專利名稱：用于癌癥治療的新實體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子嵌合體;感染性病毒粒子;其構建方法;含有它們的藥物制劑;它們在治療上的應用，特別是在病毒指導的酶前藥治療(具體說是癌癥的治療，更具體地說是肝細胞癌的治療)上的應用;以及可被雜合酶催化成細胞毒性或細胞抑制性代謝物的藥劑(如嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶)在病毒指導的酶前藥治療上的應用。
所有的癌癥是全世界的主要病因之一。癌癥化療領域的研究已經(jīng)得到了多種具有不同程度療效的抗腫瘤藥劑。臨床上應用的標準藥劑包括亞德里亞霉素、放線菌素D、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、順氯氨鉑、長春新堿和長春花堿。但是，已知這些現(xiàn)有的抗腫瘤藥劑有各種缺點，例如對健康細胞有毒、某些類型的腫瘤產(chǎn)生抗性。其它形式的療法如外科手術也是已知的。但本領域?qū)I(yè)人員認識到需要治療腫瘤的新方法和新實體。
肝細胞癌(HCC)是當今世界主要的惡性疾病之一，其中發(fā)病率最高的是日本、中國、亞洲的其它地區(qū)和非洲的亞撒哈拉地區(qū)。最近的證據(jù)表明，歐洲和北美的肝細胞瘤發(fā)病率在上升。估計這種疾病每年造成高達大約1，250，000人的死亡，或者這一死亡人數(shù)與該疾病有關，因而從數(shù)字上看這是世界上主要的惡性疾病之一。
肝細胞癌的預后總是很差，遍布世界的發(fā)病率幾乎與死亡率相等。診斷后的平均生存時間低于四個月。只偶爾見到長期生存(定義為診斷后生存一年以上)。大多數(shù)肝細胞癌患者或者死于伴隨或不伴隨大量出血的肝衰竭并發(fā)癥，或者死于巨大的腫瘤負荷的一般作用，這些作用伴有惡病質(zhì)、營養(yǎng)不良、感染和膿毒癥。雖然會發(fā)生遠距離轉移(高達90%的患者在死亡時有轉移腫瘤)，但最經(jīng)常限制生存的仍是區(qū)域性疾病。因此，雖然人們會認識到轉移性疾病的治療也具有重要意義，但旨在控制肝腫瘤的治療才是適當?shù)?Kew M.C.Postgraduate Medical Journal 59(Suppl.)78-87，1983;Berk.P.(Ed)Seminars in Liver Disease 4(2)，Thieme Stratton Inc.N.Y.N.Y.，1984)。
臨床醫(yī)師現(xiàn)有的療法從整體上說并不是這種疾病的有效療法(Nerenstone等，Cancer Treatment Reviews 151-31，1988)。迄今為止，外科手術一直是唯一的有效療法。但在作出診斷時，絕大多數(shù)患者不能承受徹底的外科手術。在某些研究(Nerenstone等，同上)中發(fā)現(xiàn)，能夠承受外科手術的患者不足3%，并且在這個很小的百分比中，有大約50%出現(xiàn)術后病變(Nerenstone等，同上)。
體內(nèi)單一或配伍藥劑化療法和放射療法基本無效，這更增加了對治療這種疾病的新途徑和新療法的需求。
基因療法涉及把某些新基因穩(wěn)定地整合到特定的靶細胞中，并在整合后表達這些基因，從而改變該特定靶細胞的表型(綜述見Anderson，W.F.Science 226401-409，1984;McCormick，D.Biotechnology 3690-693，1985)?；鶊F療法對涉及一個缺陷酶或缺失酶的置換的遺傳病的治療可能是有益的，所述的酶有LeschNyhan病中的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶;嚴重免疫缺陷疾病中的嘌呤核苷磷酸化酶;嚴重綜合免疫缺陷病中的腺苷脫氨酶。但基因療法仍未應用于臨床，雖然某些類型的基因療法可能很快就要應用于某些疾病。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有可能用能夠選擇性地轉化為細胞毒性或細胞抑制性代謝物的化學藥劑，選擇性地抑制哺乳動物癌細胞的生長或?qū)⑵錃⑺?。達到這一目的方法是構建一種分子嵌合體，它包含一個“靶組織特異性”轉錄調(diào)控順序(TRS)，該順序在靶組織如癌細胞中被選擇性激活，這便控制了一種雜合酶的表達。此分子嵌合體可通過合適的載體進行操作并摻入感染性病毒粒子中。給患者施用含有分子嵌合體的感染性病毒粒子后，即在靶細胞內(nèi)選擇性地表達出酶。這樣便可就地達到施用這樣一些化合物的目的，這些化合物能被上述酶選擇性地代謝成某些代謝物，而這些代謝物要么被進一步代謝成細胞毒性或細胞抑制性藥劑，要么實際上是細胞毒性或細胞抑制性藥劑。
本發(fā)明是普遍適用的，并將就肝細胞癌來說明。
如上所述，患有肝細胞癌的絕大部分患者死于原發(fā)腫瘤。但大約有90%的肝細胞癌患者在死亡時有明顯的轉移性病變。這些轉移呈現(xiàn)出典型的原發(fā)腫瘤表型，因而這些轉移也將選擇性地表達雜合酶，從而將本文限定的所施用的化合物選擇性地激活為細胞毒性或細胞抑制性代謝物。
可以采用多種酶前藥配伍方式，其前提是該酶能夠直接或通過一種中間體將所施用的化合物激活為細胞抑制性或細胞毒性代謝物。同樣，化合物的選擇將取決于所用的酶系統(tǒng)，但必須被該酶直接或間接地選擇性代謝為細胞毒性或細胞抑制性代謝物。這里所用的術語雜合酶是指一種表現(xiàn)出適當?shù)倪x擇特性的酶。
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)編碼一種特異性的胸苷激酶蛋白。該基因已作了克隆及順序測定和定性(J.Gen.Virol.671759-1816，1986)。與哺乳動物酶不同的是，VZV胸苷激酶能選擇性地使特異的嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶化合物單磷酸化。此外，本發(fā)明人還發(fā)明，某些嘌呤和嘧啶類似物，特別是下文限定的式(Ⅰ)和(Ⅱ)的化合物，在經(jīng)過遺傳修飾而能選擇性地表達VZV胸苷激酶的特定哺乳動物細胞中，轉化成細胞毒性或細胞抑制性代謝物。例如，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤轉化成9-β-D-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤三磷酸(Ara ATP)。
