專利名稱:普瑞霉素的成份和抗菌復合物的分離過程的制作方法
本發(fā)明涉及的是分離普瑞霉素混合物獲取普瑞霉素的不同成份，和從抗菌復合物中分離這些成份的過程。本發(fā)明的進一步目的是含有上述成份的增效合劑和它們的配制過程。
普瑞霉素抗菌復合物可由人工培養(yǎng)熱多孢霉屬的galeriensis(屬于鏈絲菌類)獲得，經發(fā)酵得到的其制劑已由Hugarian在No.153，593中敘述過。
普瑞霉素是大環(huán)內脂類抗菌素，在先有技術(J.Chem.Soc，Perkin I.P816，1974)中以一單一化學式為其特點的｛5-[18-(αD-阿糖膠-呋喃糖基氧(furanosyloxy))-2-丁基-3，7，11，15，19，21，23，35，27-九羥基-4，16，32，34-四甲基-1-氧-環(huán)氧36環(huán)-16，32-二烯-35基]-4-羥基己基｝-胍的硫酸鹽。
普瑞霉素是一種非常有效的廣泛應用的抗菌素，它不但對抵抗革蘭氏陽性細菌有效，也對抵抗多種耐藥菌族有效，在抵抗細菌時耐藥性仍不會發(fā)展。
我們以前的試驗是參照發(fā)酵得到的普瑞霉素不是單一的物質的事實。色譜法的最近發(fā)展允許我們對普瑞霉素物質混合物進行更詳細地檢驗。
我們發(fā)現，發(fā)酵得到的普瑞霉素，含有三種主要成份和六種次要成份，我們發(fā)明的過程是適于定性的，微量的分離這些成份。我們也意外地發(fā)現，這些成份能相互增強效力，即它們表現出增效活性。
我們努力的目標是分離和隔離由熱多孢霉屬的galeriensis產生的抗菌混合物的各種成份。一系列的色譜法都已試過，并且發(fā)現，薄層色譜法對上述過程是最有效的。
在薄層色譜法(TLC)領域內，采用帶有硅膠的吸附層的商品色譜片，在成份分離中取得了意外的好結果。
根據我們發(fā)明的分離過程的比較好的實例，從熱多孢霉的galeriensis菌絲分離出來的，沒有脂肪的，粗產品形式的，半純產品的，或純凈產品的原液施加到TLC薄層色譜片上，經展開后，檢驗得到的斑點，并且分離出抗菌復合物的主要成份和(或)次要成份。
為了配制從培養(yǎng)介質中收取粗產品形式的，半純的或純產品的原液，我們使用了含1-4個碳原子的醇的水溶液，例如，比較適用的是體積為，乙醇∶n-丁醇∶水為25∶25∶50的混合物。借助于上述混合物可以制備0.5-1w/v%的原液，而且把50-200μg的被檢測的物質施加到薄層色譜片上。
在我們的試驗中，首先使用商品硅膠色譜片Kieselgel 60 F254，尺寸為20×20cm，硅膠厚度為0.2mm。為了實現普瑞霉素混合物的最佳分離，在此種片上進行了各種溶劑混合物的試驗。
當采用含有囟代烴，有機酸，乙醇，水，更好的是還有醛作為洗提劑時，可以獲得最佳分離。
下列溶劑可以用作為洗提劑囟代脂族烴(如氯仿，二氯甲烷)，特別是含1-4個碳原子的脂族羧酸(如甲酸，醋酸)，囟代脂族羧酸(如-氯、二氯、三氯醋酸，三氟醋酸)，芳族羧酸(如苯甲酸)，有機磺酸(如甲基磺酸，甲苯磺酸)，醇類，特別是脂族直鏈或支鏈含1-10個碳原子的醇類(如甲醇，乙醇，n-丁醇，異丙醇)，醛類，特別是含1-4碳原子的脂族醛類(如36%甲醛)或者是上述物質的水溶液混合物。
對于分離普瑞霉素抗菌素的成份，下列溶劑可產生最好的效果Ⅰ.n-丁醇∶冰醋酸∶水為60∶10∶30的混合物的上層。
Ⅱ.n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的比例為75∶2∶8∶15的混合物。
Ⅲ.氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶水為45∶30∶15∶20的混合物的下層。
Ⅳ.氯仿，甲醇和水的比例為50∶35∶14∶1的混合物。
Ⅴ.氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為130∶53∶6∶9∶3∶
3的混合物。
Ⅵ.氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為160∶53∶6∶9∶3∶3的混合物。
Ⅶ.15份重量的一氯代醋酸溶解在氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為125∶53∶9∶3∶3的混合物中。
Ⅷ.溶液Ⅲ，氯仿和甲醇的比例為15∶2∶1的混合物。
溶液Ⅰ和Ⅱ容量較高，而溶液Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，和Ⅷ的選擇性較高，并且特別是展開時間較短，這更適于工業(yè)系列試驗的目的。溶液Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ由于甲酸酯生成，化學上呈亞穩(wěn)定狀態(tài)，而溶液Ⅲ則是在物理上呈亞穩(wěn)定狀態(tài)。按照其等溫曲線，溶液Ⅳ應在16-24小時內用完(從其配制開始計算);Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅷ，在其成份彼此添加到一起后要立即使用;而混合物Ⅲ中如果添加1-2%甲醇后可保留一個星期。混合溶劑Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ是比較理想的。因為抗菌素復合體不同成份的Rf值是非常接近的，如果進行兩次展開，則在洗提液Ⅳ中可實現有效的分離;而如果用Ⅴ、Ⅶ或Ⅷ時，甚至一次展開即導致適當的分離。最理想的溶液是Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ。溶液Ⅴ可用于普通的薄層色譜法所用的色譜片，而洗提液Ⅵ可用于HPTLC色譜片，溶液Ⅶ適用于浸漬過的色譜片，溶液Ⅷ對Lobar-色譜柱則特別合適。
由薄層色譜法分離出普瑞霉素復合物的成份，可由化學方法和(或)生物自檢展開檢測。
對于化學檢測法，硫酸香草醛，氯甲苯胺，磷鉬酸，聯(lián)苯胺或硫酸乙醇酯，以及改進的Sakaguchi試劑和硫酸乙醇脂，從先有技術得知都是相當有效地;或者熱處理，以及用前述物質和熱處理共用都是相當有效地提供了特征值的和靈敏的顏色反應。把展開過的色譜片浸漬到合適的反應劑中，色斑即可確定，干燥后的色譜片在某些情況下可由Shimadzu密度計定值。
生物自檢顯示按下列方法進行
薄層色譜展開和化學檢測以后，沿著滴斑的邊緣，將色譜片垂直地切割成很多帶條，這時做好瓊脂片并且用枯草桿菌ATTC6633培養(yǎng)。帶條的另一邊標記后，將切割后的譜帶壓在瓊脂片上;或者將所有帶條再切成兩塊，只有兩塊中的一塊壓在瓊脂片上。接下來，瓊脂片在37℃溫度中培養(yǎng)20-24小時。從恒溫器取出以后即可看到這些斑點(細菌在這里不能生長)。如果使用的是整塊帶條，可以根據另一邊的標記鑒別出能抑制細菌生長的斑點;或者用另一半原來帶條邊的位量鑒別。
為了說明上述過程，用溶液Ⅳ兩次展開以后得到的薄層色譜片的圖1表示，由不同培養(yǎng)基得到的普瑞霉素樣品展開以后所獲得的不同斑點(1-4個斑點)充分證實了普瑞霉素是混合物。分離的主要成份A1、B1和C1以及混合物的生物自檢譜也能在圖上看到。
采用溶液Ⅴ的一次展開普瑞霉素混合物，分離成以括弧內Rf值為特征的下列成份A1(0.29)，A2(0.31)，A3(0.33)，C1(0.35)，C2(0.37)，C3(0.39)，B1(0.54)，B2(0.56)，B3(0.58)，一些沒有鑒別出來的次要成份也能看到痕跡。色譜由圖2表示。
可用HPTLC色譜片提高分離效率。這時溶液Ⅵ作為洗提劑應用可以產生合適的分離作用。
當Kieselgel 60 F254硅膠色譜片浸漬了適當的金屬鹽，特別是浸漬銀鹽以代替很難得到的，昂貴的HPTLC色譜片時，可得到類似的出色的分離作用。在浸漬過程中，色譜片插入到水或有機溶劑中或者水和有機溶劑的混合物中，例如，金屬鹽的乙腈溶液，最好采用20%的水溶液。銀鹽(如硝酸銀)，鐵鹽(如磷酸亞鐵)可以作為較適用的金屬鹽。浸漬層的表面潮氣，可以在隔絕光線的條件下，經120℃的溫度處理一小時除掉。對于展開色譜片，溶液Ⅴ和Ⅵ在這種情況下同樣是有用的，但當采用溶液Ⅶ時則可實現最好的分離作用。在這樣的系統(tǒng)中，由于各種成份增加的Rf值是不同的，因此使分離效率大大提高。
業(yè)已發(fā)現，普瑞霉素是由三種主要成份(A1，B1，C1)和多種次要成份組合的混合物。
根據溶解度的情況，各種成份一起結晶?？咕氐慕M成受到發(fā)酵條件改變的影響(培養(yǎng)基，時間和溫度，通氣的程度等)。
用柱色譜的方法，將普瑞霉素混合物予與分離，能夠改進薄層色譜洗提作用的效益。我們已經作過分配柱色譜和吸收柱色譜的試驗。
按照我們的發(fā)明，我們采用交聯(lián)葡萄糖凝膠作固定載體(Sephadex LH-20)和逆流法(小滴逆流譜法Droplet Counter Current Chromatography，以后稱之為DCCC)實現了分配柱色譜法的分離。
