本發(fā)明涉及保護(hù)劑疫苗，更具體地說(shuō)，它涉及高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗。

背景技術(shù)：

1、目前，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，主要引起母豬懷孕后期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，同時(shí)其易與副豬嗜血桿菌發(fā)生混合或繼發(fā)感染，針對(duì)該病的治療需要研發(fā)疫苗對(duì)豬群進(jìn)行免疫接種。

2、但是現(xiàn)有的疫苗大多僅僅只有單獨(dú)預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的滅活疫苗，不具有同時(shí)預(yù)防容易與其發(fā)生混合感染的副豬嗜血桿菌病的疫苗，因此疫苗預(yù)防全面性差，且疫苗制配采用的佐劑不具備綜合性的免疫調(diào)節(jié)作用，極大的降低了疫苗的使用效果，同時(shí)在細(xì)胞增殖和凍干工藝上大多存在抗原效率低和保護(hù)效果差的弊端，因此需要研發(fā)一種預(yù)防效果好的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(1)要解決的技術(shù)問(wèn)題

2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其具有同時(shí)預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病與副豬嗜血桿菌病、疫苗免疫調(diào)節(jié)效果好和保護(hù)治療效果好的特點(diǎn)。

3、(2)技術(shù)方案

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，包括以下制作步驟：

5、s1、細(xì)胞培養(yǎng)

6、按猴胚胎腎上皮細(xì)胞marc-145微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行生物反應(yīng)器細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)；

7、待細(xì)胞數(shù)量增殖到適當(dāng)規(guī)模后，關(guān)閉攪拌槳，完全沉降后排出培養(yǎng)上清液，然后對(duì)微載體進(jìn)行無(wú)菌潤(rùn)洗，然后加入胰酶溶液進(jìn)行消化，然后將細(xì)胞懸液和微載體加入更大容量的生物反應(yīng)器，并補(bǔ)入生長(zhǎng)液進(jìn)行二級(jí)懸浮培養(yǎng)，并重復(fù)以上步驟，將細(xì)胞懸液和微載體加入更大容量的生物反應(yīng)器內(nèi)，并補(bǔ)入生長(zhǎng)液進(jìn)行三級(jí)培養(yǎng)；

8、s2、病毒抗原提取

9、按高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒hp-prrsv懸浮培養(yǎng)工藝在生物反應(yīng)器進(jìn)行hp-prrs的微載體懸浮培養(yǎng)，將懸浮培養(yǎng)收獲的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)凍融后，取抗原液用濾棒過(guò)濾去除微載體，得到第一抗原液；

10、取副豬嗜血桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)，收獲得到包含副豬嗜血桿菌的菌液，濃縮處理后進(jìn)行滅活清洗，并分離得到滅活后的副豬嗜血桿菌濃縮液，將濃縮液中加入吐溫-80，得到第二抗原液；

11、將得到的第一抗原液和第二抗原液按比例進(jìn)行混合，得到混合抗原液；

12、s3、佐劑的選擇與制備

13、取通過(guò)重組dna技術(shù)將豬α干擾素基因在表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)產(chǎn)生的具有抗病毒活性的豬α干擾素蛋白作為豬α干擾素配合氫氧化鋁佐劑得到復(fù)合免疫佐劑；

14、s4、耐熱保護(hù)劑的配備

15、將l-谷氨酸鈉、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、蔗糖、硫脲、明膠、海藻糖、d-山梨醇、甘氨酸和精氨酸按不同比例制成5種保護(hù)劑配方，得到5種耐熱保護(hù)劑，通過(guò)選擇不同凍干曲線(xiàn)進(jìn)行凍干，得到最佳凍干保護(hù)劑；

16、s5、配苗

17、將第一抗原液和第二抗原液使用pbs溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑫r(shí)加入復(fù)合佐免疫佐劑進(jìn)行攪拌混勻后，并與耐熱保護(hù)劑按3：1的比例進(jìn)行混合，然后定量分裝進(jìn)行凍干，得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗。

18、使用本技術(shù)方案的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗時(shí)，通過(guò)采用懸浮培養(yǎng)工藝制備的抗原疫苗，可以有效提高病毒毒價(jià)，通過(guò)抗原稀釋和耐熱保護(hù)劑的按比例配苗，保障了疫苗安全性同時(shí)提高了疫苗抗原效率，通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)，證明高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗免疫豬對(duì)毒株具有良好的保護(hù)作用，用于對(duì)豬群進(jìn)行hp-prrs的預(yù)防保護(hù)。

