減壓濃縮，殘留物用石油醚析晶，得對應的活潑酯。
134mg(0.25mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的活潑酯中間體，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物198mg(87％)，mp96-99℃，[α]D20-7(c0.2，CHCl3)，F(xiàn)AB-MS (m/e)908[M+H]+。制備實施例6，HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3227mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混合，室溫攪拌6小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例7，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ).OCH3，Boc-Asp(OcHex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Asa-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Glu(Ochex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，Boc-Tyr(Cl2Z)-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3的制備47mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH，104mg(0.25mmol)Boc-Lys(ClZ)·OH，62mg(0.25mmol)Boc-Gln-OH，107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH，79mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH，82mg(0.25mmol)Boc-Gln(OcHex)-OH，58mg(0.25mmol)Boc-Asn-OH及44mg(0.25mmol)Boc-Gly-OH按活潑酯制備通法，制成對應的活潑酯。
210mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3分別與上述制備的活潑酯按常規(guī)接肽法反應48小時，得對應的產物，203mg(83％)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp70-72℃；[α]D20-0.25(c1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)979[M+H]+；241mg(80％)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp90-92℃，[α]D20-0.18(c 1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1204[M+H]+；234mg(77％)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp99-102℃，[α]D20-0.09(c1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1218[M+H]+；224mg(81％)Boc-Asp(ocHex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp67-69℃，[α]D20-0.17(c 1 CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1105[M+H]+；204mg(80％)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp85-88℃，[α]D20-0.21(c 1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1022[M+H]+；221mg(79％)Boc-Glu(OcHex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp62-65℃，[α]D20-0.19(c 1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1119[M＋H]+；194mg(75％)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp66-69℃，[α]D20-0.22(c1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e) 1036[M+H]+；及193mg(80％)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，mp78-81℃，[α]D20-0.18(c 1，CH3OH)，F(xiàn)AB-MS(m/e)965[M+H]+。制備實施例8，HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3245mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混溶，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)方法處理，殘留物用無水乙醚析晶，直接用于下步反應。制備實施例9，Boc-Tyr(Cl3Bzl)-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3106mg(0.25mmol) Boc-Tyr(Cl2Bzl)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入31mg(0.27mmol)N-羥基丁二酰亞胺和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液在室溫下減壓濃縮，殘留物用石油醚析晶，得對應的活潑酯。
229mg(0.25mmol)HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的活潑酯中間體，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)進行后處理，得標題化合物284mg(87％)。電噴霧質譜(m/e)1300[M]+。mp85-86℃，[α]D20-20(c 1，CH3OH)。制備實施例10，Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Lys-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Asp-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Tyr-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制備147mg(0.15mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，181mg(0.15mmol)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，183mg(0.15mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，166mg(0.15mmol)Boc-Asp(OcHex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OCH3，153mg(0.15mmol)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，168mg(0.15mmol)Boc-Glu(OcHex)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，155mg(0.15mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OCH3，145mg(0.15mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，195mg(0.15mmol)Boc-Tyr(Cl2Z)-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)·OCH3，分別溶于適量1N氫氧化鈉/甲酯溶液，冰浴下攪拌2小時，TLC顯示原料點消失。2N鹽酸中和，使pH為7，室溫下減壓濃縮蒸去甲醇，殘留表6化合物3-11的物理常數(shù)