其它酶前藥配伍包括細菌(例如假單胞菌)酶羧肽酶G2與前藥對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲?；劝彼岬呐湮?。由此化合物上切下谷氨酸部分，釋放出一種有毒的苯甲酸芥子。堿性磷酸酶(例如小牛腸堿性磷酸酶)能將無活性的磷酸化化合物，例如磷酸鬼臼乙叉苷、磷酸阿霉素、磷酸絲裂霉素，轉化成有毒的去磷酸化代謝物。青霉素V酰胺酶能將阿霉素和苯丙氨酸氮芥的苯氧乙酰胺衍生物轉化成有毒代謝物，真菌(例如尖鐮孢)胞苷脫氨酶能將5-氟胞苷轉化成有毒的5-氟尿嘧啶。
在哺乳動物細胞中，某些基團是普遍表達的。但大多數(shù)基團只在一定時間內(nèi)或在特定組織內(nèi)表達，或者在對細胞外誘導劑作出響應時被激活，例如，某些基因只在特定細胞類型的個體發(fā)育中的非常準確的時間，或者在對某些誘導性刺激作出響應時才活潑轉錄。這種調(diào)控作用部分地是由轉錄調(diào)控順序(例如啟動子和增強子調(diào)控DNA順序)與具有DNA結合作用的順序特異性蛋白轉錄因子之間的相互作用介導的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有可能改變某些哺乳動物組織，例如肝組織或轉化的肝組織，使其選擇性地表達如上所限定的雜合酶，例如VZV胸苷激酶。這可通過在一個表達盒中構建分子嵌合體來實現(xiàn)。
表達盒本身在分子生物學領域是公知的。這樣一種表達盒將含有為在哺乳動物細胞內(nèi)表達雜合酶所需的所有必需DNA順序。例如，優(yōu)選的表達盒將含有一種分子嵌合體，此嵌合體含有VZV胸苷激酶編碼順序、一個適當?shù)牟溉閯游锘蚨嗑巯佘账峄盘?即能在哺乳動物細胞內(nèi)起作用的多聚腺苷酸化信號)、以及正確取向的合適增強子和啟動子順序。
在哺乳動物細胞內(nèi)，編碼信使RNA的基因的完整而有效的轉錄調(diào)控，通常需要兩個DNA順序啟動子和增強子。啟動子位于緊接轉錄起始位點上游(5′)處。啟動子順序為準確而有效的轉錄起始所需。不同的基因特異性啟動子具有共同的組織形式。典型的啟動子包括一個稱為TATA盒的富含AT區(qū)(位于距轉錄起始位點5′端大約30個堿基對處)和一個或多個上游啟動子成分(UPE)。UPE是與順序特異性細胞核轉錄因子相互作用的主要靶子。啟動子順序的活性由稱為增強子的其它順序來調(diào)節(jié)。增強子順序可能與位于上游(5′)或下游(3′)的啟動子相距很遠。因而增強子以取向或位置依賴性方式起作用。但由于具有可互換的相似結構組織和功能，啟動子和增強子之間的絕對區(qū)別在某種程度上有隨意性。增強子由啟動子順序來提高轉錄速度。多半正是由于順序特異性轉錄因子與UPE間的相互作用和增強子順序，才使哺乳動物細胞實現(xiàn)了組織特異性基因表達。結合在UPE上的這些蛋白轉錄因子(組織特異性反式激活因子)和增強子(起順式作用的調(diào)控順序)的存在，使得轉錄機構的其它組分，包括RNA聚合酶，能夠以組織特異性選擇性和準確性啟動轉錄。
轉錄調(diào)控順序特別是啟動子和增強子的選擇將取決于靶組織。其實例包括分別特異于正常肝細胞和轉化肝細胞的清蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)轉錄調(diào)控順序(例如啟動子和增強子);用于胃腸道、肺、乳房和其它組織的轉化細胞的癌胚抗原(CEA)轉錄調(diào)控順序;用于成神經(jīng)細胞瘤的酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉移酶或神經(jīng)元特異性烯醇化酶轉錄調(diào)控順序;用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的膠質(zhì)纖維酸性蛋白轉錄調(diào)控順序;用于胰腺腫瘤的胰島素轉錄調(diào)控順序。
其它實例包括用于某些肝腫瘤的特異于γ-谷氨酰基轉肽酶的轉錄調(diào)控順序，以及用于某些肺腫瘤的多巴脫羧酶。此外，也可使用來自某些致癌基因的轉錄調(diào)控順序，因為這些順序多半在某些類型的腫瘤中表達。其中較好的例子包括在乳房腫瘤中表達的HER-2/neu致癌基因調(diào)控順序、和特異于成神經(jīng)細胞瘤的N-myc致癌基因的調(diào)控順序。
ALB和AFP基團就核酸順序、基團結構、氨基酸順序和蛋白二級折疊而言具有廣泛的同源性(綜述見Ingram等，PNAS 784694-4698，1981)。在個體發(fā)育中，這些基因彼此獨立地但交互地表達。在正常發(fā)育中，ALB的轉錄在出生前不久便起始，并持續(xù)于整個成年期。成年的ALB轉錄表達僅限于肝臟。AFP通常在胎肝、卵黃囊的內(nèi)臟內(nèi)胚層和胎兒胃腸道中表達，但在出生后不久就下降至檢測不出的水平，并且在非病原性或非再生性成年肝臟或其它正常成年組織中表達不顯著。但是，成人肝臟中的AFP轉錄在肝細胞癌中常常大大增強。此外，在睪丸的非精原細胞癌和混合癌、內(nèi)胚層竇腫瘤、某些畸胎癌以及某些胃腸腫瘤中，AFP的轉錄也會提高。AFP和ALB的肝特異性表達是由其基因的調(diào)控順序與存在于肝細胞核提取液中的反式激活轉錄因子之間的相互作用造成的。對產(chǎn)生在分子水平上結合的基因的肝細胞瘤特異性或一般肝特異性表達來說，分別優(yōu)選AFP和ALB轉錄調(diào)控順序，因為AFP和ALB基因在轉錄水平上受到調(diào)控，并且其mRNA屬于肝臟中最豐富的聚合酶Ⅱ轉錄本。
有幾種哺乳動物ALB和AFP啟動子和增強子順序已得到了鑒定(綜述見Genes and Develop.1268-276，1987;Science 23553-58，1987;The Journal of Biol.Chem.2624812-4818，1987)。這些順序分別使肝細胞(正常的和轉化的)和肝細胞瘤中的基因得以選擇性地和特異性地表達。
