本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、腦膠質(zhì)瘤(gbm)是指大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)癌變所致的原發(fā)性顱腦腫瘤。在我國(guó)，腦膠質(zhì)瘤每年的發(fā)病率高達(dá)5-8人/10萬(wàn)人。目前，對(duì)于新診斷的gbm患者，手術(shù)結(jié)合放療和化療是目前的治療標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性強(qiáng)、腫瘤邊界不清晰，腫瘤細(xì)胞在術(shù)中難以被徹底清除而易導(dǎo)致復(fù)發(fā)。同時(shí)，化療和放療產(chǎn)生的副作用較大，嚴(yán)重時(shí)可影響患者的日常生活。此外，由于大多數(shù)化療藥物的通透性較差，難以透過(guò)血腦屏障(bbb)在腦部富集。因此，設(shè)計(jì)安全有效地跨bbb的靶向遞送系統(tǒng)是目前治療gbm研究的重點(diǎn)。

2、姜黃素(cur)，一種姜科植物姜黃的根莖提取物，具有廣泛的藥理作用，能夠抗炎、抗氧化、抗腫瘤。臨床研究表明，cur單獨(dú)或與其他藥物合用，對(duì)癌癥患者具有良好的抗癌效果，且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)。cur的抗癌作用具有多靶向性，它可以調(diào)節(jié)幾乎所有類型的癌癥狀態(tài)，包括細(xì)胞增殖，癌癥信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤血管生成。有研究表明cur能夠通過(guò)以下分子機(jī)制作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在抗癌劑，包括抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)g2/m期發(fā)生停滯和凋亡，提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中死亡關(guān)聯(lián)蛋白激酶1的表達(dá)水平等，從而發(fā)揮抗癌作用。

3、由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，單一的治療策略難以有效地消除腫瘤，因此需要多種方法以克服單一治療策略的缺陷?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)療法(cdt)是一種很有前途的癌癥治療模式，它是利用腫瘤內(nèi)源性過(guò)表達(dá)的過(guò)氧化氫(h2o2)通過(guò)金屬離子催化的芬頓/類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生毒性的羥基自由基(·oh)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死?？拱┧幬锱c具有cdt活性納米材料結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤作用。與fe2+介導(dǎo)的cdt相比，cu+催化的類芬頓反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)和能量上都更有利，其催化活性比f(wàn)e2+強(qiáng)160倍。當(dāng)納米粒子被癌細(xì)胞攝取后，金屬離子會(huì)和腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的谷胱甘肽(gsh)和h2o2發(fā)生氧化還原反應(yīng)。首先，gsh會(huì)將cu2+還原為cu+，同時(shí)生成氧化型的gsh(gssg)。然后，cu+和h2o2反應(yīng)生成·oh，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡。

4、具有電荷翻轉(zhuǎn)的核殼納米粒子在提高靶向遞送效率方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。雖然負(fù)電性的納米粒可延長(zhǎng)其在血液中的循環(huán)時(shí)間，但由于其表面本身的負(fù)電性不易被腫瘤細(xì)胞攝取，導(dǎo)致藥物傳輸效率降低。正電性的納米粒由于與腫瘤細(xì)胞的相互作用增強(qiáng)表現(xiàn)出高細(xì)胞攝取，但極易被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除。因此，引入電荷翻轉(zhuǎn)策略，通過(guò)構(gòu)建負(fù)電荷的外殼，屏蔽正電荷的納米粒內(nèi)核，達(dá)到體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)效果。同時(shí)，在腫瘤微環(huán)境的特定刺激(包括ph、酶等多種因素)下，負(fù)電荷的外殼可被瓦解，隨后暴露出的正電荷納米粒內(nèi)核更易被腫瘤細(xì)胞攝取。

5、腦膠質(zhì)瘤存在復(fù)雜的bbb系統(tǒng)，后續(xù)出現(xiàn)的epr效應(yīng)也比外周腫瘤弱得多，僅靠單一的基于epr效應(yīng)的被動(dòng)靶向作用進(jìn)行g(shù)bm的治療是不足的。引入配體靶向策略有助于提高gbm的治療效果，與單配體相比，雙配體靶向具有更好的選擇性。相比于正常的組織細(xì)胞，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1在bbb內(nèi)皮細(xì)胞表面和腫瘤細(xì)胞上高度表達(dá)，唾液酸受體也在腫瘤細(xì)胞中存在著過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，可針對(duì)這兩個(gè)受體設(shè)計(jì)雙靶向配體修飾納米粒子，為增加藥物透過(guò)bbb到達(dá)腫瘤細(xì)胞，提高gbm的治療效果提供更多的可能性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒及其制備方法。本發(fā)明是以接枝咖啡酸(ca)的殼聚糖(cs)為骨架(cc)，選擇cs中的氨基及ca中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)作為納米粒配位的高親和錨點(diǎn)，二價(jià)銅(cu(ii))作為配位橋梁和中間體，而姜黃素(cur)具有配位結(jié)合能力的二酮/烯醇部分，制備了一個(gè)基于配位驅(qū)動(dòng)自組裝的谷胱甘肽(gsh)響應(yīng)藥物遞送系統(tǒng)(cc-cu-curnps)；選擇苯硼酸(pba)接枝的γ-聚谷氨酸(γ-pga)(pp)為外殼屏蔽cc-cu-curnps的正電荷，帶正電荷的內(nèi)核cc-cu-curnps和帶負(fù)電荷的外殼pp通過(guò)靜電作用以及ph敏感的硼酸酯鍵相互結(jié)合形成γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒(pp/cc-cu-cur?nps)；最后，利用靜電相互作用在納米粒表面吸附正電荷lf構(gòu)建一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒(lf-pp/cc-cu-curnps)，該納米?？梢酝高^(guò)bbb進(jìn)一步靶向腦膠質(zhì)瘤，同時(shí)具有ph/氧化還原雙響應(yīng)能力；lf-pp/cc-cu-.cur?nps通過(guò)靜脈注射給藥進(jìn)入血液循環(huán)后，通過(guò)乳鐵蛋白(lf)的靶向作用透過(guò)bbb在腦區(qū)富集；pba可與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的唾液酸(sa)受體進(jìn)一步結(jié)合，同時(shí)lf也可以和腫瘤細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1結(jié)合，使lf-pp/cc-cu-cur?nps在腦膠質(zhì)瘤內(nèi)富集：具有ph響應(yīng)性的硼酸酯鍵到達(dá)腫瘤微環(huán)境(ph?6.5)后斷裂，陰離子外殼層pp脫除，暴露出正電荷的內(nèi)核cc-cu-curnps，更易于被腫瘤細(xì)胞攝??；腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的gsh競(jìng)爭(zhēng)cu、ca和cur之間的配合位點(diǎn)，加速正電內(nèi)核的瓦解，使cur和cu2+快速釋放；一方面，釋放的天然化合物cur直接發(fā)揮抗腫瘤療效；另一方面，銅離子介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生毒性的·oh，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