薄層色譜法適用的同樣溶劑都可用于這種方法，例如含有有機酸，和(或)氯代烴和(或)1-4個碳原子的烷基醇和(或)水的雙層溶劑。溶液Ⅰ系統(tǒng)是喜歡采用的(固定相)，在溶液Ⅰ中固態(tài)(Sephadax LH-20)經兩天就溶脹了，然后填充到色譜柱中，并使用n-丁烷，冰醋酸和水的比例為30∶16∶60的混合物(流動相)沖洗色譜柱。普瑞霉素是溶解在流動相∶固定相為20∶1的混合液中，經一玻璃過濾器過濾后，施加到色譜柱上。下層、流動相作為洗提劑應用時，最好采用蠕動泵和收集器。色譜餾分的組成和純度用薄層色譜法控制，分離的情況可用紫外線光(206nm)下的薄層色譜圖進行檢查。
相同組成的色譜餾分收集到一起，并置于真空中蒸餾，以后確定產率。對柱色譜產品的回收率為90-95%。
主要是含有主要成份的A1，B1，C1的提取液可由色譜法進一步提純。
成份A1用溶液Ⅰ進行色譜分離;B1可用含有苯，n-丁醇，甲苯，冰醋酸和水的溶液獲得;而成份C由DCCC方法分離，采用的溶液系統(tǒng)由氯仿，甲醇，冰醋酸和水組成。
已經發(fā)現，普瑞霉素混合物的成份最好由色譜柱法在選定壓力下用適當的硅膠填料分離。用下列色譜柱作過試驗我們自己填充的硅膠，作好備用的Lobar柱(Merck)，用適當的金屬鹽(和薄層色譜片所用的相似)浸漬過的硅膠填充的色譜柱。
若采用Lobar色譜柱，或因缺少這種色譜柱而使用浸漬過的硅膠填充色譜柱以代替只用單一的硅膠填充的色譜柱，則分離的效率能大大提高。在Lobar色譜柱情況下，采用略高的壓力(1.1-5atm)是很有用的。
在浸漬的過程中，硅膠與合適的金屬鹽混合，最好是懸浮在由有機溶劑配制的金屬鹽溶液中，然后用任意的方法除去溶劑，這樣浸漬的硅膠就能夠用于填充色譜柱。色譜柱是用懸浮在有機溶劑的硅膠填充，較好的溶劑是囟代脂肪烴(如氯仿)，并且用略高的壓力(1.1～2.5atm)壓緊。如果銀鹽作為金屬鹽，則要求防止色譜柱受光，以避免銀鹽還原成銀。
要分離的普瑞霉素混合物或者它的已經分離出來的組成加到色譜柱的頂部，溶解在作為洗提液的溶劑混合物中，在高于大氣壓的條件下，被色譜柱吸收。
要分離的混合物可以是工業(yè)普瑞霉素的硫酸鹽或者其它的普瑞霉素鹽，特別是普瑞霉素的醋酸鹽或普瑞霉素的一氯代醋酸鹽(用普瑞霉素的硫酸鹽按HungarianNo.257/84制備)。
溶劑系統(tǒng)Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅷ可作為溶劑。如果溶劑Ⅴ，Ⅵ或Ⅷ用來洗提Lobar色譜柱時，則可實現最好的分離效果，而混合液Ⅶ最適于洗提用金屬鹽浸漬過硅膠填充的色譜柱。
用恒定的液體流速收集相同體積的色譜餾分，并且用薄層色譜法控制它的組成。將具有相同的Rf值的餾分集中，并且用溶劑沉淀法收取單個成份。
作為用色譜柱法分離的結果，下列成份被分離出來A1＝Chinopricin (Rf＝0.29)A2＝Midopricin (Rf＝0.31)A3＝Metipricin (Rf＝0.33)C1＝Oxipricin (Rf＝0.35)C2＝Oximipricin (Rf＝0.37)C3＝Oximetipricin (Rf＝0.39)
B1＝hidropricin (Rf＝0.54)B2＝himipricin (Rf＝0.36)B3＝himetipricin (Rf＝0.58)分離的成份已進行過試驗，下面是得到的結果1.A1＝chinopricin (Rf＝0.29)用快速原子轟擊質譜檢測法(FAB-MS)測得分子量為1078(圖3)。已發(fā)現，離析的成份A1，由薄層色譜法和FAB-MS法分析，在化學上是單一的。根據分子量，IR和1H以及13C NMR-維和二維圖譜，其確定的結構是由式Ⅰ表示的。
2.A2＝midopricin (Rf＝0.31)和A3＝methipricin(Rf＝0.33)分子量(FAB-MS)1092和1106根據分子量，化學方法和1H和13C NMR一維和二維圖譜的檢測。已發(fā)現，成份A2和A3是A1的同系物，A2的旁鏈較A1長(有一亞甲基)A3的旁鏈較A1長(有-亞乙基團)。
3.C1＝oxypricin (Rf＝0.35)
分子量946(FAB-MS)根據上述分析方法，C的組成可由下式Ⅱ表示。
成份C1和A1之間的差別就在于代替糖元的羥基鍵連到碳原子上(在位置18)。
4.C2＝Oxymipricin (Rf＝0.37)和C3＝Oxymetipricin (Rf＝0.39)分子量(FAB-MS)960和974根據上述分析可以發(fā)現，成份C2的旁鏈較C1長(有-亞甲基)，而C3的旁鏈也比C1長(有-亞乙基)5.B1＝hydropricin (Rf＝0.54)分子量(FAB-MS)930根據上述分析方法，化合物可由式Ⅳ表示。
在這里，代替糖元的氫被鏈連到碳原子上(位置18)。
6.B2＝hymipricin (Rf＝0.56)和B3＝hymetipricin (Rf＝0.58)分子量(FAB-MS)944和960根據上述分析方法可以發(fā)現，成份B2的旁鏈較B1長(有-亞甲基)，成份B3的旁鏈也比B1長(有-亞乙基)。
有用的物理常數(熔點，元素分析數據，旋光度，UV和IR光譜等)對每個化合物不是特征性的。也就是，單一成份的溶點是160-170℃，它們的混合物的溶點是167-168℃。元素分析數據對于分餾成份來說也不是特征性的，因為它們有類似的結構，很高的分子量，因此元素分析的數據的差別是在測量誤差范圍之內的。普瑞霉素混合物的主要部分含有成份A1B1和C1，因此它們被稱之為主要成份，存在的另一些成份數量很小，稱之為次要成份。
根據原料混合物的情況，普瑞霉素的成份以硫酸鹽的形式，或與硫酸不同的其它鹽的形式，特別是醋酸鹽或氯代醋酸鹽的形式離析出來。
離析出來的普瑞霉素成份的硫酸鹽可借助于不同的有機酸轉變成其它鹽。這一點在HungarianNo.2571/84中已敘述過了。
普瑞霉素混合物的抗微生物活性譜和三種主要成份(A1，B1和C1)的抗微生物譜由表O表示(見后面P24)。表中含有MIC值(μ/ml)是在人類病原體多種抗菌株中測量的。不同的值可能說明這樣的事實三種主要成份在以不同方式產生抗微生物活性，它們進攻微生物的不同位置。
我們意外地發(fā)現了成份之間的相互增強作用效應，即它們表現出增效協(xié)合性。根據協(xié)合效應和主要成份不同攻擊點的假定，則采用多種成份的組合物即可實現下述有益的效果1.在不同的位置上同時攻擊病原體的新陳代謝，“殺滅作用”，即微生物的消滅可以更安全地實現，這比起靜態(tài)效應，即單一抑制微生物生長更有利。
2.如果新陳代謝的不同途徑同時受到攻擊，則抵抗活性成份的組合的抗藥性可不發(fā)生或緩慢發(fā)生。
3.各種成份的使用量可大大減少。這就產生了一個優(yōu)點由于治療的活性成份減少，有害的副作用減少或完全消失了。這一作用從治療的觀點來看是非常有利的，當采用較少的活性成份時，成本也下降了，這從經濟的觀點看也是適宜的。
在采用增效合劑時，按我們的發(fā)明，普瑞霉素的主要成份(A1，B1，C1)和其它的次要成份和衍生物，(以它們的鹽為好)都可以使用，可含兩、三種或更多的不同成份。
如果在合劑中采用兩種主要成份，則其重量比在5∶95-25∶75的范圍的內，而采用三種成份時，則重量比在4∶3∶3-7∶1∶2的范圍內。按本發(fā)明的增效合劑的優(yōu)選的具體組成在下面的例子中介紹，其中MIC值是用不同微生物族測得的，而且也指出了加合的程度和增效的效益。根據“加合效應”這個詞可理解為，多種成份的效果相加，即一種成份的一半MIC值與另種成份的一半MIC值，得到兩種活性成份的組合MIC值。當抗微生物活性由于成份之間有益的相互作用超過加合效應時，潛在的協(xié)同增效出現，這樣獲得的效應是增效效應(或協(xié)同效應)。
MIC值是在Difco-Bouillon培養(yǎng)基中確定的。每毫升5×105的孢子進行接種，進行MIC值的定值。在例13-15中，197種情況說明，含有較多活性成份的組合劑是具有增效活性的合劑，于是為了實現同樣的效果，只需有一部分或很少一部分原來的活性成份的投藥量參與治療。
按本發(fā)明的普瑞霉素的成份可單獨地或選擇性地與其它藥物的有效成份一起相互混合進行投藥。它們可以單獨使用，但常常根據用藥規(guī)范和實際用藥標準選擇后與藥物載體一起使用。有效成份可以用固體配劑的形式如膠囊，片劑，糖衣藥片，栓劑;半固體形式如軟膏或凝膠;或液體配劑形式，如注射液，懸浮液或糖漿。優(yōu)選的配劑的形式是凝膠，軟膏，外科粉劑，注射液，懸浮液和粉末安培溶劑安培。
根據我們的發(fā)明，本品可以口服，胃腸外，直腸或局部(軟膏)給藥。它們含有有用的藥物載體(如碳酸鎂，硬脂酸鎂，淀粉，滑石，水等)或新的載體如環(huán)狀糊精和任選的賦形劑，裂介劑，乳化劑等。
適于口服治療的配藥形式可以是膠囊，片劑或糖衣藥丸。按本發(fā)明，含有更多有效成份的增效合劑也可用于獸醫(yī)治療，即以液體的形式混合到飼料中。適于胃腸外治療的配藥形式可以是水乳濁劑，溶液或懸浮液。軟膏，水或油乳劑或用這些乳劑懸浮液，噴霧浸漬的繃帶都可用于局部給藥。
本發(fā)明用下述非限定性的實例詳細說明。
例1在硅膠(Kieselgel)上用薄層色譜法兩次展開分離普瑞霉素0.5%(重量)普瑞霉素混合物溶液是用n-丁醇∶乙醇∶水(或甲醇)為1∶1∶2的混合物制備而成。10ml(50μg 活性成份)的溶液滴到硅膠(Kieselgel)上(DC-plastikfolie，Kieselgel 60 F254或DC-Alufolie Kieselgel 60，由Merck生產，層厚0.2mm)，溶液Ⅳ作為洗提劑，色譜展開距離16cm，展開兩次，染色反應使斑點可見，用光密度分析法在590nm估算，用生物自檢試驗法檢測生物活性。
