本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及尿酸氧化酶及其聚乙二醇化綴合物的穩(wěn)定劑及其藥物用途。

背景技術(shù)：

1、痛風(fēng)是長(zhǎng)期嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起的疾病，其臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥，并因尿酸鹽溶解性較差，結(jié)晶沉淀累積在皮下、關(guān)節(jié)、腎臟形成痛風(fēng)石，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的急性關(guān)節(jié)炎，并累及腎臟引起尿酸性尿路結(jié)石和間質(zhì)性腎炎。人體內(nèi)嘌呤經(jīng)酶作用轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物尿酸，正常情況下，男性血液中尿酸含量149～416mmol/l,女性血液中尿酸含量89～357mol/l，體內(nèi)尿酸量約1200mg，生成與排泄量約600mg/天，處于平衡狀態(tài)。但機(jī)體攝入尿酸過多或排泄機(jī)制出現(xiàn)障礙，造成尿酸在血液中累積達(dá)到70mg/l以上，則會(huì)引起高尿酸血癥。尿酸鈉在血液或滑膜液中達(dá)到飽和狀態(tài)結(jié)晶析出，或長(zhǎng)時(shí)間高尿酸血癥在關(guān)節(jié)、軟組織周圍結(jié)晶沉淀，可導(dǎo)致痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎或痛風(fēng)性慢性關(guān)節(jié)炎以及關(guān)節(jié)畸形。尿酸鹽在腎小管、腎間質(zhì)內(nèi)的沉積引發(fā)炎癥可導(dǎo)致慢性尿酸鹽腎??；嚴(yán)重的高尿酸血癥患者(如白血病和淋巴瘤等惡性腫瘤患者)，短期內(nèi)大量尿酸沉積造成尿路阻塞引發(fā)急性腎功能衰竭，又稱尿酸腎病。

2、高尿酸血癥的成因，與人在進(jìn)化過程中尿酸酶基因的突變失活有關(guān)，因此人類不能自身合成具有活性的尿酸酶。非人類的靈長(zhǎng)目動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有活性的尿酸酶可將嘌呤代謝產(chǎn)生的尿酸轉(zhuǎn)化為溶解性更高的尿囊素，以提高腎臟的排泄效率(wortmann?rl，kelley?w?n.kelley’s?textbook?of?rheumatology(6th).2001：1339-1376)。高尿酸血癥既可能因?yàn)槟蛩嵘蛇^多造成，也有可能為尿酸排泄不足造成(hershfield,seegmiller,1976；roessler,1995)。近年來人生活質(zhì)量提高和生活飲食習(xí)慣的改變，攝入更多高蛋白和高嘌呤類食物。另一方面，在某些腫瘤化療期間的藥物及防止器官移植排斥的藥物硫唑嘌呤等會(huì)引發(fā)顯著的高尿酸血癥也有可能引起嚴(yán)重痛風(fēng)或腎功能損傷。在出現(xiàn)臨床癥狀前的輕度高尿酸血癥，可用限制飲食的方法加以控制；而當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀后，則需要相應(yīng)的藥物治療。目前臨床使用的常規(guī)治療手段包括：鎮(zhèn)痛消炎類藥物，如秋水仙堿(colchicine)、布洛芬(buprofen)、萘普生(naproxen)等，它們主要用于控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作癥狀，消除關(guān)節(jié)局部疼痛、腫脹及炎癥；促進(jìn)尿酸排泄的促尿酸尿劑(如果腎功能降低則無效)，如羧苯磺胺(probenicid)、苯磺唑酮(sulfinpyrazone)、苯溴馬龍(benzbromarone)等；抑制尿酸合成藥物，如別嘌呤醇(allopurinol)，能夠抑制黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤或黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，而是緩慢氧化生成易溶于水的異黃嘌呤。但別嘌呤醇療法可能會(huì)引起如急性腎衰竭和肝衰竭，皮膚損傷等超敏反應(yīng)綜合征，且對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生痛風(fēng)石的嚴(yán)重慢性高尿酸血癥患者難有療效。