物再用2N鹽酸酸化至pH2，殘留物減壓濃縮至干。皂化產物加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚以及5mlCF2SO3H-CF3COOH(1∶4)，0℃反應2小時，停止反應，減壓除去溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G10純化，得Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Lys-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Asp-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH，Gly-Arg-Pro-Ala-Lyn-OH，Tyr-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH。制備實施例11，Boc-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl79mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
80mg(0.25mmol)HCl·Ser(Bzl)-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。室溫下減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化鈉水溶液，飽和檸檬酸水溶液，飽和氯化鈉水溶液洗滌，分出有機層并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液37℃下減壓濃縮，得標題化合物131mg(90％)。mp112-113℃，[α]20D-25(c 0.2 CHCl3)。制備實施例12，HCl·Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl146mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物在室溫下減壓濃縮，殘留物再用乙酸乙酯溶解，并室溫下濃縮，如此反復數(shù)次，直至除凈游離的氯化氫。殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例13，Boc-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl44mg(0.25mmol)Boc-Gly-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
130mg(0.25mmol)HCl·Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物143mg(89％)。mp96-97℃，[α]20D-32(c 0.3，CHCl3)。制備實施例14，HCl·Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl144mg(0.25mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例15，Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl115mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氯唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
144mg(0.25mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物197mg(83％)。FAB-MS(m/e)950[M+H]+。mp101-102℃，[α]20D-34(c 0.4，CHCl3)。制備實施例16，H-Arg-Gly-Asp-Ser-OH的制備142mg(0.15mmol)的Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5ml CF3COOH-CF3SO2H(4∶1)的混合溶液，0℃反應1小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用SephadexG10純化，得到55mg(85％)的RGDS。PAB-MS(m/e)434[M+H]+。mp110-111℃，[α]20D-20(c0.2，6N HCl)。制備實施例17，Boc-Asp(OcHex)-Val-OBzl79mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol，N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCD，濾液直接用于下步反應。
61mg(0.25mmol)HCl·Val-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。室溫下減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化鈉水溶液，飽和檸檬酸水溶液，飽和氯化鈉水溶液洗，分出有機層并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液37℃下減壓濃縮，得標置化合物121mg(96％)。mp107-108℃，[α]20D-26(c0.3，CHCl3)。制備實施例18，HCl·Asp(OcHex)-Val-OBzl126mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-Val-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)方法處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例19，Boc-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl44mg(0.25mmol)Boc-Gly-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