用于生物自檢試驗法的培養(yǎng)基的成份如下牛肉汁(Difco) 3gBacto蛋白胨(Difco) 5g氯化鈉 5g磷酸氫二鈉 10g磷酸二氫鉀 1gBacto瓊脂(Difco) 18g
蒸餾水加到 1000ml培養(yǎng)基在120℃保溫，然后調整PH為8.0。然后將53℃130ml的培養(yǎng)基裝到消毒玻璃盤內(18×25cm)以1∶2000的比例加上枯草桿菌(Bacillus Subtilis)ATCC 6633孢子懸浮液。將干燥過的，沒有溶劑的薄層色譜片切割成5mm寬的條帶，然后迭加到瓊脂片上，并在37℃下培養(yǎng)18-24小時。
例2在硅膠(Kieselgel)上用一次薄層色譜展開法分離普瑞霉素混合物。
按例1的過程進行，但采用溶液Ⅴ作為洗提劑，因此展開是一次完成。
例3在HPTLC色譜板上用一次展開分離普瑞霉素混合物4ml(20μg活性成份)0.5%溶液是按例1配制，將其加到HPTLC(Merck)色譜上，展開距離為18cm，其余步驟與例1相同。
例4在浸漬過的硅膠(Kieselgel)上用一次展開分離普瑞霉素混合物除展開時使用溶液混合物Ⅷ以外，其余按例1過程進行。硅膠片(Kieselgel 60 F254)按前敘方法在使用前用金屬鹽浸漬。
后面的步驟與例1所敘相同。
例5在預制的薄層色譜片上分離普瑞霉素混合物2ml 1%的被測樣品溶液加到PSC-Fertigplatten，硅膠(Kieselgel)60 F254(Merck)片上，硅膠片用溶劑混合物Ⅳ多次展開。如果將玻璃板的左側右側的3-3cm寬的條形插到預先加熱的Sakaguchi試劑中，則在室溫下以鮮明的紅色斑出現。刮掉不同的色譜餾分，并在一微滲濾器中用10%醋酸甲醇提取，直到加入硫酸香草醛時看不到反應為止。提取物在真空中蒸餾，干燥后殘留物在溶劑Ⅰ中溶解，用1/5體積的蒸餾水分四次提取。
抗菌素的成份在上層，而“層滯留重量”(layer dead weight)是在下層物相中，蒸發(fā)上層物相得到的成份按例1的方法進一步提純。
例6用分配柱色譜分離普瑞霉素的成份A1，溶劑系統(tǒng)采用固定相溶劑混合物Ⅰ流動相n-丁醇，冰醋酸和水的比例為30∶10∶60的下層物相混合物。
色譜柱的制備720g的Sephadex LH-20交聯(lián)葡聚糖凝膠在3L溶劑混合物Ⅰ中溶脹一天，將懸浮液填充到色譜柱(58×1150mm)中，固定后用1.5 L流動相沖洗。
色譜分離過程2g普瑞霉素溶解在300ml流動相和15ml固定相混合物中，將溶液過濾并施加到色譜柱上。用流動相以50-60滴/分的低流速進行洗提。
通常收集到17ml(＝800滴)的色譜餾分。繼續(xù)洗提，直到300-400ml色譜餾分為止。
如果改變物相，固定相的硅膠柱Sephadx LH-20可用3-4次，硅膠柱可按下列方法再生將它懸浮在丙酮中，過濾，將其置于丙酮蒸汽氣氛中，用丙酮蒸汽回流2小時，然后進行干燥，在不同色譜餾分中的物質可由薄層色譜法和UV光譜鑒別。
成份的離析根據分析數據(UV和TLC)，將含有相同物質的色譜餾分合并。溶劑蒸發(fā)以后得到的殘留物溶解在甲醇與苯的比例為2∶1的混合物中在蒸發(fā)。
于是得到743mg成份A的混合物和包含成份A與C的570mg混合的餾分。成份B留在此系統(tǒng)的色譜柱內，它們可用溶劑Ⅰ溶解，能得到480mg的成份B。在上述條件下成份A的混合物進一步色譜分離得到純度高于98%的主要成份A1。
例7用分配柱分離普瑞霉素的成份B1按例6所述方法得到的成份B可按前述色譜法進一步提純，但要使用所謂“B-選擇性”溶劑為提取液，這樣主要成份B1可獲得的純度高于96%。
“B-選擇性”溶液的成份如下固定相苯，n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的混合物(比例為1∶41∶10∶5∶43)的上層物相。
流動相苯，n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的混合物(比例為1∶24∶10∶5∶60)的下層物相。
例8用DCCC(小滴逆流色譜法)分離普瑞霉素成份在例6中得到的混合色譜餾分可由DCCC法進一步提純。
采用的溶劑如下固定相氯仿，甲醇，冰醋酸和水的混合物(26∶39∶9∶26)的下層物相。
流動相同樣混合物的上層物相。
洗提將溶劑攪拌2小時，靜止放置16小時，物相分離。將DCCC儀器(ID＝2.0mm，300管)用下層相(固定相)填充。130mg要提純的物質溶解在12ml上層物相(流動相)中，過濾并泵到容器中。洗提借助于上層相進行，壓力為1.7-1.8atm，流動速度為15ml/小時，于是收集到3.7ml(＝220滴)的色譜餾分。這樣得到的主成份C1純度為90%例9用吸附柱色譜法在浸漬了金屬鹽的硅膠中分離普瑞霉素的成份。色譜柱的制備
200g硅膠(Kieselgel)HF254懸浮在40g硝酸銀和500ml乙腈的溶液中，然后溶劑在真空中蒸發(fā)。浸漬過的硅膠懸浮在500ml的氯仿中后填充到色譜柱色中。為了加強固定和密實，采用了稍高的壓力(1.1-2.5大氣壓)，直到填充床的固定的高度為止。為了避免硝酸銀因見光而還原，色譜柱用鋁箔蓋住。
色譜分離的過程400mg的普瑞霉素溶解在12ml新配制的溶劑Ⅶ中，溶液借助于稍高的壓力(1.1大氣壓)被吸收在填充床上。30ml的提取液(溶劑Ⅶ)加到填充物的頂部，提取過程以1.1ml/分的流速和在稍高的壓力(1.5-2.5大氣壓)的條件下開始進行。
檢查色譜餾分中的物質用薄層色譜法鑒別。將10ml的每種餾分施加到Kie selgel 60 F254(Merck)色譜片的開始點，展開是使用溶劑Ⅴ在未飽和的通路中進行16cm完成。用冷空氣干燥后，用氯聯(lián)甲苯胺試劑和(或)硫酸展開和(或)熱處理以確定斑點的位置。
將含有相同物質的餾分合并，普瑞霉素成份在加入乙醚后沉淀。將沉淀的固體物質過濾出，并用乙腈和乙醚沖洗。殘留物溶解在n-丁醇，醋酸和水的混合物(比例為4∶1∶5)的上層，用5ml水沖洗三次。將上層溶液在真空中蒸發(fā)，以除去溶劑，殘留物用乙醚研磨，過濾后在真空中干燥。
于是得135mg的成份A1＝Chinopricin，30mg的成份A2＝midopricin，40mg的成份A3＝metipricin，20mg的成份C1＝Oxypricin，20mg的成份B1＝hydropricin.
注意在色譜柱內的，受不到光線照射的大部分硝酸銀可用乙腈沖洗回收并重新使用。
例10在現成的Lobar色譜柱上用吸收柱色譜法分離普瑞霉素的成份采用的色譜柱用Lichroprep填充的Lobar C(Merck)色譜柱，最好是兩個或多個色譜柱聯(lián)接在一起。色譜分離的方法與例9的過程相同，但采用溶劑Ⅷ作為洗提劑。3400mg普瑞霉素溶解在40mg溶劑Ⅷ中，然后將這種溶液施加到由四個色譜柱聯(lián)接的色譜柱系統(tǒng)頂部。
檢查將含有相同物質的色譜餾分合并在一起，向色譜餾分中加入相當于餾分總體積的10%的n-丁醇，溶液于真空中在最高溫度為45℃時蒸發(fā)，固體殘留物用乙醚研磨后過濾。
于是得到1100mg的成份A1＝Chinopricin，110mg的成份A2＝midopricin，80mg的成份A3＝metipricin，110mg的成份C1＝Oxypricin，20mg的成份C2＝Oxymipricin，150mg的成份B1＝hydropricin，50mg的成份B2＝hymipricin，40mg的成份B3＝hymetipricin，15mg的成份C3＝Oxymetipricin，例11普瑞霉素成份的硫酸鹽的制備按例10的過程進行，但是向合并在一起的色譜留出組分中加入的是5ml甲醇和0.3ml 1 N硫酸。加入300ml乙醚使沉淀完全。這樣就得到以硫酸鹽形式存在的例10中的普瑞霉素成份。
例12與硫酸鹽不同的普瑞霉素成份的鹽的制備從普瑞霉素成份的硫酸鹽，依據HungarianNo.2571/84的過程，加入鋇鹽即可制備出與硫酸鹽不同的其它鹽。
可以得到的與硫酸鹽不同的普瑞霉素成份的鹽可以是下述形式甲酸鹽，乙酸鹽，一氯乙酸鹽，草酸鹽，苯甲酸鹽，對甲苯磺酸鹽，高氯酸鹽，氯化物等。
普瑞霉素混合物和其成份的抗微生物活性已在不同的微生物族中試驗過。結果列在表O中。
表O普瑞霉素主要成份的抗菌譜(接種5×10/ml，在37℃中培養(yǎng)24小時)人類致病抗藥性菌種 MIC(μg/ml)主成分A1 C1 B11.金黃色葡萄球菌 CCM.885 0.05 0.075 0.5(Staphylococcus aureus)2.金黃色葡萄球菌 DSM.20231 0.05 0.05 0.1(Staphylococcus aureus)3.金黃色葡萄球菌 CCM.3217 0.25 0.05 0.1(Staphylococcus aureus)4.金黃色葡萄球菌 CCM.2326 0.25 0.05 0.25(Staphylococcus aureus)5.金黃色葡萄球菌 CCM.2514 0.25 0.05 0.1(Staphylococcus aureus)6.金黃色葡萄球菌 CCM.2515 0.25 0.025 0.1(Staphylococcus aureus)7.表皮葡萄球菌 CCM.2271 0.75 0.025 0.25(Staphylococcus epidermidis)