3、尿酸酶(e?c?1.7.3.3)廣泛存在于微生物(苛求芽孢桿菌、單假絲酵母、黃曲霉)、植物(大豆、鷹嘴豆)、動(dòng)物(豬、牛、狗、狒狒)中(suzuki?k，sakasegawa?s，misaki?h，sugiyamam.jbiosci?bioeng.2004.98：153-158)，在氧氣存在的情況下，它能催化尿酸氧化尿囊素并放出二氧化碳(retailleau?p，colloc’h，denis?v，francoise?b.acta?crystd.2004.60：453-462.)。具有活性的尿酸酶是一四聚體蛋白，由相同的亞基組成，每個(gè)亞基分子量在34kd左右，由301-304個(gè)氨基酸組成。每個(gè)溶液中尿酸酶的酶活力最高的ph值為8.0(bayol?aetal.biophys?chem.1995.54：229-235.)。

4、在早期研究中，利用微生物獲取非重組表達(dá)的天然尿酸酶，即有報(bào)道利用尿酸或其結(jié)構(gòu)類似物如腺嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤及次黃嘌呤等作為培養(yǎng)基誘導(dǎo)物，提高尿酸氧化酶表達(dá)量(劉建國(guó)等，假絲酵母尿酸酶形成條件，微生物學(xué)報(bào)29(1):45-50,1989)，結(jié)果顯示尿酸作為誘導(dǎo)物時(shí)產(chǎn)生的酶活力最高，黃嘌呤和鳥嘌呤也有誘導(dǎo)作用。在該誘導(dǎo)機(jī)制中，嘌呤等底物類似物，進(jìn)入細(xì)胞在相應(yīng)酶的作用下轉(zhuǎn)化生成尿酸后，誘導(dǎo)細(xì)胞形成尿酸氧化酶(machida,y.:agric.boil.chem,44(12),1980)。

5、從黃曲霉(aspergillus?flavus)制備的尿酸酶用于治療白血病相關(guān)化療引起的高尿酸血癥已有20年以上時(shí)間(london和hudson，1957；kissel等，1968；masera等，1982；杜克大學(xué)，cn?101280293a)，尿酸酶比別嘌呤醇具有更好的療效；用于痛風(fēng)治療，輸注尿酸酶可以阻斷高尿酸血癥急性發(fā)作并減小痛風(fēng)石的體積(brogard等，1978)。2002年，法國(guó)sanofi公司研制啤酒酵母生產(chǎn)的重組黃曲霉尿酸酶elitek通過fda認(rèn)證并用于腫瘤化療引起的高尿酸血癥的短期治療。但該尿酸酶輸注療法用于治療復(fù)發(fā)性痛風(fēng)，由于微生物來源的異源性，重復(fù)輸注后患者體內(nèi)抗尿酸酶抗體對(duì)尿酸酶的清除，使得給藥后藥效迅速降低(donadio等，1981；pui等，1997)。

6、因此，如何有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性，是科研工作者拭待解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。

2、本技術(shù)的發(fā)明人在研發(fā)過程中，意外而驚喜地發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤可有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

3、為此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種尿酸氧化酶組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶組合物包括活性成分和穩(wěn)定劑，所述活性成分包括尿酸氧化酶，所述穩(wěn)定劑包括黃嘌呤。發(fā)明人在研發(fā)過程中意外的發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤可有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的尿酸氧化酶組合物含有黃嘌呤作為穩(wěn)定劑，其穩(wěn)定性大幅提高。

4、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶組合物還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

5、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比不低于0.5:1。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，當(dāng)尿酸氧化酶濃度越低時(shí)，所述尿酸氧化酶組合物體系中所能添加的黃嘌呤的量就越多，所述尿酸氧化酶組合物就越穩(wěn)定。

6、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶為天然提取的尿酸氧化酶、重組表達(dá)的尿酸氧化酶或修飾的尿酸氧化酶。

7、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述天然提取的尿酸氧化酶來源于黃曲霉、野生型微球菌屬或哺乳動(dòng)物。

8、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述修飾的尿酸氧化酶包括選自聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶、多糖側(cè)鏈修飾的尿酸氧化酶或多聚寡肽修飾的尿酸氧化酶的至少之一。

9、需要說明的是，黃嘌呤對(duì)不同來源的酶都可以在最大限度保證酶活力的前提下，大大降低免疫原性，進(jìn)一步提高尿酸氧化酶的體內(nèi)穩(wěn)定性。

10、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶與黃嘌呤通過非共價(jià)鍵形式結(jié)合，可顯著提高尿酸氧化酶及化學(xué)修飾的尿酸氧化酶在機(jī)體內(nèi)外的四聚體穩(wěn)定性。

11、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述尿酸氧化酶與黃嘌呤通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用或范德華力作用結(jié)合。

12、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為1～12mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～200):1。

13、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為1～12mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～156):1。在此范圍內(nèi)，尿酸氧化酶的穩(wěn)定性更高。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為1mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～200):1。

15、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為1mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～156):1。

16、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為6mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～34):1。

17、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為6mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～33.3):1。

18、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為6mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～26):1。

19、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為8mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～25):1。

20、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為8mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～20):1。

21、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為8mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～19.5):1。

22、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為12mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～17):1。

23、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為12mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(0.5～16.7):1。

24、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶在所述組合物中的濃度為12mg/ml，所述黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比為(1～13):1。

25、需要說明的是，本發(fā)明所涉及的尿酸氧化酶或聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶都是以四聚體的形式存在的。其中全文涉及到的黃嘌呤與尿酸氧化酶的摩爾比都是指的是黃嘌呤與尿酸氧化酶四聚體的摩爾比，此外當(dāng)涉及到黃嘌呤與尿酸氧化酶的摩爾比時(shí)，所述的尿酸氧化酶可以為尿酸氧化酶四聚體也可以為聚乙二醇尿酸氧化酶四聚體。

26、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的輔料或載體，所述輔料或載體選自下列至少之一：羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甘露醇、蔗糖、果糖類、甲基纖維素、乙酸乙烯酯共聚物、殼聚糖、海藻酸鈉、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、聚環(huán)氧乙烷、甲基丙烯酸共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯基醚共聚物、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纖維素、乙酸纖維素、甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯、聚乙烯醇、山榆酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、醋酸纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、乙基纖維素、pla、plga和聚乙二醇。

27、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶組合物為注射劑。因此，能夠使尿酸氧化酶組合物較快的在體內(nèi)分布，從而達(dá)到較好的治療效果。

28、在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了黃嘌呤在提高尿酸氧化酶穩(wěn)定性中的用途。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤通過與尿酸氧化酶及化學(xué)修飾的尿酸氧化酶以非共價(jià)鍵形式特異性結(jié)合，可顯著提高尿酸氧化酶及修飾的尿酸氧化酶在機(jī)體內(nèi)外的四聚體穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在尿酸氧化酶及修飾的尿酸氧化酶的制備過程中引入黃嘌呤，黃嘌呤與尿酸氧化酶結(jié)合，有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

29、在本發(fā)明的又一方面，發(fā)明提出了一種提高尿酸氧化酶穩(wěn)定性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括使尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可使得尿酸氧化酶與黃嘌呤特異性結(jié)合，進(jìn)而有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

30、在本發(fā)明的又一方面，發(fā)明提出了一種制備尿酸氧化酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括使尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可使得尿酸氧化酶與黃嘌呤特異性結(jié)合，進(jìn)而有效提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

31、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶為天然提取的尿酸氧化酶、重組表達(dá)的尿酸氧化酶或修飾的尿酸氧化酶。

32、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述天然提取的尿酸氧化酶來源于黃曲霉、野生型微球菌屬或哺乳動(dòng)物。

33、黃曲霉來源的尿酸氧化酶序列信息如下所示：

34、savkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslkskl

35、野生型微球菌屬來源的尿酸氧化酶序列信息如下所示：

36、mtniilgknqygkaevrlvkvtrntcrheiqdlnvtsqlrgdfeaahtagdnahvvatdtqkntvyafardgfatteefllrlgkhftegfdwvtggrwaaqqffwdrindhdhafsrnksevrtavleisgseqaivagiegltvlkstgsefhgfprdkyttlpetedrilatdvsarwryntvevdfdavyadvrglllkafaethslalqqtmyemgraviethpeideikmslpnkhhflvdlspfgqdnpnevfyaadrpyglieatiqregcradhpiwsn

37、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述修飾的尿酸氧化酶包括選自聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶、多糖側(cè)鏈修飾的尿酸氧化酶或多聚寡肽修飾的尿酸氧化酶的至少之一。

38、需要說明的是，黃嘌呤對(duì)不同來源的酶都可以在最大限度保證酶活力的前提下，大大降低免疫原性，進(jìn)一步提高尿酸氧化酶的體內(nèi)穩(wěn)定性。

39、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸是通過如下方式進(jìn)行的：將攜帶有表達(dá)所述尿酸氧化酶核酸分子的工程菌在含有黃嘌呤的發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵，以便獲得所述尿酸氧化酶。因此黃嘌呤能夠較充分的與尿酸氧化酶結(jié)合，提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

40、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述含有黃嘌呤的發(fā)酵液中的黃嘌呤的量不低于0.1克/升。

41、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸是通過如下方式進(jìn)行的：將攜帶有表達(dá)所述尿酸氧化酶核酸分子的工程菌在含有黃嘌呤的發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵處理，以便獲得所述尿酸氧化酶；將所述尿酸氧化酶進(jìn)行聚乙二醇修飾和提純處理，以便獲得聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶。因此能夠提高尿酸氧化酶的穩(wěn)定性。

42、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸是通過如下方式進(jìn)行的：將攜帶有表達(dá)所述尿酸氧化酶核酸分子的工程菌進(jìn)行發(fā)酵處理，以便獲得所述尿酸氧化酶，所述發(fā)酵體系中含有或不含有黃嘌呤；將所述尿酸氧化酶進(jìn)行聚乙二醇修飾和提純處理，以便獲得聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶，在聚乙二醇修飾或提純體系中加入黃嘌呤，即將聚乙二醇修飾的尿酸氧化酶與黃嘌呤進(jìn)行接觸。當(dāng)聚乙二醇化尿酸氧化酶四聚體在加入黃嘌呤后，表現(xiàn)出更穩(wěn)定的趨勢(shì)，且當(dāng)黃嘌呤的加入不會(huì)對(duì)聚乙二醇化尿酸氧化酶活性產(chǎn)生影響。

43、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種尿酸氧化酶。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述尿酸氧化酶是依據(jù)前面所述的方法制備的。因而所獲得的尿酸氧化酶的穩(wěn)定性高。

44、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述的尿酸氧化酶組合物或前面所述的尿酸氧化酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療高尿酸相關(guān)性疾病。

45、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述高尿酸相關(guān)性疾病包括慢性高尿酸血癥、痛風(fēng)、腎臟疾病、高尿酸性關(guān)節(jié)炎、腎結(jié)石、痛風(fēng)結(jié)節(jié)、高血壓、糖尿病、高甘油三酯血癥、代謝綜合征、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥化療引起的高尿酸血癥。

46、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述的尿酸氧化酶組合物或前面所述的尿酸氧化酶在降低生物流體中尿酸水平的用途。

47、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物流體為尿液或者血液。

48、可以理解的是，前面所述的尿酸氧化酶組合物的附加技術(shù)特征所具有的技術(shù)效果適用于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述提高尿酸氧化酶穩(wěn)定性的方法和制備尿酸氧化酶的方法的附加技術(shù)特征，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述提高尿酸氧化酶穩(wěn)定性的方法和制備尿酸氧化酶的方法的附加技術(shù)特征在此不再贅述。

49、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。