19、進(jìn)一步地，所述s1中所使用的生物反應(yīng)器細(xì)胞接種前應(yīng)用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后注入生物反應(yīng)器罐體，對(duì)其進(jìn)行多次沌潤(rùn)洗，待微載體完全沉降后排出上清液。

20、進(jìn)一步地，所述s1中胰酶溶液的預(yù)熱溫度為37度。

21、進(jìn)一步地，所述s2中的凍融溫度為-40度。

22、進(jìn)一步地，所述s4中的凍干曲線(xiàn)包括4種凍干曲線(xiàn)，每種凍干曲線(xiàn)包括預(yù)凍階段、升華干燥階段和解析干燥階段。

23、進(jìn)一步地，所述s3中的濾棒采用pp2材質(zhì)深層過(guò)濾濾芯。

24、進(jìn)一步地，所述s2中的最佳接毒時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)第四日，最佳收毒時(shí)間為接毒后的70—74小時(shí)。

25、進(jìn)一步地，所述pbs溶液的ph值為7.2。

26、(3)有益效果

27、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

28、1、本發(fā)明通過(guò)采用提取第一抗原液和第二抗原液進(jìn)行混合，并加入豬α干擾素配合氫氧化鋁佐劑得到復(fù)合免疫佐劑，采用懸浮培養(yǎng)工藝制備的抗原疫苗，可以有效提高病毒毒價(jià)，達(dá)到同時(shí)預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌病的效果，避免發(fā)生混合感染的情況，同時(shí)借助復(fù)合免疫佐劑，大大提高了疫苗免疫調(diào)節(jié)效果，增強(qiáng)疫苗效果，通過(guò)抗原稀釋和耐熱保護(hù)劑的按比例配苗，保障了疫苗安全性同時(shí)提高了疫苗抗原效率，通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)，證明高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗免疫豬對(duì)毒株具有良好的保護(hù)作用，用于對(duì)豬群進(jìn)行hp-prrs的預(yù)防保護(hù)；

29、2、本發(fā)明通過(guò)微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)提高了生產(chǎn)效率和穩(wěn)定性，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本并提高了疫苗質(zhì)量，通過(guò)對(duì)耐熱保護(hù)劑的選擇和凍干曲線(xiàn)的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)疫苗在2-8℃的長(zhǎng)期保存，解決了疫苗不便存放和存放成本高的弊端。

技術(shù)特征：

1.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于，包括以下制作步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s1中所使用的生物反應(yīng)器細(xì)胞接種前應(yīng)用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后注入生物反應(yīng)器罐體，對(duì)其進(jìn)行多次沌潤(rùn)洗，待微載體完全沉降后排出上清液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s1中胰酶溶液的預(yù)熱溫度為37度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s2中的凍融溫度為-40度。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s4中的凍干曲線(xiàn)包括4種凍干曲線(xiàn)，每種凍干曲線(xiàn)包括預(yù)凍階段、升華干燥階段和解析干燥階段。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s2中的濾棒采用pp2材質(zhì)深層過(guò)濾濾芯。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述s2中的最佳接毒時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)第四日，最佳收毒時(shí)間為接毒后的70—74小時(shí)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于：所述pbs溶液的ph值為7.2。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護(hù)劑活疫苗，屬于保護(hù)劑疫苗技術(shù)領(lǐng)域，其中，包括以下制作步驟：S1、細(xì)胞培養(yǎng)，按猴胚胎腎上皮細(xì)胞Marc?145微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行生物反應(yīng)器細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)；待細(xì)胞數(shù)量增殖到適當(dāng)規(guī)模后，關(guān)閉攪拌槳，完全沉降后排出培養(yǎng)上清液，本發(fā)明通過(guò)采用提取第一抗原液和第二抗原液進(jìn)行混合，并加入豬α干擾素配合氫氧化鋁佐劑得到復(fù)合免疫佐劑，采用懸浮培養(yǎng)工藝制備的抗原疫苗，可以有效提高病毒毒價(jià)，達(dá)到同時(shí)預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌病的效果，避免發(fā)生混合感染的情況，同時(shí)借助復(fù)合免疫佐劑，大大提高了疫苗免疫調(diào)節(jié)效果，增強(qiáng)疫苗效果。

技術(shù)研發(fā)人員：姬星宇,張蒙蒙,張先鋒,余社會(huì),丁麗萍,李厚偉,周曉琳,王彥輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：商丘美蘭生物工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9