8.金黃色葡萄球菌(Smith) 0.25 0.05 0.5(Staphylococcus aureus smith9.糞便鏈球菌 CCM.1875 2.5 0.75 2.5(Streptococcus faecalis)10.無乳鏈球菌 CCM.5153 0.75 0.075 0.5(Streptococcus agalactiae)11.無乳鏈球菌 CCM.5534 1.0 0.25 1.0(Streptococcus agalactiae)12.泌乳障礙鏈球菌 ATTC9926 2.5 0.5 2.5(Streptococcus dysgalactiae)13.枯草桿菌 ATTC6633 0.25 0.025 0.1(Bacillus Subtilis)14.仙影拳桿菌 CCM.2010 0.25 0.025 0.25(Bacillus cereus)15.地衣桿菌 CCM.2182 0.25 0.025 0.25(Bacillus licheniformis)16.地衣桿菌 CCM.2205 0.25 0.025 0.25(Bacillus licheniformis)17.枯草桿菌 CCM.1718 0.25 0.05 0.25(Bacillus Subtilis)18.單核李氏桿菌 CCM.5576 0.5 0.075 0.25(Listeria monocytogenes)19.黃色微球菌 ATCC.10240 0.075 0.01 0.05(Micrococcus flavus)20.棕色微球菌 DSM.20030 0.05 0.01 0.075(Micrococcus lutoeus)21.脲芽孢八疊球菌 DSM.317 0.025 0.01 0.025
(Sporosarcina ureae)22.綠膿桿菌 CCM.1960 25 25 25(Pseudomonas aeruginosa)23.熒光假單胞菌 CCM.2115 25 25 25(Pseudomonas fluorescens)24.嗜酸假單胞菌 CCM.283 25 25 25(Pseudomonas acidoverans)25.普通的變形桿菌 CCM.1799 50 50 50(Proteus Vulgaris)26.宋內氏志賀氏菌 CCM.1373 50 50 50(Shigella Sonnei)27.鼠傷寒沙門氏菌 CCM.5445 50 50 50(Salmonella typhimurium)28.大腸桿菌 DSM.30038 50 50 50(Escherichiacoli)表O/a普瑞霉素抗菌素復合物對于人類致病菌的抗菌譜菌族 MIC(μg/ml)1.枯草桿菌 ATTC.6633 0.02(Bacillus Subtilis)2.枯草桿菌 CCM.1718 0.1(Bacillus Subtilis)3.仙影拳桿菌 CCM.2010 0.1(Bacillus cereus)4.地衣桿菌 CCM.2182 0.075(Bacillus licheniformis)
5.地衣桿菌 CCM.2205 0.075(Bacillus licheniformis)6.金黃色葡萄球菌 CCM.885 0.25(Staphylococcus aureus)7.金黃色葡萄球菌 CCM.2317 0.1(Staphylococcus aureus)8.金黃色葡萄球菌 CCM.2514 0.25(Staphylococcus aureus)9.金黃色葡萄球菌 CCM.2515 0.25(Staphylococcus aureus)10.糞鏈球菌 CCM.1875 0.5(Straptococcus faecalis)11.無乳鏈球菌 CCM.5534 0.5(Straptococcus agalactiae)12.泌乳障礙鏈球菌 CCM.5548 0.5(Straptococcusdysagalactiae)13.無乳鏈球菌 CCM.5153 0.5(Straptococcus agalactiae)14.結核桿菌類 typ.hu H37Rv 0.05(Mycobacterium tuberculosis)15.結核桿菌類 typ.bovin E50.8-1.0(Mycobacterium tuberculosis)16.結核桿菌類607 0.5(Mycobacterium tuberculosis)17.黃色微球菌 ATTC.10240 0.075(Micrococcus flavus)18.綠膿桿菌 CCM.1960 25
(Pseudo monas aeruginosa)19.熒光假單胞菌 CCM.2115 25(Pseudomonas fluorescens)20.嗜酸假單胞菌 CCM.283 25(Pseudomonas acidoverans)21.Pictorum假單胞菌 CCM.284 10(Pseudomonas pictorum)22.普通的變形桿菌 CCM.1799 25(Proteus vulgaris)23.宋內氏(Sonnei)志賀氏菌 CCM.1373 25(Shigella Sonnei)24.鼠傷寒沙門氏菌 CCM.5445 50(Salmonella typhi-murium)25.豬屬霍亂沙門氏菌例如巴斯德氏菌株 CCM.5438 50(Salmonella cholerae-sus Inst.Pasteur strain)26.大腸桿菌 DSM.30038 50(Escherichia coli)27.希氏溶血桿菌 CCM.5862 50(Escherichia haemolyticus)28.大腸桿菌(ATCC11775，膀胱炎) CCM.5172 50(Escherichia coli ATCC11775 cystitis)29.溶生大腸桿菌，產生大腸桿菌素 CCM.180 50(Escherichia coli lysegenic colicinogenic)30.大腸桿菌 OTKI.17963 25(Escherichia coli)
31.大腸桿菌 OTKI.23473 50(Escherichia coli)32.克雷伯氏肺炎桿菌 CCM.1848 50(Klebsiella pneumoniae)33.沙雷氏粘質桿菌 CCM.303 25(Serratia Marcescens)34.巴斯德氏菌 CCM.5419 25(Pasteurella multocida)35.副溶血弧菌 CCM.5938 25(Vibrio parahaemo lyticus)36.純白的假絲酵母屬 CBS.562 25(Candida albicans)37.熱帶的假絲酵母屬 CBS.433 25(Candida tropicalis)38.假熱帶假絲酵母屬372 5(Candida pseudo tropicalis)39.克魯澤氏假絲酵母屬K47 10(Candida Krusei K-47)40.隱球酵母屬的新型細球菌K-16 5(Cryptococcus neoformans K-16)41.啤酒酵母菌類 OKI.1282 10(Saccharomyces cerevisiae)例13增效組合物No.Ⅰn(成份數)＝2成份比A1∶B1＝75∶25其結果匯總于表Ⅰ
表的說明豎行Ⅰ成份A1的MIC值(μg/ml) 豎行Ⅱ成份B1的MIC值(μg/ml) 豎行Ⅲ含成份A1和B1的合劑的MIC值.豎行Ⅳ合劑中A1相對于A1MIC值的數值(%) 豎行Ⅴ合劑中B1相對于B1MIC值的數值(%) 豎行Ⅵ(Ⅳ+Ⅵ)/n 豎行Ⅶ抗微生物活性的加合部分(Ⅳ+Ⅴ) 豎行Ⅷ抗微生物活性的增效部分(100%-Ⅶ)表Ⅰ試驗菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.25 0.5 0.2 60 10 35 70 306 0.25 0.1 0.06 18 15 16.5 33 678 0.25 0.5 0.2 60 10 35 70 3010 0.75 0.5 0.4 40 20 30 60 4011 1 1 0.8 60 20 35 80 2012 2.5 2.5 1 30 10 20 40 6013 0.25 0.1 0.08 24 20 22 44 5614 0.25 0.25 0.1 30 10 20 40 6015 0.25 0.25 0.08 24 8 16 32 6816 0.25 0.25 0.08 24 8 16 32 6817 0.25 0.25 0.05 12 5 8.5 17 8318 0.5 0.25 0.2 30 20 25 50 5019 0.075 0.05 0.02 20 10 15 30 70例14增效合劑No.Ⅱn＝2成份比A1∶B1＝50∶5