110mg(0.25mmol)HCl·Asp(OcHex)-Val-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物129mg(92％)。mp109-110℃，[α]20D-19(c0.2，CHCl3)。制備實施例20，HCl·Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl124mg(0.25mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)方法處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例21，Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBxl107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于適量無水THF，在冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
124mg(0.25mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物187mg(86％)。FAB-MS(m/e)869[M-2H]+。mp97-98℃，[α]20D-24(c 0.4，CHCl3)。制備實施例22，H-Arg-Gly-Asp-Val-OH的制備131mg(0.15mmol)的Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3COOH-CF3SO2H(1∶4)混合溶液，0℃反應1小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G10純化，得到58mg(87％)RGDV。電噴霧質譜(m/e)446[M＋H]+。mp120-121℃，[α]20D-20 (c0.3，6NHCl)。制備實施例23，Boc-Asp(OcHex)-Phe-OBzl79mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
73mg(0.25mmol)HCl·Phe-OBzl，27mg(0.27mmol) N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。室溫下減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化鈉水溶液，飽和檸檬酸水溶液，飽和氯化鈉水溶液洗，分出有機層并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液37℃下減壓濃縮得標題化合物130mg(94％)。mp114-115℃，[α]20D-22(c0.3，CHCl3)。制備實施例24，HCl·Asp(OcHex)-Phe-OBzl138mg(0.25mmol)Boc-Asp(OcHex)-Phe-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)方法處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例25，Boc-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl44mg(0.25mmol)Boc-Gly-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
122mg(0.25mmol)HCl·Asp(OcHex)-Phe-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)后處理，得標題化合物139mg(91％)。mp108-111℃，[α]20D-22(c0.3，CHCl3)。制備實施例26，HCl·Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl152mg(0.25mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例27，Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol) N-羥基苯駢三氯唑和56mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在0℃放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
136mg(0.25mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物200mg(87％)。電噴霧質譜(m/e)942[M+Na]+。mp98-99℃，[α]20D-25(c0.4，CHCl3)。制備實施例28，H-Arg-Gly-Asp-Phe-OH的制備138mg(0.15mmol)的Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3COOH-CF3SO3H混合溶液(4∶1)，0℃反應1小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G10純化得62mg(83％)RGDF。電噴霧質譜(m/e)494[M+H]+。mp125-126℃，[α]20D-40(c0.2，6N HCl)。制備實施例29，Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl47.3mg(0.25mmol) Boc-Ala-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氯唑和55.6mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置于冰箱中24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
101.3mg(0.25mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應24小時，TLC顯示原料點消失。37℃下減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化鈉水溶液，飽和檸檬酸水溶液，飽和氯化鈉水溶液洗滌，分出有機層，并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液37℃下減壓濃縮(上述操作在下文中統(tǒng)稱常規(guī)處理)，得標題化合物130mg(96％)。制備實施例30，HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl135mg(0.25mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶解，室溫下攪拌4小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物在室溫下減壓濃縮，殘留物再用乙酸乙酯溶解并室溫下濃縮，如此反復數(shù)次，直至除凈游離的氯化氫(上述操作在下文中統(tǒng)稱常規(guī)處理)。殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例31，Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl54mg(0.25mmol)Boc-Pro-OH溶于適量無水THF，冰水浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和55.6mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