2、本發(fā)明成功制備了一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒，制得的納米粒分散均勻、粒徑均一。

3、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒，特點(diǎn)是，所述γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒是以咖啡酸(ca)接枝的殼聚糖(cs)-銅-姜黃素(cur)配位驅(qū)動(dòng)自組裝形成的陽(yáng)離子納米粒為內(nèi)核，苯硼酸(pba)修飾的γ-聚谷氨酸(γ-pga)作為陰離子外殼，通過(guò)靜電作用以及ph敏感的硼酸酯鍵相互結(jié)合形成γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒；然后，乳鐵蛋白(lf)通過(guò)靜電吸附進(jìn)一步修飾在納米粒表面，構(gòu)建了一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒。

5、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸，殼聚糖核殼納米粒的制備方法，包括以下具體步驟：

6、(1)稱取100mg?cs，溶解于10ml的醋酸中(1％，v/v)，在室溫?cái)嚢柘掠眠m量甲醇稀釋。取51mg?ca溶解在適量甲醇中，并加入到cs溶液中；然后繼續(xù)投入催化劑edc(81.2mg)和nhs(48.8mg)，通過(guò)與cs中的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵；將得到的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24h，用過(guò)量的水/甲醇混合物(1：4，v/v)透析2天，過(guò)0.8μm的微孔濾膜，然后凍干得到淺棕色的cc粉末備用；

7、(2)稱取17.64mg?γ-pga溶于適量dmso：h2o(1：1，v/v)中，溶解后投入催化劑edc(46mg)和nhs(27.6mg)，冰浴活化1h；之后緩慢滴加少量三乙胺，邊滴邊攪拌，直至調(diào)節(jié)最終溶液ph呈弱堿性；稱取22.3mg?pba溶于適量dmso：h2o(1：1，v/v)中，溶解完全后并將其逐滴滴加到上述y-pga溶液中，室溫下反應(yīng)24h，用純水中透析2天，過(guò)0.8μm微孔濾膜，然后凍干得到白色海綿狀的pp固體備用；

8、(3)在磁力攪拌下，將8.5ml?cc(ph?6.5，1mg/ml)、0.5ml?cucl2(10mm)、1ml?cur(2mg/ml)混合，室溫反應(yīng)15min；隨后，反應(yīng)液40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇并過(guò)0.8μm微孔濾膜，即得cc-cu-cur?nps；

9、(4)在磁力攪拌下，將1ml的cc-cu-curnps滴入3ml濃度為10mg/ml的pp去離子水溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌3h，即得pp/cc-cu-cur?nps；

10、(5)在磁力攪拌下，將1ml濃度為3mg/ml的lf滴入到5ml的pp/cc-cu-curnps體系中，室溫下反應(yīng)12h，即得lf-pp/cc-cu-cur?nps。

11、本發(fā)明提供了一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒在制備腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

13、(1)本發(fā)明提供一種腦膠質(zhì)瘤靶向的γ-聚谷氨酸/殼聚糖核殼納米粒的制備方法，其大小適宜、粒徑均一，可通過(guò)lf和pba的靶向作用透過(guò)bbb，在腦膠質(zhì)瘤內(nèi)富集；在腫瘤組織的酸性環(huán)境中硼酸酯鍵斷裂，負(fù)電荷的外殼瓦解，暴露出正電荷的內(nèi)核，從而被腫瘤組織更好的攝??；在腫瘤細(xì)胞高濃度的gsh下，gsh競(jìng)爭(zhēng)cu、ca和cur之間的配合位點(diǎn)，加速正電內(nèi)核的瓦解，使cur和cu2+快速釋放；一方面，釋放的天然化合物cur直接發(fā)揮抗腫瘤療效；另一方面，銅離子介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生毒性的·oh，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，效果相較于其他使用單一方法治療腦膠質(zhì)瘤的藥物遞送系統(tǒng)更加顯著；

14、(2)本發(fā)明核殼納米粒所用原料均無(wú)毒、無(wú)害且具有高度的生物相容性，例如cs作為一種天然的陽(yáng)離子多糖被廣泛用作藥物載體，γ-pga是由d-和l-谷氨酸重復(fù)單元組成的陰離子聚多肽，cu是人體內(nèi)許多天然酶的氧化還原輔助因子，而lf是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白。