合劑的抗微生物活性匯總于表Ⅱ被測菌株 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ的序號1 0.25 0.5 0.2 40 20 30 60 404 0.25 0.25 0.08 16 16 16 32 685 0.25 0.1 0.08 16 40 28 56 446 0.25 0.1 0.04 8 20 14 28 727 0.75 0.25 0.06 4 12 8 16 848 0.25 0.5 0.2 40 20 30 60 409 2.5 2.5 1 20 20 20 40 6010 0.75 0.5 0.08 5.3 8 6.6 13.3 86.711 1 1 0.6 30 30 30 60 4012 2.5 2.5 0.8 16 16 16 32 6813 0.25 0.1 0.08 16 40 28 56 4414 0.25 0.25 0.1 20 20 20 40 6015 0.25 0.25 0.06 12 12 12 24 7616 0.25 0.25 0.06 12 12 12 24 7617 0.25 0.25 0.05 10 10 10 20 8019 0.075 0.05 0.03 20 30 25 50 5020 0.05 0.075 0.03 30 20 25 50 50
例15增效合劑NoⅢn＝2成分比A1∶B1＝25∶75抗微生物活性的試驗結果匯總在表Ⅲ中(縮寫與表1相同)表Ⅲ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.25 0.5 0.2 20 30 25 50 504 0.25 0.25 0.1 25 30 27.5 55 456 0.25 0.1 0.03 3 22.5 11.7 25.5 74.57 0.75 0.25 0.1 3.3 30 16.7 33.3 66.78 0.25 0.5 0.2 20 30 25 50 509 2.5 2.5 1 10 30 20 40 6010 0.75 0.5 0.2 6.7 30 18.4 36.7 63.311 1 1 0.6 15 45 30 60 4013 0.25 0.1 0.05 5 37.5 21.2 42.5 57.514 0.25 0.25 0.1 10 30 20 40 6015 0.25 0.25 0.08 8 24 16 32 6816 0.25 0.25 0.08 8 24 16 32 6817 0.25 0.25 0.06 10 18 12 24 7619 0.075 0.05 0.03 10 45 27.5 55 4520 0.05 0.075 0.03 15 30 22.5 45 55
例16增效合劑NoⅣn＝2成分比A1∶C1＝75∶25關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅳ中(除了用成分C1代替B1外，縮寫與例13相同)表Ⅳ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.25 0.075 0.03 9 10 9.5 19 812 0.05 0.05 0.03 45 15 30 60 403 0.25 0.05 0.02 6 10 8 16 844 0.25 0.05 0.03 9 15 12 24 765 0.25 0.05 0.04 12 20 16 32 686 0.25 0.025 0.02 6 20 13 26 747 0.75 0.025 0.01 1 10 5.5 11 898 0.25 0.05 0.01 3 5 4 8 929 2.5 0.75 0.8 24 26.6 25.3 50.6 49.410 0.75 0.075 0.03 3 10 6.5 13 8711 1 0.25 0.2 15 20 17.5 35 6512 2.5 0.5 0.4 12 20 16 32 6813 0.25 0.025 0.02 6 20 13 26 7414 0.25 0.025 0.03 9 20 13 26 7415 0.25 0.025 0.03 9 30 19.5 39 6116 0.25 0.025 0.03 9 30 19.5 39 6117 0.25 0.05 0.03 9 15 12 24 7618 0.5 0.075 0.06 9 20 14.5 29 71
19 0.075 0.01 0.02 20 50 35 70 3020 0.05 0.01 0.02 30 50 40 80 20例17增效合劑NoⅤn＝2成分比A1∶C1＝50∶50關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅴ中(除了用成分C1代替B1外，縮寫與例13相同)表Ⅴ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.25 0.075 0.04 8 26.6 17.3 34.6 63.42 0.05 0.05 0.02 20 20 20 40 603 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 764 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 765 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 766 0.25 0.025 0.01 2 20 11 22 787 0.75 0.025 0.02 1.3 40 20.6 41.3 58.78 0.25 0.05 0.01 2 10 6 12 8810 0.75 0.075 0.02 1.3 13.3 7.3 14.6 83.412 2.5 0.5 0.6 12 60 36 72 2813 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 5614 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 5615 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 5616 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 5617 0.25 0.05 0.04 8 40 24 48 52
18 0.5 0.075 0.1 10 66.6 38.3 76.6 23.4例18增效合劑NoⅥn＝2成分比A1∶C1＝25∶75關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅵ中(除了用成分C1代替B1以外，縮寫與例13相同)表Ⅵ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ3 0.25 0.05 0.05 5 75 40 80 2012 2.5 0.5 0.6 6 90 48 96 4例19增效合劑NoⅦn＝2成分比C1∶B1＝75∶25關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅶ中(除了用成分C1代替成分A1外，縮寫與例13相同)表Ⅶ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.075 0.5 0.04 40 2 21 42 582 0.1 0.5 0.02 15 1 8 16 843 0.05 0.1 0.02 30 5 17.5 35 654 0.05 0.25 0.03 45 3 24 48 52
5 0.05 0.1 0.03 45 7.5 6.3 32.5 47.56 0.025 0.1 0.02 60 5 32.5 65 358 0.05 0.5 0.02 30 1 15.5 31 6910 0.075 0.5 0.06 60 3 31.5 63 3711 0.25 1 0.2 60 5 32.5 65 3512 0.5 2.5 0.04 6 0.4 3.2 6.4 93.617 0.05 0.25 0.02 30 2 16 32 68例20增效合劑NoⅧn＝2成分比C1∶B1＝50∶50關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅷ中(除了用成分C1代替A1外，縮寫與例13相同)表Ⅷ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.075 0.5 0.08 53.3 8 30.6 61.3 38.72 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 553 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 554 0.05 0.25 0.03 30 6 18 36 645 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 556 0.025 0.1 0.02 40 10 25 50 507 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 668 0.05 0.5 0.03 30 3 16.5 33 679 0.75 2.5 0.8 53.3 16 34.6 69.3 30.710 0.075 0.5 0.1 66.6 10 38.3 76.6 23.4