例如，如表1所示，有一個哺乳動物ALB啟動子包含在位于清蛋白基因轉錄起始位點5′端的300bp片段中。包含在距鼠清蛋白基因轉錄起始位點5′端300bp與8，500bp之間的順序，對肝特異性表達來說是非必需的。但有一個肝特異性增強子順序包含在一個位于距轉錄起始位點5′端8，500bp至10，400bp的片段內(nèi)(圖1A)。如果有了ALB啟動子和增強子成分，便可實現(xiàn)位于正確3′取向的雜合結構基因的肝特異性表達(圖1B)。如果去掉位于距轉錄起始位點5′端300bp和8，500bp之間的非必需插入順序，則相對于ALB啟動子和增強子順序位于正確取向的3′雜合結構基因仍維持肝特異性表達(圖1C)。非必需順序的去除用本領域公知的標準分子生物學方法來實現(xiàn)，從而得到可用來直接進行VZV胸苷激酶的肝特異性表達的分子嵌合體。
與ALB基團的調(diào)控結構相似，AFP基因的調(diào)控成分在某些肝臟病理現(xiàn)象(如肝細胞癌)中促進AFP的組織特異性表達(Mol.Cel.Biol.6477-487，1986;Science 23553-58，1987)。哺乳動物AFP基因的調(diào)控成分由一個特異的5′啟動子鄰接區(qū)(在某些哺乳動物中位于距該基因5′端85和52bp之間)組成。此順序?qū)τ谠诟渭毎鲋修D錄是必需的。此外，還有一些對鼠AFP基因非常確定的上游(5′)調(diào)控成分，其行為與經(jīng)典增強子相同(Mol.Cel.Biol.6477-487，1986;Science 23553-58，1987)。這些上游調(diào)控成分定名為成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它們位于距鼠AFP基因轉錄起始位點5′端1，000至7，600bp之間。這三個增強子結構域在產(chǎn)生AFP的組織特異性表達時，在功能上并不等價。成分Ⅰ和Ⅱ直接進行AFP肝特異性表達的能力最強。應該注意的是，甲胎蛋白基因的調(diào)控順序不僅有利地含有可供組織特異性轉錄激活的順序，而且有利地含有可供在不該表達AFP的組織內(nèi)阻遏表達的順序。人甲胎蛋白基因的調(diào)控區(qū)也已經(jīng)以類似的方式被定性(J.B.C.2624812，1987)。在胎肝、肝細胞瘤、睪丸非精原細胞癌、某些畸胎癌、某些胃腸腫瘤、以及特異表達AFP的其它正常和病理組織中，對AFP調(diào)控順序處于正確取向的結構基因?qū)⑹乖摻Y構基因得以選擇性地表達。
本發(fā)明提供一種分子嵌合體，該嵌合體包含一個DNA順序，該順序含有在一個表達盒中處于轉錄調(diào)控順序控制下的雜合基因編碼順序;能夠選擇性地在靶癌細胞中起作用的啟動子，例如能夠轉化癌細胞而使其選擇性地表達VZV胸苷激酶的啟動子。
本發(fā)明還在一個優(yōu)選具體方案中提供一種分子嵌合體，它包含一個轉錄調(diào)控順序，特別是一個啟動子，該啟動子能夠選擇性地在哺乳動物靶組織中被激活，并與VZV胸苷激酶基因編碼順序有效連接。
具體地說，本發(fā)明提供一種分子嵌合體，它包含酶(最好是VZV胸苷激酶)基因DNA編碼順序(包括適當?shù)亩嗑巯佘账峄樞?，該順序以3′位以正確的取向與一個哺乳動物靶組織特異性轉錄調(diào)控順序相連。該表達盒最好還含有一個增強子順序。
啟動子和增強子順序最好選自下列基因之一的轉錄調(diào)控順序清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素或γ-谷氨酰基轉肽酶、多巴脫羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合適的基因。最好分別用ALB或AFB的調(diào)控順序來直接進行肝特異性或肝細胞瘤特異性表達。
本發(fā)明的分子嵌合體可以利用標準的DNA重組技術來制備。例如，將VZV胸苷激酶基因(見圖2A和2B)的編碼順序和多聚腺苷酸化信號置于相對于必需的ALB和AFP轉錄調(diào)控成分正確的3′取向。這些分子嵌合體使VZV胸苷激酶得以分別在正常表達ALB或AFP的細胞中選擇性表達(圖3A和3B)。在哺乳動物肝臟、肝細胞瘤、某些胃腸道腫瘤、睪丸非精原細胞癌、某些畸胎癌和其它腫瘤中，VZV胸苷激酶基因的表達將使這里限定的相對無毒的阿拉伯糖苷和嘧啶類能夠選擇性地代謝成細胞毒性和/或細胞抑制性代謝物。
因此，本發(fā)明的第二方面提供一種構建分子嵌合體的方法，該方法包括將編碼雜合酶(如VZV胸苷激酶)基因的DNA順序與一個組織特異性啟動子相連接。
具體地說，本發(fā)明提供一種構建這里限定的分子嵌合體的方法，該方法包括，將一個編碼雜合酶(例如VZV胸苷激酶)基因編碼順序和多聚腺苷酸化信號的DNA順序，與一個哺乳動物組織特異性轉錄調(diào)控順序(如啟動子順序和增強子順序)相連接。
VZV胸苷激酶編碼順序和3′多聚腺苷酸化信號位于大約1，381bp的AccI/NdeI限制性核酸內(nèi)切酶片段內(nèi)(見圖2)。
最好是用含有VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化信號的1381bp AccI/NdeI片段與哺乳動物組織特異性啟動子和增強子順序連接，但應認識到，可以采用含有VZV胸苷激酶的其它DNA片段。此外，VZV胸苷激酶多聚腺苷酸化信號可以用其它合適的多聚腺苷酸化信號來代替，例如SV40病毒或其它哺乳動物基因的多聚腺苷酸化信號。
啟動子和增強子順序最好選自下列基因之一的轉錄調(diào)控順序清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨?；D肽酶、多巴脫羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合適的基因。
這些分子嵌合體可以用一個釋放系統(tǒng)釋放到靶細胞上。為給患者施用，必須提供一個能將分子嵌合體穩(wěn)定整合到細胞中的有效體內(nèi)釋放系統(tǒng)。已知的方法所利用的技術有磷酸鈣轉染、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體轉移、射彈法(Ballistic barrage)或還原病毒感染。這方面的綜述見Biotechnique 6(7)，1988。