119mg(0.25mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的中間體，室溫反應26小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物144mg(90％)。制備實施例32，HCl·Pro-Ala-Lys(Z )-OBzl160mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混溶，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，直接用于下步反應。制備實施例33，Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol N-羥基苯駢三氮唑和55.6mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
144mg(0.25mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)進行后處理，得標題化合物207mg(87％)，F(xiàn)AB-MS(m/e)950[M＋H]+。制備實施例34，HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl237mg(0.25mmol) Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混合，室溫攪拌6小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例35，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl47.3mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol) N-羥基苯駢三氯唑和55.6mg(0.27mmol)DCC，反應混合物置冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
212mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物217mg(85％)，mp86-89℃，[α]20D-13(c0.2，CHCl3)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1020[M＋H]+。制備實施例36，HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl237mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯混合，室溫攪拌6小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例37，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl62mg(0.25mmol)Boc-Gln-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入36.5mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應212mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物235mg(87％)，mp83-85℃，[α]20D-9(c0.3，CHCl3)，F(xiàn)AB-MS(m/e)1077[M+H]+。制備實施例38，HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl238mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例38a，HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl218mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例39，HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl230mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl用適量6N無水氯化氫-乙酸乙酯溶解，室溫攪拌4.5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，殘留物用無水乙醚析晶，得標題化合物，直接用于下步反應。制備實施例40，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH153mg(0.15mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，溶于適量1N氫氧化鈉/甲醇溶液，冰浴下攪拌2小時，TLC顯示原料點消失。2N鹽酸中和，使PH為7，室溫下減壓濃縮除去甲醇，殘留物再用2N鹽酸酸化至pH2，殘留物減壓濃縮至干，直接用于下步反應。制備實施例41，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH161mg(0.15mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，溶于適量1N氫氧化鈉/甲醇溶液，冰浴下攪拌2小時，TLC顯示原料點消失。2N鹽酸中和，使pH為7，室溫下減壓濃縮蒸去甲醇，殘留物再用2N鹽酸酸化至pH2，殘留物減壓濃縮至干，直接用于下步反應。制備實施例42，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl232mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入365mg(0.27mmol) N-羥基苯駢三氮唑和556mg(0.27mmol)mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
223mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理得標題化合物443mg(95％)，[α]20D-60(c0.3，CHCl3)，mp98-101℃，電噴霧質譜(m/e)1783[M＋Na]+。制備實施例43，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl247mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入365mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
223mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物447mg(93％)，[α]20D-25(c0.2，CHCl3)，mp93-95℃，電噴霧質譜(m/e)1818[M+H]+。制備實施例44，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl232mg(0.25mmol) Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入365mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
203mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物416mg(93％)，[α]20D-29(c0.5，CHCl3)，mp106-108℃，電噴霧質譜(m/e)1706[M＋H＋Na]+。制備實施例45，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl247mg(0.25mmol) Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入365mg(0.27mmol) N-羥基苯駢三氯唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應
203mg(0.25mmol)HCl-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物434mg(94％)，[α]20D-30(c0.3，CHCl3)，mp118-120℃，電噴霧質譜(m/e)1763[M+H+Na]+。制備實施例46，Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl232mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，365mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氮唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
215mg (0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物436mg(95％)，[α]20D-32(c0.5，CHCl3)，mp108-110℃，電噴霧質譜(m/e)1754[M+H+Na]+。制備實施例47，Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl247mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入365mg(0.27mmol)N-羥基苯駢三氯唑和556mg(0.27mmol)DCC，反應混合物在冰箱中放置24小時，濾除DCU，濾液直接用于下步反應。
215mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl，273mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混溶，加入上面所得到的濾液，室溫反應30小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)處理，得標題化合物440mg(93％)，[α]20D-6.7(c0.3，CHCl3)，mp87-90℃，電噴霧質譜(m/e)1810[M＋Na]+。制備實施例48，Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser-OH264mg(0.15mmol)的Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚以及5mlCF3SO3H-CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化得目標化合物125mg(87％)，mp140-141℃，[α]20D-50(c0.3，6NHCl)。電噴霧質譜(m/e)956[M]+。制備實施例49，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser-OH261mg(0.15mmol)的Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚以及5mlCF3SO3H-CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化，得目標化合物131mg(86％)，mp137-139℃，[α]20D-38(c0.2，6N HCl)，電噴霧質譜(m/e)1015[M+2H]+。制備實施例50，Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val-OH273mg(0.15mmol)的Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3SO3H-CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化，得目標化合物124mg(85％)，[α]20D-40(c0.2，6N HCl)，mp147-149℃，電噴霧質譜(m/e)969[M+H]+。制備實施例51，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val-OH260mg(0.15mmol)的Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Val-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3SO3H-CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化，得目標化合物135mg(88％)，[α]20D-53.3(c0.3，6N HCl)，mp131-134℃，電噴霧質譜(m/e)1050[M+2H+Na]+。制備實施例52，Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe-OH252mg(0.15mmol)的Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3SO3H-CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化，得目標化合物127mg(83％)，[α]20D-70(c0.2，6N HCl)，mp150-153℃，電噴霧質譜(m/e)1017[M+H]+。制備實施例53，Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe-OH268mg(0.15mmol)的Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Phe-OBzl中加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚和5mlCF3SO3H--CF3COOH(1∶4)混合液，0℃反應4小時。減壓去除溶劑，殘留物用無水乙醚固化。固體物用Sephadex G15純化，得目標化合物145mg(90％)，mp142-145℃，[α]20D-39(c0.2，6N HCl)，電噴霧質譜(m/e)1074 [M+H]+。生物活性實施例1，P6A及類似物的舒血管活性取分離好的大鼠胸主動脈肌條約3mm，掛于5ml灌流槽內，連接換能器，用含95％O2-5％CO2混合氣平衡的KH液灌流。15分鐘后加入NE(終濃度1×10-9mol/L)，待主動脈肌條收縮達到峰值后沖洗掉，再穩(wěn)定30分鐘。灌流槽內換液后，加入NE(1×10-9mol/L)，待主動脈肌條收縮達峰值時，注入待測藥物，觀察舒血管效應。結果見于表2.生物活性實施例2，P6A及類似物的血壓及心率效應在離體動物實驗的基礎上，選擇舒血管作用比較好的Gln-Arg-Pro-Ala-Lys與P6A分別使用0.020mmol/kg和0.022mmol/kg的劑量，觀察其對大鼠平均動脈血壓(MAP)的影響。體重200～250g雄性Wistar大鼠，以20％烏拉坦腹腔麻醉(5ml/kg)，頸動脈插管，連接四導生理記錄儀，描記MAP和心率(HR)。頸外靜脈插管給藥，注射肝素抗凝(1000U/kg)，術后穩(wěn)定30分鐘。隨機分組(n＝5)，分別靜脈注射待測藥物。結果見于表3，4。
表2.化合物3-11對NE收縮的鼠動脈肌條的舒張效應
n＝6，NE(10-9M)收縮的幅度為100％；負值為縮血管效應與化合物3相比較，**P＜0.05，***P＜0.01；#n＝2表3化合物9和P6A對大鼠平均動脈血壓的影響
n＝4劑量，P6A0.022mmol/kg；化合物90.020mmol/kg
表4化合物9和P6A對大鼠心率的影響