11 0.25 1 0.06 12 3 7.5 15 8512 0.5 2.5 0.03 3 0.6 1.8 3.6 96.413 0.025 0.1 0.02 40 10 25 50 5015 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 6616 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 6617 0.05 0.25 0.02 20 4 12 24 7618 0.075 0.25 0.08 53.3 10 34.6 69.3 30.7例21增效合劑NoⅨn＝2成分比C1∶B1＝25∶75關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅸ中(除了用成分C1代替成分A1外，縮寫與例13相同)表Ⅸ被測菌株的序號 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ1 0.075 0.5 0.1 33.3 15 24.1 48.3 51.72 0.05 0.5 0.04 20 6 13 26 743 0.05 0.1 0.04 20 30 25.5 50 504 0.05 0.25 0.08 40 8 24 48 526 0.025 0.1 0.02 20 15 17.5 35 657 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 61
8 0.05 0.5 0.06 30 9 19.5 39 6111 0.25 1 0.4 40 30 35 70 3012 0.5 2.5 0.1 5 3 4 8 9213 0.025 0.1 0.02 20 15 17.5 35 6514 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 6115 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 6116 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 6117 0.05 0.25 0.03 15 9 12 24 7618 0.075 0.25 0.1 33.3 30 31.6 63.3 36.719 0.01 0.05 0.02 50 30 40 80 2020 0.01 0.075 0.02 50 20 35 70 30例22增效合劑NoⅩn＝3成分比A1∶C1∶B1＝40∶30∶30關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅹ中，表Ⅹ中的縮寫意義如下豎行Ⅰ成分A1的MIC值(μg/ml)豎行Ⅱ成分C1的MIC值(μg/ml)豎行Ⅲ成分B1的MIC值(μg/ml)豎行Ⅳ包含的成分A1+B1+C1的合劑的MIC值。
豎行Ⅴ合劑中相應于成分A1的MIC值時A1的量(%)豎行Ⅵ相應于成分C1的MIC值時合劑中C1的量(%)豎行Ⅶ合劑中相應于成分B1的MIC值時成分B1的量(%)豎行Ⅷ(Ⅴ+Ⅵ+Ⅷ)/n豎行Ⅸ抗微生物活性的加合部分(Ⅴ+Ⅵ+Ⅷ)
豎行Ⅹ抗微生物活性的增效部分(100%-Ⅸ)表Ⅹ被測菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ株序號1 0.25 0.075 0.5 0.1 16 40 6 20.6 62 382 0.05 0.05 0.1 0.05 40 30 15 28.3 85 155 0.25 0.05 0.1 0.05 8 30 15 17.6 53 476 0.25 0.025 0.1 0.03 4.8 36 9 16.6 49.8 507 0.75 0.025 0.25 0.05 2.6 60 6 22.8 68.6 31.48 0.25 0.05 0.5 0.08 12.8 48 4.8 21.8 65.6 34.410 0.75 0.075 0.5 0.08 4.2 32 4.8 13.6 41 5911 1 0.25 1 0.08 3.2 9.6 2.4 5.1 15.2 84.812 2.5 0.5 1 0.6 9.6 36 7.2 17.6 52.8 47.213 0.25 0.025 2.5 0.3 4.8 36 9 16.6 49.8 50.214 0.25 0.025 0.1 0.03 4.8 36 3.6 14.8 44.4 55.615 0.25 0.025 0.25 0.03 4.8 36 3.6 14.8 44.4 55.616 0.25 0.025 0.25 0.05 8 60 6 24.6 74 2617 0.25 0.05 0.25 0.02 3.2 12 2.4 5.8 17.6 82.420 0.05 0.01 0.075 0.01 8 30 4 14 42 58例23增效合劑NoⅪn＝3成分比A1∶C1∶B1＝50∶25∶25關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅺ中(表中縮寫與例22相同)
被測菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ株序號1 0.25 0.075 0.5 0.1 20 33.3 5 19.4 58.3 41.73 0.25 0.05 0.1 0.08 16 40 20 25.3 76 244 0.25 0.05 0.25 0.1 20 50 10 26.6 80 205 0.25 0.05 0.1 0.04 8 20 10 12.6 38 626 0.25 0.025 0.1 0.04 8 40 10 19.3 58 427 0.75 0.025 0.25 0.05 3.3 50 5 19.4 58.3 41.78 0.25 0.05 0.5 0.05 10 25 2.5 12.5 37.5 62.59 2.5 0.75 2.5 1 20 33.3 10 21.1 63.3 36.710 0.75 0.075 0.5 0.1 6.6 33.3 5 14.9 44.9 55.111 1 0.2 1 0.4 20 40 10 23.3 70 3012 2.5 0.5 2.5 0.4 8 20 4 10.6 32 6813 0.25 0.025 0.1 0.04 8 40 10 19.3 58 4214 0.25 0.025 0.25 0.06 12 60 6 26 78 2215 0.25 0.025 0.25 0.03 6 30 3 13 39 6116 0.25 0.025 0.25 0.05 10 50 5 21.6 65 3517 0.25 0.05 0.25 0.05 10 25 5 13.3 40 6018 0.5 0.075 0.25 0.08 8 26.6 8 14.2 42.6 57.319 0.075 0.01 0.05 0.02 13.3 50 10 24.4 73.3 26.720 0.05 0.01 0.075 0.02 20 50 6.6 25.5 76.6 23.4例24增效合劑NoⅫn＝3成分比A1∶C1∶B1＝60∶20∶20
關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表Ⅻ中(表中縮寫意義與例22相同)被測菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ株序號1 0.25 0.075 0.5 0.08 19.2 21.3 3.2 14.6 43.7 56.34 0.25 0.05 0.25 0.1 24 40 8 24 72 285 0.25 0.05 0.1 0.04 9.6 16 7.3 11 32.9 67.16 0.25 0.025 0.1 0.03 7.2 24 6 12.4 37.2 62.87 0.75 0.025 0.25 0.05 4 40 4 24 48 528 0.25 0.05 0.5 0.04 9.6 16 1.6 9.1 27.2 72.89 2.5 0.75 2.5 1 24 26.7 8 19.6 58.7 41.310 0.75 0.075 0.5 0.03 2.4 8 1.2 3.9 11.6 88.411 1 0.25 1 0.4 24 32 8 21.3 64 3612 2.5 0.5 2.5 0.4 9.6 16 3.2 9.6 28.8 71.213 0.25 0.025 0.1 0.04 9.6 32 8 16.5 49.6 50.414 0.25 0.025 0.25 0.04 9.6 32 3.2 14.9 44.8 55.215 0.25 0.025 0.25 0.05 12 40 4 18.6 56 4416 0.25 0.025 0.25 0.04 9.6 32 3.2 14.9 44.8 55.217 0.25 0.05 0.25 0.04 9.6 16 3.2 9.6 28.8 71.219 0.075 0.01 0.05 0.02 16 40 8 21.3 64 3620 0.05 0.01 0.075 0.02 24 40 5.3 23.1 69.3 30.7例25增效合劑NoⅩⅢn＝3成分比A1∶C1∶B1＝70∶10∶20