整合合成基因的細胞還原病毒感染技術，采用了本領域已知的還原病毒穿梭載體(參見例如Mol.and Cell Biol.1986年8月號，2895頁)。還原病毒穿梭載體基本上是用包含在質(zhì)粒中的DNA形式的還原病毒產(chǎn)生的。這些質(zhì)粒還含有選擇和在細菌中生長所必需的順序。還原病毒穿梭載體已去除了內(nèi)源性親本還原病毒基因(如gag、pol和env)，并插入所要的DNA順序，如上述的分子嵌合體。但它們含有可供病毒包衣殼作用、原病毒對靶基因組的插入、信息拼接、終止和多聚腺苷酸化的適當?shù)倪€原病毒調(diào)控順序。還原病毒穿梭載體已從莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MLV)得到，但應認識到，也可使用其它還原病毒，例如密切相關的莫洛尼氏鼠肉瘤病毒。某些DNA病毒也可作為釋放系統(tǒng)使用。牛乳頭瘤病毒(BPV)在染色體外復制，因此以BPV為基礎的釋放系統(tǒng)有一個優(yōu)點，即所釋放的基因以非整合方式保持。
本發(fā)明的第三方面提供一種含有如前面所限定的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體。
還原病毒介導的基因轉移系統(tǒng)的優(yōu)點在于基因高效率地釋放到靶組織中、病毒基因組進行順序特異性整合(在5′和3′長末端重復(LTR)順序處)、所釋放的DNA與其它DNA釋放系統(tǒng)相比很少有重排。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選方案提供一種還原病毒穿梭載體，該載體包含一個DNA順序，其中含有一個5′病毒LTR順序、一個順式作用的潑西(psi)包衣殼順序、一個如前面所限定的分子嵌合體、以及一個3′病毒LTR順序(圖4A和圖4B)。
為有助于消除分子嵌合體的非組織特異性表達，一個優(yōu)選的具體方案是將該分子嵌合體置于與5′還原病毒LTR相反的轉錄取向(圖4A和圖4B)。此外，還可以加入一個由5′LTR順序轉錄驅(qū)動的顯性可選擇標記基因。這樣一個顯性可選擇標記基因可以是細菌的Ⅱ型新霉素抗性基因NEO(氨基糖苷3′磷酸轉移酶)，該基因賦予真核細胞對新霉素類似物G418硫酸(商標為genetiein)的抗性(圖4A和4B)。NEO基因有助于含有這些順序的包裝細胞的選擇(見下文)。
實施例中所用的還原病毒載體是以莫洛尼氏鼠白血病毒為基礎的，但應該認識到，也可使用其它載體。這些含有NEO基因作為可選擇標記的載體已有記載，例如N2載體(Science 2301395-1398，1985)。
與還原病毒穿梭載體有關的理論問題是，還原病毒LTR調(diào)控順序有可能激活位于宿主基因組中整合位點處的細胞致癌基因的轉錄。這個問題可以通過產(chǎn)生一個SIN載體(圖4A)來消除。SIN載體是一些自我失活載體，它們在還原病毒LTR中含有一個包括啟動子和增強子區(qū)在內(nèi)的缺失。SIN載體的LTR順序不激活5′或3′基因組順序的轉錄。病毒LTR順序的轉錄失消除了相鄰的靶細胞DNA順序的插入激活，同時也有助于所釋放的分子嵌合體的選擇性表達。SIN載體是通過在3′病毒LTR順序中去除大約299bp而產(chǎn)生的(Biotechniques4504-512，1986)。
因此，本發(fā)明的還原病毒穿梭載體最好是SIN載體。
由于已從這些穿梭載體中去除了親本還原病毒的gag、pol和env基因，可以利用輔助病毒系統(tǒng)提供還原病毒的gag、pol和env中間基因產(chǎn)物，從而將還原病毒載體包裝或包衣殼成感染性病毒粒子。這是利用特化的“包裝”細胞系來實現(xiàn)的，這些細胞系能夠產(chǎn)生感染性的合成病毒，但仍缺乏產(chǎn)生任何可檢測的野生型病毒的能力。這樣，人工合成病毒便含有一個本發(fā)明的嵌合體，該嵌合體包裝在不含野生型輔助病毒的人工合成感染性病毒粒子中。這根據(jù)的是如下的事實穩(wěn)定整合到包裝細胞中的輔助病毒含有病毒結構基因，但缺乏潑西位點，后者是一個順式作用的調(diào)控順序，必須包含在要包衣殼成感染性病毒顆粒的病毒基因組RNA分子中。
因此，本發(fā)明的第四方面提供一種感染性病毒粒子，它包含一個如上所述的還原病毒穿梭載體，所述載體被包衣殼在病毒蛋白內(nèi)，從而產(chǎn)生感染性的復制缺陷型人工還原病毒。
還原病毒穿梭載體所包含的穿梭載體中，最好包含一個具有AFP或ALB轉錄調(diào)控順序的分子嵌合體。具體地說，穿梭載體含有AFP/VZV胸苷激酶嵌合體或ALB/VZV胸苷激酶嵌合體。
除了去除潑西位點外，還可對輔助病毒LTR調(diào)控順序作其它改變，以確保輔助病毒不被包裝在病毒粒子中，并在逆轉錄和病毒整合水平上被阻斷。
此外，也可將輔助病毒結構基因(即gag、pol和env)分別地、彼此獨立地轉移到包裝細胞系中。由于這些病毒結構基因在包裝細胞的基因組內(nèi)被分隔開，所以很少有發(fā)生暗重組而產(chǎn)生野生型病毒的機會。
本發(fā)明的第五方面提供一種制備本發(fā)明的感染性病毒粒子的方法，該方法是將含有如上所述的本發(fā)明分子嵌合體的人工還原病毒穿梭載體釋放至包裝細胞系中。
包裝細胞系中可以穩(wěn)定地整合有一個缺乏潑西位點的輔助病毒和如上所述的其他調(diào)控順序，也可以對包裝細胞系進行而改造而使其在基因組中含有輔助病毒結構基因。
本發(fā)明還提供一種如上所述的感染性病毒粒子，用于治療，特別是用于治療癌癥，特別是用于治療肝細胞癌、睪丸非精原細胞癌、某些畸胎癌和某些胃腸腫瘤。
利用組織特異性轉錄調(diào)控(如增強子和啟動子)順序來實現(xiàn)雜合酶特別是VZV胸苷激酶基因的選擇性表達?？梢酝ㄟ^肝細胞的選擇性感染進一步改進選擇性。存在于包裝細胞系中的還原病毒env基因確定了對宿主感染的特異性。對用于構建包裝細胞系的env基因進行修飾，從而產(chǎn)生能選擇性地感染肝細胞的人工感染性病毒粒子。例如，可以對導入包裝細胞中的還原病毒env基因進行某種方式的修飾，使人工感染性病毒粒子的被膜糖蛋白能通過由乙型肝炎病毒(HBV)所利用的特異受體介導的結合作用而選擇性地感染肝細胞。
HBV主要通過特異受體介導的結合作用來感染肝細胞。由前S1和前S2順序編碼的HBV蛋白在HBV與肝細胞的附著中起主要作用(HepadnaViruses，Robinson等編，189-203，205-221，1987)。對包裝細胞的env基因進行修飾，使其含有HBV大S被膜蛋白的肝細胞結合位點。導入包裝細胞的env基因的這些修飾，可以用本領域公知的標準分子生物學技術進行，這些修飾將有利于靶組織對病毒的吸收。