生物活性實施例3，P6A及類似物的抗血栓作用在上述實驗的基礎上，本文還觀察了P6A和Gla-Arg-Pro-Ala-Lys在整體動物上的抗血栓作用。將200-250g雄性Wister大鼠在麻醉下分離出兩側頸總動脈，于靜脈緩緩注射藥物或溶媒(生理鹽水)，然后，立即用經25％FeCl3浸泡過的紗布條(寬0.5cm)包裹動脈10min，取調紗布剪下0.5cm動脈段，剝離出血栓，室溫放置24小時后稱重。結果見表5。
表5 P6A及化合物9的抗血栓作用
與生理鹽水組比較，**P＜0.01生物活性實施例4，RGDS，RGDV，RGDF的抗血小板聚集作用大鼠麻醉下腹主動脈取血(用0.38％枸櫞酸鈉抗凝)，離心制備富血小板血漿，血小板數(shù)調至5×108個血小板/ml，血小板聚集在37℃下，在雙道血小板聚集儀中采用標準比濁技術進行血小板聚集研究。使用的激動劑為PAF(終濃度，5μl)進行PAF誘導的抗血小板聚集研究。RGDV或RGDF溶于生理鹽水，并加入100μl富血小板的血漿中，37℃攪拌。用生理鹽水作對照。有關數(shù)據(jù)列入表6。
表6 RGDS，RGDV，RGDF對PAF誘導的血小板聚集的抑制作用
生物活性實施例5，RGDS，RGDV，RGDF的舒血管作用將斷頭大鼠的主動脈條立即放入裝有5ml用95％O2-5％CO2飽和的KH溶液(pH7.4)中。主動脈條連接到張力轉換器上，記錄舒張-收縮曲線。主動脈條使用1×10-9mol/L的NE收縮。收縮值達峰值后洗凈主動脈條，并穩(wěn)定30分鐘。更換溶液后，加入NE(1×10-9mol/L)。當主動脈條的收縮達峰值時，施用RGDV，RGDF以便觀察血管舒張效應。有關數(shù)據(jù)列入表7。生物活性實施例6，RGDS，RGDV，RGDF的抗血栓作用將200-250g Wister雄性大鼠麻醉，分離出兩側頸總動脈，靜脈緩緩注射藥物或生理鹽水，然后立即用經25％FeCl3浸泡過的紗條(寬0.5cm)包裹動脈10min，取掉紗布，剪下0.5cm動脈段，剝離出血栓室溫放置24h后稱重，有關數(shù)據(jù)列入表8。
表7 RGDS，RGDV，RGDF對NE收縮的血管的舒張效應
表8 RGDS，RGDV，RGDF的抗血栓作用
與對照組比較，*P＜0.05生物活性實施例7，雜交肽的抗血栓作用將200-250g Wister雄性大鼠麻醉，分離出兩側頸總動脈，靜脈緩緩注射藥物或生理鹽水，然后立即用經25％FeCl3浸泡過的紗條(寬0.5cm)包裹動脈10min，取掉紗布，剪下0.5cm動脈段，剝離出血栓室溫放置24h后稱重，有關數(shù)據(jù)列入表9。
表9雜交肽的抗血栓作用
與生理鹽水組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001與RGDS及RGDV組比較，#P＜0.05生物活性實施例8，雜交肽的舒血管活性的測定取分離好的大鼠胸主動脈約3mm，懸掛于5ml灌流槽內，連接換能器，用含95％O2-5％CO2混合氣平衡的KH液灌流。15分鐘后加入NE(終濃度為1×10-9/L)，待主動脈收縮達到峰值后沖洗掉，再穩(wěn)定30分鐘。灌流槽內換液后，加入NE (終濃度為1×10-9/L)，待主動脈收縮達到峰值時，注入待側藥物，觀察舒血管效應。結果見表10(重復觀察兩次)。
表10化合物15-20對NE收縮的血管的舒張效應
權利要求
1.本發(fā)明涉及對P6A進行結構修飾，合成了一系列通式(1)的多肽，其特點在于這類多肽具有明確的舒血管，降血壓和抗血栓作用，其中有的化合物明顯地比P6A優(yōu)秀，在醫(yī)學方面有重要的應用前景；本權利要求涉及通式(1)的多肽AA-Arg-Pro-Ala-Lys-OH(1)其中AA為L構型氨基酸，例如Ala，Arg，Gly，Gln，Glu，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，涉及它們的化學合成以及在醫(yī)學方面的應用。
2.權利要求1的通式(1)多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala，Arg，Gly，Gln，Glu，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，的化學合成用。
3.權利要求1的通式(1)多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala，Arg，Gly，Gln，Gln，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，在醫(yī)學方面的應用。
4.權利要求1的通式(1)多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala，Arg，Gly，Gln，Glu，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，作為擴血管藥物使用。
5.權利要求1的通式(1)多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala，Arg，Gly，Gln，Gla，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，作為降血壓藥物使用。
6.權利要求1的通式(1)多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala，Arg，Gly，Gln，Glu，Asp，Asn，Lys或Tyr-Ala，作為抗血栓藥物使用。
7.本發(fā)明涉及將P6A及類似物與含RGD四肽綴合，合成了一系列通式為(2)的雜交肽，其特點在于這類雜交肽具有明確的舒血管，降血壓和抗血栓作用，由于它們具有靶向作用，因而作用強，選擇性高，毒副作用小，在醫(yī)學方面有重要的應用前景；本權利要求涉及通式(2)的多肽AA-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-AA′-OH(2)其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，涉及它們的化學合成以及在醫(yī)學方面的應用。
8.權利要求7的通式(2)的多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，的化學合成。
9.權利要求7的通式(2)的多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，在醫(yī)學方面的應用。
10.權利要求7的通式(2)的多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，作為擴血管藥物使用。
11.權利要求7的通式(2)的多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，作為降血壓藥物使用。
12.權利要求7的通式(2)的多肽，其中AA為L構型氨基酸，例如為Ala或Gln；AA′為L構型的氨基酸，例如為Ser，Val，Phe，作為抗血栓藥物使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(1)和通式(2)的多肽，AA-Arg-Pro-Ala-Lys-OH (1)AA-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-AA，-OH (2)，其中AA和AA′為L構型的氨基酸，涉及它們的合成和在醫(yī)學方面的應用，例如作為擴血管，降血壓和抗血栓藥物使用，涉及以這類多肽作為活性成分的藥物組合物。離體和整體動物實驗表明，本發(fā)明的這類多肽具有靶向作用，因而具有作用強，選擇性高，毒副作用小等優(yōu)點，是優(yōu)秀的抗血栓劑。
文檔編號A61P9/08GK1146458SQ95106340
公開日1997年4月2日 申請日期1995年6月13日 優(yōu)先權日1995年6月13日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 王超, 唐朝樞, 王銀葉 申請人:北京醫(yī)科大學