關于合劑的抗微生物活性的結果匯總在表ⅩⅢ中(表中縮寫與例22相同)被測菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ株序號2 0.05 0.05 0.1 0.04 56 8 8 24 72 283 0.25 0.05 0.1 0.1 28 20 20 22.6 68 324 0.25 0.05 0.25 0.1 28 20 8 18.6 56 445 0.25 0.05 0.1 0.05 14 10 10 11.3 34 666 0.25 0.025 0.1 0.03 8.4 12 6 8.8 26.4 73.67 0.75 0.025 0.25 0.04 3.7 16 3.2 7.6 22.9 77.18 0.25 0.05 0.5 0.08 22.4 16 3.2 13.8 41.6 58.410 0.75 0.075 0.5 0.2 18.6 26.6 8 17.7 53.2 46.811 1 0.25 1 0.4 28 16 8 17.3 52 4812 2.5 0.5 2.5 0.6 16.8 12 4.8 11.2 33.6 66.413 0.25 0.025 0.1 0.03 8.4 12 6 8.8 26.4 73.614 0.25 0.025 0.25 0.04 11.2 16 3.2 10.1 30.4 69.615 0.25 0.025 0.25 0.06 16.8 24 4.8 15.2 45.6 54.416 0.25 0.025 0.25 0.03 8.4 12 2.4 7.6 22.8 77.217 0.25 0.5 0.25 0.04 11.2 8 3.2 7.4 22.4 77.618 0.5 0.075 0.25 0.2 28 26.6 16 23.5 70.6 29.419 0.075 0.01 0.05 0.02 18.6 20 8 15.3 46.6 53.420 0.05 0.01 0.075 0.01 14 10 2.6 8.8 26.6 73.4下面的例子指的是包含作為有效成分的普瑞霉素這種成分或其增效混合物的藥物合劑。藥物合劑的制備采用人所共知的方法。
離析的普瑞霉素成分或其混合物是被作為“有效成分”。
例26粉劑NoⅠ有效成分1.0g環(huán)糊精 9.0g10.0g例27粉劑NoⅡ有效成分 1.0g非膠狀淀粉9.0g10.0g例28粉劑NoⅢ有效成分 1.0g薰心草油 0.02g(Aetheroleum lavandulae)酸性硅膠 0.10g硬脂酸鎂 0.10g氧化鋅 0.20g白陶土 0.50g鹼式碳酸鎂1.00g(Magnesium Carbonicum hydroxidatum)環(huán)糊精 7.08g10.0g例29可噴霧的粉劑有效成分 2.0g
異丙基肉豆蔻酸鹽 1.00g(Isopropyimyristate)氟利昂11/125050(載氣) 98.8g100.00g例30水氣溶膠有效成分 0.5g乙醇(體積比為62.5%) 10.0g水 39.5g載氣 50.0g100.0g例31可噴的外科膏劑有效成分 0.1g聚乙烯-吡咯烷酮 1.50g乙醇(體積比為62.5%) 48.40g推進氣體 50.00g例32凝膠有效成分 0.20g利多卡因 2.00g葉綠素 0.005g薄荷醇 0.20gCarbope1940 1.20g三乙醇胺 1.50g
tween 20(非離子活性劑) 1.50g異己二酸鹽 5.00g96%乙醇 50.00g蒸餾水加到 100.00g成分混合并裝到一燒瓶中例33軟膏有效成分 2.00g液態(tài)石臘 33.0g白凡士林 31.0g96%乙醇 20.0gtween 60(非離子活性劑) 9.0g羊毛脂 5.0g100.0g所有成分混合后裝入瓶子中。
例34眼膏有效成分 0.04g乙醇(體積比為62.5%) 0.08g蒸餾水 3.16g蜂臘 300.00g膽甾醇(Colesterine) 25.00g無菌蓖麻油加到 1000.0g例35可用水洗的軟膏No1有效成分 2.0g
tween 60(非離子活性劑) 5.0g液體石臘 5.0g十六烷基十八烷基醇 15.0g(Cetylstearylalcohol)白凡士林 25.0g蒸餾水加到 100.0g例36可用水洗的軟膏No11乙醇(體積比為62.5%) 2.000g水 7.900g硬脂酸烯基山梨酯 3.600g(Sorboxaethene steavate)液體石臘 3.600g十六烷基十八烷基醇 10.800g白凡士林 18.000g丙基-對氧苯甲酸酯 0.054g甲基對氧苯甲酸酯 0.126g乙醇(容積96%) 2.930g利多卡因的氯化物 1.000g蒸餾水加到 100.000g例37眼膏有效成分 0.02g碳酸氫鈉 18.00g粘性溶劑(4g甲基纖維素+ 510.00g3.5g NaCl+蒸餾水到510g)苯基-汞-硼酸鹽(0.1%) 15.1g
蒸餾水加到 1000.0g例38油狀眼膏有效成分 0.02g乙醇(體積比維62.5%) 0.40g蒸餾水 1.58g膽甾醇 25.00g無菌蓖麻油加到 100.00g例39陰道栓有效成分 0.02g乙醇(體積比維62.5%) 0.262g明膠 1.40g醋酸鈉 0.26g甘油 4.50g蒸餾水加到 9.50g例40抗微生物繃帶制成普瑞霉素分離成分或它們的混合物的溶液(最好用乙醇制成)，繃帶(例如多層軟布)浸漬在此溶液中，然后以通常的方法包裝和滅菌。
這樣制備的消毒的，抗菌的繃帶是可在任何時間使用的。
權利要求
1.普瑞霉素抗菌混合物的分離工藝方法，其特征在于，該方法包括，使用一次或兩次展開的薄層色譜，或柱色譜，或兩者都使用，色譜分離過程中使用了組合溶劑體系，用此方法分離由發(fā)酵制備的普瑞霉素的粗產品，半純產品，或純產品中的組分，如需要，進而離析各個組分。
2.根據權利要求
1的方法，其中分離出的產物是普瑞霉素抗菌素混合物的成份。
3.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是式Ⅰ表示的普瑞霉素的成份A1(chinopricin)
它在薄層色譜片上用一組合的溶劑展開所得到的Rf值為0.29，并且用質譜法(FAB-MS)確定的分子量為1078。
4.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份A2(midopricin)，與成份A2同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.31，并且用質譜(FAB-MS)方法確定的分子量為1092。
5.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份A3(methipricin)，與成份A1同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.33，并且用FAB-MS方法確定的分子量為1106。
6.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是式Ⅱ所示的普瑞霉素的成份C1(oxypricin)
它在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.35，并且用FAB-MS方法確定的分子量為946。
7.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份C2(oxymipricin)，與成份C1同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.37，并且用FAB-MS方法確定的分子量為960。
8.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份C3(oxymetipricin)，與成份C1同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.39，并且用FAB-MS方法確定的分子量為974。
9.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是式Ⅲ表示的普瑞霉素的成份B1(hydropricin)
在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.54，并且用FAB-MS方法確定的分子量為930。
10.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份B2(hymipricin)，與成份B1同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.56，并且用FAB-MS方法確定的分子量為944。
11.根據權利要求
2的方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份B3(hymetipricin)，與成份B1同系，在薄層色譜片上用一組合的溶劑系統(tǒng)展開得到的Rf值為0.58，并且用FAB-MS方法確定的分子量為960。