本發(fā)明的感染性病毒粒子可以用本領域公知的技術進行配制，并可作為與藥用載體配成的制劑存在。在這種情況下，藥用載體可包含一種適于作為媒液使用的液體介質(zhì)，以將感染性病毒粒子導入患者體內(nèi)。這樣一種載體的例子是鹽水。感染性病毒粒子可以是在這樣一種媒液中的溶液或懸浮液。在這些藥物制劑中還可以有穩(wěn)定劑和抗氧化劑和/或其它賦形劑，這些制劑可以用任何常規(guī)方法如口服或腸胃外途徑給哺乳動物施用。具體地說，感染性病毒粒子可以通過靜脈或動脈輸入來施用。在治療肝細胞癌時，用肝動脈輸入法可能較為有利。
因此，本發(fā)明提供一種藥物制劑，該制劑包含感染性病毒粒子與藥用載體的混合物。
此外，本發(fā)明還提供制備這里所述的藥物制劑的方法，包括使含有分子嵌合體的人工感染性病毒粒子與藥用載體混合。
雖然可以利用可被酶選擇性轉化的任何適當?shù)幕衔?，但本發(fā)明還提供式Ⅰ或Ⅱ的化合物用于一種藥物的制備，這種藥物可用于治療能夠表達VZV胸苷激酶的癌癥，特別是用于治療肝細胞癌。
已知如下所示的式(Ⅰ)的6-取代嘌呤阿拉伯糖苷、它的鹽和有生理功能的等價物，可作為抗VZV和細胞肥大病毒藥劑，它們的應用和合成描述于已公開的歐洲專利申請0294114中。
其中R1為鹵素、C1-5烷氧基、鹵素取代的C1-5烷氧基、被C1-5烷基單取代或二取代的氨基、被一個或多個氟原子取代的C1-5烷基、C3-6環(huán)烷基、或含有C4-7碳原子和或有或無的雙鍵的含氮雜環(huán);R2為氫、鹵素或氨基。
式Ⅱ化合物如下所示
其中X代表1，2-亞乙烯基或亞乙炔基;R1代表氧或亞氨基;R2代表氫原子、C1-2烷基、C3-4支鏈烷基或環(huán)烷基，例如異丙基或環(huán)丙基;R3代表氫原子或?；?，例如C1-4鏈烷?；蚩杀焕缫粋€或多個鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代基取代的苯甲?；?R4代表氫原子或羥基;條件是(a)當R2、R3和R4各代表氫原子時，R1不代表氧。
應該認識到，當R3不為酰基時，式(Ⅰ)或(Ⅱ)的化合物可以以其互變異構形式存在。特別優(yōu)選的式Ⅰ和Ⅱ化合物是9-β-呋喃阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤和1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-丙基尿嘧啶。
這些化合物及其合成方法已在歐洲專利申請0272065中公開，這些化合物被認為具有抗VZV活性。
上述嘧啶核苷和嘌呤阿拉伯糖苷，還包括這些化合物的可藥用衍生物，即任何可藥用鹽、酯或該酯的鹽，或在施用于人體后能提供(直接地或間接地)活性代謝物或其殘基的任何其它化合物。該化合物最好在口服時有效。
治療哺乳動物時的劑量和準確方案，當然要由主治醫(yī)師決定，這將取決于包括欲治療癥狀的類型和嚴重程度在內(nèi)的各種因素。但對肝細胞癌來說，以每毫升感染性病毒粒子2×105至2×107集落形成單位(CFU/ml)的效價肝動脈輸入人工感染性病粒子可能會適于一般的腫瘤。所輸入的病毒粒子的總量將取決于腫瘤的大小，并最好以分劑量給予。
藥物治療在用感染性病毒粒子感染后，施用本發(fā)明的化合物，這些化合物在合成代謝中轉化為細胞毒性或細胞抑制性代謝物時，關鍵性的第一個磷酸化步驟特異地需要VZV胸苷激酶活性。
藥物的劑量最好在每天每千克患者體重0.1到250毫克范圍內(nèi)，最好是每千克體重0.1至100毫克。
下列實施例用來說明本發(fā)明，但不應誤認為是限制本發(fā)明。
實施例1清蛋白轉錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體的構建用限制性核酸內(nèi)切酶對含有VZV胸苷激酶基因組的約2200bp EcoRI/BamHI片段的約4896bp質(zhì)粒(稱為22TK)(Virology 1491-9，1986;由J.Ostrove NIH，Bethesda，Md.供給)進行消化，用洗脫捕獲(elutrap)電泳室(Schleicher and Schuell，Keene NH，USA)以電洗脫法純化出含有VZV胸苷激酶基因編碼順序和多聚腺苷酸化信號的約1381bp AccI/Nde I DNA片段(所有限制酶得自Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg MD，USA;New England Biolabs，Mass，USA;或Promega，Madison，Wi，USA;所有酶反應都按供貨商的說明進行)。純化出的DNA片段含有完整的VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化信號，但不包括任何VZV胸苷激酶啟動成分(見圖2A和2B)。
用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)和脫氧核苷三磷酸(dNTP)進行處理，使純化出的1381bp Acc I/Nde I VZV胸苷激酶片段的5′伸出端成為平末端。
由Richard Palmiter(華盛頓大學，美國華盛頓州西雅圖市)得到含有約2300bp ALB E/P順序的約5249bp質(zhì)粒，稱為2335A-1。此構建體含有肝特異性表達所必需的順序，但缺乏非必需的插入順序。在相對于轉錄起始位點+23位處，有一個唯一的BamHI限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI消化2335A-1，并如上所述用Klenow酶和dNTP處理使5′伸出端成為平末端。
用T4 DNA連接酶(BRL，Gaithersburg，MD)將含有VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化順序的平末端AccI-NdeI片段連接到2335A-1的平末端BamHI位點中，產(chǎn)生pCR73，從而構建出ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體(圖5)。與上述所有連接相似，用本領域公知的方法進行限制性核酸內(nèi)切酶消化，從而確定連接后片段的取向。與所有實施例中所述的所有質(zhì)粒相似，pCR73含有在細菌內(nèi)復制所需的以及適于用本領域公知方法進行擴增的必需順序。用電洗脫法從pCR73中純化出ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體，其形式為約3880bp的SstI/KpnI限制性核酸內(nèi)切酶片段(圖5)。用T4 DNA聚合酶和dNTP進行處理，使3′伸出端成為平末端。然后將這個SstI/KpnI平末端限制片段導入莫洛尼氏鼠白血病毒還原病毒穿梭載體系統(tǒng)(見下面的實施例3)。
pCR73已于1989年8月18日保藏于ATCC，登記號為ATCC 68077。
實施例2甲胎蛋白轉錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶的構建分離出VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化位點，其形式為pCR73的約3，300bp BamHI-XmnI限制性核酸內(nèi)切酶片段(圖6)。用Klenow酶和dNTP進行處理使BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點的5′伸出端成為平末端。此DNA片段含有VZV胸苷激酶基因的完整編碼順序和多聚腺苷酸化位點，但不含有任何增強子或啟動子順序。從加拿大卡爾加里大學的T.Tamaoki處得到含有約5，100bp人AFP5′鄰接DNA的約9996bp質(zhì)粒pAF5.1-CAT。通過用XmnI消化和用HindⅢ部分消化，從pAF5.1-CAT中分離出一個從人AFP基因的約-5.1kb至+29kb的DNA片段。用T4 DNA連接酶使該XmnI/HindⅢ片段與BamHI/XmnI VZV胸苷激酶片段連接，形成pCR77(圖6)。用電洗脫法從pCR77中純化出AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合體，其形式為約6699bp AatⅡ/PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶片段。然后如實施例1所述將此片段用T4 DNA聚合酶和dNTP處理，產(chǎn)生平末端限制片段。
pCR77已于1989年8月18日保藏于ATCC，登記號為ATCC 68079。
實施例3含有實施例1的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體構建體的構建將pCR73的純化的SstI/kpn I平末端片段連接到稱為N2(XM5)的莫洛尼氏鼠白血病還原病毒載體中(Science 2301395-1398，1985，得自S.Karrlson，NIH，Bethesda，MD，USA)，從而構建出含有ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 74。在用T4 DNA連接酶連接到pCR 73的SstI/KpnI片段中之前，用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI消化N2(XM5)，并用Klenow酶和dNTP進行處理，使5′伸出端成為平末端(圖5)。
含有ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 74已通過限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析和DNA順序分析進行了定性，從而證實了它的一級順序。鄰接ALB E/P與VZV胸苷激酶順序連接點處的順序示于圖7。
pCR 74已于1989年8月18日保藏在ATCC，登記號為ATCC68078。
實施例4含有實施例2的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體構建體的構建將含有AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合體的pCR77的純化的AatⅡ/PstⅠ片段連接到N2(XM5)中，從而構建出還原病毒穿梭載體pCR78(圖6)，N2(XM5)已如實施例3所述用XhoI進行了消化并用T4 DNA聚合酶和dNTP處理成平末端。含有AFP E/P.VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 78已通過限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析和DNA順序分析進行了定性，從而證實了它的一級順序。鄰接AFP E/P與VZV胸苷激酶連接點的順序示于圖8。
pCR 78已于1989年8月18日保藏在ATCC，登記號為ATCC68080。
實施例5病毒的生產(chǎn)從ATCC(ATCC CRL 9078)得到前述的稱為PA 317的包裝細胞系，該細胞系有三個包含在5′LTR、潑西調(diào)控順序和3′LTR內(nèi)的變異(Mol.and Cell Biol.6(8)2895-2902，1986)。通過電穿孔或感染將實施例3和4中所述的人工還原病毒構建體放入包裝細胞系中。進行電穿孔時，將20微克線性化的質(zhì)粒DNA電穿孔到磷酸緩沖蔗糖中的二百萬個PA 317細胞中，采用280伏、25微法拉的電容，總體積為0.8毫升。能夠得到至少150個G418抗性集落/20微克質(zhì)粒DNA/二百萬個PA 317細胞。進行感染時，將20微克線性化的質(zhì)粒DNA電穿孔到二百萬生態(tài)適應性(ecotroplc)包裝細胞(如Psi 2細胞)中。兩天后，用培養(yǎng)上清液感染兼性適應性(amphotropic)包裝細胞系PA 317，并分離出418抗性集落。電穿孔和感染技術都是將G418抗性集落用有限稀釋法進行單細胞克隆，并用Southern印跡法進行分析，在NIH 3T3細胞(ATCC)中進行滴定，從而鑒定出全長病毒產(chǎn)量最高的克隆。對含有pCR 74的PA 317細胞分離出17個單細胞克隆，從其中的10個克隆中提取DNA。利用不同的限制性核酸內(nèi)切酶，并用NEO和VZV胸苷激酶順序作為放射性雜交探針，對這10個DNA樣品進行深入的Southern印跡分析。在所分析的10個克隆中，有兩個沒有顯現(xiàn)出任何截短的跡象，因而被認為是全長的。對含有pCR 78的PA 317細胞分離出29個單細胞克隆，并從25個克隆中得到DNA。利用不同的限制性核酸內(nèi)切酶，并用AFP、NEO和VZV胸苷激酶順序作放射性雜交探針，對這25個樣品進行深入的Southern印跡分析。在所分析的25個克隆中，有5個沒有顯現(xiàn)出任何截短的跡象，因而被認為是全長的。利用標準技術，在胸苷激酶-/-的NIH3T3細胞中對含有全長病毒順序的每個包裝細胞系進行滴定。
實施例6用實施例5的含有ALB/VZV胸苷激酶或AFP/VZV胸苷激酶的全長感染性病毒粒子感染人肝細胞瘤細胞系(陽性對照)，然后測定VZV胸苷激酶活性、ara ATP的生成和藥物敏感性用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體的復制缺陷型全長人工還原病毒，感染稱為Hep G2(ATCC HB8065)的人肝細胞瘤細胞系。感染并在1毫克Geneticin(商標)/毫升上進行選擇后，測定細胞的VZV胸苷激酶活性。此外，在3H標記的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(下表和附圖中稱為ara-m)存在下培養(yǎng)細胞，然后測定ara ATP。最后在上述化合物存在下培養(yǎng)細胞，并測定IC50(生長抑制)。未用病毒感染的細胞或用N2病毒感染的細胞作為這些實驗的對照樣品。N2病毒不含VZV胸苷激酶遺傳物質(zhì)。
表1證實，用含有pCR 74或pCR 78的病毒感染的人肝細胞瘤細胞的VZV胸苷激酶活性，分別比對照細胞強904倍或52倍。
9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(稱為ara-m)可被VZV胸苷激酶選擇性地單磷酸化，并在隨后的合成代謝中轉化為細胞毒性的ara ATP。圖9證實，用含有pCR 74或pCR 78的病毒感染并在3H標記的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培養(yǎng)的Hep G2細胞，形成大量的細胞毒性3H-ara ATP。
用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的復制缺陷型全長人工還原病毒感染的Hep G2細胞，在不同量的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培養(yǎng)5天，并測定生長抑制作用，以細胞數(shù)和DNA含量來量度。
表2證實，在對照細胞和用N2感染的Hep G2細胞中，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50(50%生長抑制)高于2000μM。用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的復制缺陷型全長人工還原病毒感染的Hep G2細胞，其IC50分別為5μM和175μM。含有AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的Hep G2細胞的單細胞克隆表明，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50水平可進一步降至約40μM。
實施例7VZV胸苷激酶表達的選擇性取五個人非肝細胞瘤細胞系，用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)的復制缺陷型全長人工還原病毒進行感染。這些細胞系是WiDR(ATCC CCL218)、IMR90(ATCC CCL186)、MCF7(ATCC HTB22)、Detroit 555(ATCC CCL110)和SW 480(ATCC CCL228)。在感染并在Geneticin(商標)上進行選擇后，如上所述測定這些細胞的VZV胸苷激酶活性和在9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下的生長抑制作用。在這五個用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)的復制缺陷型全長人工還原病毒感染的非肝細胞瘤細胞系中，其VZV胸苷激酶活性或?qū)?-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的藥物敏感性，比未感染的親本細胞系沒有提高。這證實了VZV胸苷激酶在肝細胞瘤中表達相對于在非肝細胞瘤細胞中表達的選擇性。


圖1清蛋白增強子和啟動子順序與清蛋白基因(IA)、雜合基因(IB)和不帶非必需順序的雜合基因之間關系的圖示。
圖2A水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的簡圖。
圖2BVZV胸苷激酶基因一級順序。
圖3A清蛋白轉錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體。
圖3B甲胎蛋白轉錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體。
圖4A含有甲胎蛋白/VZV胸苷激酶分子嵌合體的原病毒形式的還原病毒。
圖4BpCR 78。
圖5顯示pCR 74構建過程的流程圖。
圖6顯示pCR 78構建過程的流程圖。
圖7pCR 74中鄰接ALB E/P與VZV胸苷激酶的順序。
圖8pCR 78中鄰接AFP E/P與VZV胸苷激酶的順序。
圖9用對照、pCR 74和pCR 78感染的細胞中ara ATP的生成。
表1用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 78)的復制缺陷型全長人工還原病毒感染的Hep G2細胞中VZV胸苷激酶的活性。VZV胸苷激酶的活性定量為每30分鐘、每毫克細胞蛋白中被磷酸化的araM的量。
病毒 VZV胸苷激酶活性 提高倍數(shù)(ara MP(毫微摩爾)/微克蛋白/30分)無 9 0N2 4 0pCR 74 4521 904pCR 78 258 52表2用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 78)的復制缺陷型全長人工還原病毒感染的Hep G2細胞的生長抑制。
病毒 9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50無 ＞2000μMN2 ＞2000μMpCR 74 5μMpCR 78 175μM
權利要求
1.一種分子嵌合體，它包含一個能夠在哺乳動物靶組織中被選擇性激活的轉錄調(diào)控順序、一個與該轉錄調(diào)控順序有效連接并編碼一種雜合酶的DNA順序，所述酶能夠催化一種對靶組織有毒的藥劑的生成。
2.如權利要求1所述的嵌合體，其中轉錄調(diào)控順序包含一個啟動子。
3.如權利要求1或2所述的嵌合體，它還包含一個位于編碼雜合酶的DNA順序下游的多聚腺苷酸化信號。
4.如權利要求1、2或3所述的嵌合體，其中轉錄調(diào)控順序還包含一個增強子順序。
5.如權利要求2或4中任一項所述的嵌合體，其中啟動子選自下列基因的啟動子清蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨?；D肽酶、多巴脫羧酶、HER/neu和N-myc致癌基因。
6.如權利要求4所述的嵌合體，其中增強子選自下列基因的增強子清蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉移酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨?；D肽酶、多巴脫羧酶、HER/neu和N-myc致癌基因。
7.如權利要求1或6中任一項所述的分子嵌合體，其中酶選自水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶、羧肽酶G2、堿性磷酸酶、青霉素V酰胺酶、非哺乳動物胞苷脫氨酶。
8.如權利要求1或7中任一項所述的分子嵌合體，其中酶為水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶。
9.一種分子嵌合體，它包含一個編碼水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的DNA順序，該順序與清蛋白轉錄調(diào)控順序有效連接。
10.一種分子嵌合體，它包含一個編碼水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶的DNA順序，該順序與甲胎蛋白轉錄調(diào)控順序有效連接。
11.一種還原病毒穿梭載體，它含有如權利要求1至10中任一項所述的分子嵌合體。
12.如權利要求11所述的載體，它包含一個5′病毒長末端重復(LTR)順序、一個順式作用的潑西包衣殼順序、權利要求1至10中任一項的分子嵌合體和一個3′病毒LTR順序。
13.如權利要求12所述的載體，其中分子嵌合體的取向與5′還原病毒LTR的方向相反。
14.如權利要求12或13所述的載體，它還包含一個編碼顯性可選擇標記的DNA順序，該順序與5′LTR順序有效連接。
15.如權利要求14所述的載體，其中可選擇標記順序是一個NEO基因。
16.如權利要求11至15中任一項所述的載體，它是一個自我失活載體(SIN)。
17.一種感染性病毒粒子，它包有一個如權利要求11至16中任一項所述的載體。
18.如權利要求17所述的感染性病毒粒子，它已被改造在能選擇性地感染一種靶組織。
19.如權利要求17或18中任一項所述的感染性病毒粒子，它是復制缺陷型。
20.如權利要求17至19中任一項所述的感染性病毒粒子，其中該病毒粒子的env基因被修飾成能促進細胞結合作用。
21.如權利要求20所述的感染性病毒粒子，其中env基因被修飾成含有HBV大S被膜蛋白的肝細胞結合位點。
22.如權利要求1或10中任一項所述的分子嵌合體，它用于醫(yī)療。
23.一種藥物制劑，它包含一個如權利要求17至21中任一項所述的感染性病毒粒子和適用的藥用載體。
24.如權利要求17至21中任一項所述的感染性病毒粒子，它用于醫(yī)療。
25.如權利要求17或21中任一項所述的感染性病毒粒子在一種藥物的制備中的應用，所述藥物用于治療哺乳動物的癌癥。
26.一種化合物在一種藥物的制備中的應用，所述藥物用于治療能夠表達一種雜合酶的癌癥，所述化合物能被該酶直接地或通過一種中間體而選擇性地催化成一種細胞毒性或細胞抑制性代謝物。
27.一種化合物或其鹽或其有生理功能的衍生物在一種藥物的制備中的應用，所述藥物用于治療能夠表達VZV胸苷激酶的癌癥，其中所述化合物具有式Ⅰ或式Ⅱ
其中R1為鹵素、C1-5烷氧基、鹵素取代的C1-5烷氧基、被C1-5烷基單取代或二取代的氨基、被一個或多個氟原子取代的C1-5烷基、C3-6環(huán)烷基、或一個含有C4-7碳原子和或有或無的雙鍵的含氮雜環(huán);R2為氫、鹵素或氨基;
其中，X代表1，2-亞乙烯基或亞乙炔基;R1代表氧或亞氨基;R2代表氫原子、C1-2烷基、C3-4支鏈烷基或環(huán)烷基，例如異丙基或環(huán)丙基;R3代表氫原子或酰基，例如可被一個或多個鹵素、烷基、羥基或烷基取代基取代的C1-4鏈烷?；虮郊柞；?R代表氫原子或羥基;條件是(a)當R2、R3和R4各代表氫原子時，R1不代表氧。
28.如權利要求17至21所述的感染性病毒粒子和一種化合物一同用于醫(yī)療中的應用，所述化合物能夠被一種雜合酶選擇性地催化成細胞抑制性或細胞毒性代謝物。
29.pCR73、pCR74、pCR77或pCR78中的任一個。
全文摘要
描述了用DNA重組技術產(chǎn)生的新的分子嵌合體。它們包含一個連于其上的靶組織特異性轉錄調(diào)控順序，該順序控制一種雜合酶如水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的表達。將分子嵌合體包裝到能夠感染哺乳動物組織的合成還原病毒顆粒中。該顆粒則可以給患者施用，轉錄調(diào)控順序?qū)⒃诎薪M織(如癌組織)中被選擇性地轉錄激活。施用能被酶選擇性代謝的化合物，將就地產(chǎn)生細胞毒性或細胞抑制性代謝物，從而選擇性地殺傷靶細胞或抑制其生長。
文檔編號A61K38/45GK1050899SQ9010734
公開日1991年4月24日 申請日期1990年8月29日 優(yōu)先權日1989年8月30日
發(fā)明者布賴恩·休伯·達勒姆, 辛西婭·安·理查德斯, 托馬斯·安東尼·克倫尼斯基 申請人:惠爾康基金會集團公司