12.按權利要求
1所述的工藝方法，其特征在于用薄層色譜法進行普瑞霉素成份的分離。
13.按權利要求
1所述的方法，其特征在于，把抗菌混合物按0.5-1.0%(重量)濃度溶解到配制好的含1-4個碳原子的醇的混合溶劑，或含有水的混合溶劑中，然后在含有硅膠的薄層色譜片上，或含有硅膠的高壓薄層色譜片上展開，色譜片上的作為固體載體的硅膠最好在金屬鹽溶液中浸漬過。
14.按權利要求
1所述的工藝方法，其特征在于用分配柱色譜法或吸收柱色譜法分離普瑞霉素的成份。
15.按權利要求
1所述的工藝方法，其特征在于，使用的色譜是現成的Lobar式色譜柱，或者用在金屬鹽溶液中浸漬過的硅膠填充的色譜柱，在吸收柱色譜中最好用銀鹽或鐵鹽，或者銀鹽和鐵鹽的溶液浸漬硅膠。
16.按權利要求
1所述的方法，其特征在于，在色譜分離過程中使用固體載體，在分配色譜和小滴逆流色譜中最好使用交連葡萄糖凝膠Sephaex LH-20。
17.根據權利要求
1所述的工藝，其特征在于，工藝過程中使用囟代烴，最好是氯仿;醇類，最好是甲醇，乙醇，丁醇，異丙醇;有機酸類，最好是甲酸，乙酸，氯代乙酸;醛類，最好是甲醛;和水作為洗提劑。
18.根據權利要求
17所述工藝，其特征在于采用n-丁醇，冰醋酸和水的比例為60∶10∶30的混合物(溶劑系統(tǒng)Ⅰ)的上層作為洗提劑。
19.按照權利要求
17所述工藝，特征在于用n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的比例為75∶2∶8∶15的混合液(溶劑系統(tǒng)11)作為洗提劑。
20.根據權利要求
17所述工藝，其特征在于采用氯仿，甲醇，冰醋酸和水的比例為45∶30∶15∶20的混合液(溶劑系統(tǒng)Ⅲ)的下層作為洗提劑。
21.按照權利要求
17所述工藝，其特征在于采用氯仿，甲醇，甲酸和水的比例為50∶35∶14∶1的混合液(溶劑系統(tǒng)Ⅳ)作為洗提劑。
22.按照權利要求
17所述工藝，其特征在于采用氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為130∶53∶6∶9∶3∶3的混合物(溶劑系統(tǒng)Ⅴ)作為洗提劑。
23.根據權利要求
17所述工藝，其特征在于采用氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為160∶53∶6∶9∶3∶3的混合物(溶劑系統(tǒng)Ⅵ)作為洗提劑。
24.根據權利要求
17所述工藝，其特征在于用15份(重量)氯代乙酸溶解到氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例為125∶53∶9∶3∶3的混合物中(溶劑系統(tǒng)Ⅶ)作為洗提劑。
25.根據權利要求
17所述工藝，其特征在于采用溶劑系統(tǒng)Ⅲ和氯仿，甲醇的比例為15∶2∶1的混合物(溶劑系統(tǒng)Ⅷ)作為洗提劑。
26.根據權利要求
1所述工藝，其特征在于柱色譜法分離是在1-5個大氣壓下進行的，最好是在超過一個大氣壓下進行。
27.根據權利要求
1所述的工藝方法，其中包括，將含有具有相同Rf值的成份的色譜餾分合并在一起，用溶劑沉淀法或蒸發(fā)法收取普瑞霉素的成份，溶劑沉淀法中最好使用乙醚。
28.根據權利要求
27所述的工藝其中，收取的普瑞霉素成份是以鹽的形式出現的，比較好的是醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽的形式。
29.根據權利要求
27所述的工藝，其中包括，把除硫酸以外的有機酸或無機酸的鋇鹽加入到普瑞霉素成份的硫酸鹽中，即形成了與硫酸鹽不同的鹽。
30.根據權利要求
27所述工藝，其中包括，加入硫酸即可使與硫酸鹽不同的形式的所收取的普瑞霉素的成份變成硫酸鹽。
31.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素成份的鹽，它是由有機酸，較可取的是含1-16個碳原子的脂族羧酸，囟代脂族羧酸，芳族羧酸，取代的芳族羧酸，有機磺酸或無機酸，特別是囟化氫或硫酸形成的。
32.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份A1(chinopricin Rf＝0.29)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
33.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份A2(midopricin Rf＝0.31)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
34.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份A3(methipricin Rf＝0.33)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
35.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份C1(oxyoricin Rf＝0.35)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
36.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份C2(oxymipricin Rf＝0.37)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
37.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份C3(oxymethipricin Rf＝0.39)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
38.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份B1(hydropricin Rf＝0.54)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
39.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份B2(hymipricin Rf＝0.56))的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
40.根據權利要求
27所述的工藝方法，其中分離出來的產物是普瑞霉素的成份B3(hymethipricin Rf＝0.58)的醋酸鹽，氯代醋酸鹽，硫酸鹽或甲酸鹽。
41.抗菌素合劑的制備方法，其特征在于，將0.001～10%(重量)的兩種或多種普瑞霉素的成份，最好是普瑞霉素的主成份(成份A1B1C1)的一種或全部再加上次要成份或這些成份的衍生物，或者這些成份和它們的衍生物，最好是鹽，有選擇地與其它抗菌素的有效成份相混合，并且加入99.999-90%(重量)的藥物上采用的載體或賦形劑或稀釋劑做成藥物合劑，或者與賦形劑、稀釋劑共用做成藥物合劑。
42.按權利要求
41所述的方法，其中，如果有效成份包含兩種普瑞霉素成份，則以重量比為5∶95到75∶25的比例混合普瑞霉素成份。
43.按權利要求
41所述的方法，其中，如果有效成份包括三種普瑞霉素成份，則以重量比為4∶3∶3到7∶2∶1的比例混合普瑞霉素成份。
44.按權利要求
41所述的方法，其中包括采用成份A1和C1的組合作為有效成份。
45.按權利要求
41所述的方法，其中包括采用成份A1和B1的組合作為有效成份。
46.按權利要求
41所述的方法，其中包括采用成份C1和B1的組合作為有效成份。
47.按權利要求
41所述的方法，其中包括采用成份A1，B1和C1的組合作為有效成份。
48.按權利要求
41到47的任何一項所述方法，其中包括以粉劑，氣霧劑，凝膠，軟膏，眼藥水或適于應用的其它配藥形式制成合劑。
49.按權利要求
41到47的任何一項所述，其中包括制成可注射的合劑，比較好的是懸浮液或可注射的溶液或粉劑安瓿-溶劑安瓿的組合。
50.按權利要求
41到47的任何一項所述的方法，其中包括，制備抗微生物的繃帶。
51.一種組合物，它包含0.001到10%(重量)的一種或多種普瑞霉素的成份與任選的其它抗微生物劑，以及99.999到99%的載體(或)稀釋和(或)賦形劑。
專利摘要
本發(fā)明涉及的是普瑞霉素抗菌素混合物的成份 和它們的鹽以及用色譜法分離各種成份的過程。本 發(fā)明的進一步涉及的是含有上述成份的增效抗微生 物合劑和它們的制備過程。
文檔編號B01D15/00GK85104165SQ85104165
公開日1986年11月26日 申請日期1985年5月31日
發(fā)明者伊姆里·茨拉吉, 吉尤拉·達卡尼, 朱蒂特·弗朗克, 加博·豪瓦斯, 加博·卡爾克薩 申請人:奇諾英·吉奧吉斯?jié)伞ぞS吉斯蒂塔米 克吉拉特導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan