本發(fā)明屬于微生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法。

背景技術(shù)：

紅色諾卡氏菌(nocardiarubra)是具有免疫活性的微生物，經(jīng)過細胞破碎、去除細胞內(nèi)容物和蛋白質(zhì)及脂類等組份物質(zhì)，得到其細胞壁骨架，這是一種含諾卡氏霉菌酸、中性多糖以及粘肽的活性物質(zhì)，可刺激細胞免疫功能，并促進多種細胞因子分泌，參與抗腫瘤免疫過程，用于多種腫瘤的治療或輔助治療；亦可用于開發(fā)新劑型和新適應(yīng)癥如皮膚病變及胃腸道疾病等治療。

現(xiàn)有技術(shù)中，溶媒提取工藝為：“乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇單獨或混合分步提取”，此工藝所用甲醇、乙醚和三氯甲烷為有毒有害的有機溶劑，在制品中有可能有微量殘留留下隱患，并可能在操作過程中對人員造成傷害和對環(huán)境造成破壞，有待進一步改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種可節(jié)省提取時間、降低成本、避免在操作過程中對人員造成傷害和對環(huán)境造成破壞的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、乙酸乙酯提?。涸诿附夂笏玫募t色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室溫攪拌5-18小時，離心處理，棄上清液，保留沉淀碎片，紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片與乙酸乙酯的比例為1g：5-8ml；

(2)、無水乙醇攪洗：往步驟(1)中得到的沉淀碎片加入無水乙醇攪拌均勻，離心處理，棄上清液，保留沉淀碎片；

(3)、無水乙醇提?。和襟E(2)中得到的沉淀碎片中加入無水乙醇，室溫攪拌5-18小時，離心處理，棄上清液，得到最終的沉淀碎片，步驟(2)中得到的沉淀碎片與無水乙醇的比例為1g：5-8ml。

進一步的，還包括往步驟(3)中得到的最終的沉淀碎片加入無水乙醇、然后轉(zhuǎn)入干燥工序進行干燥，制得原粉。

進一步的，所述最終的沉淀碎片與無水乙醇的比例為1-3ml：1g。

進一步的，所述步驟(1)至步驟(3)的每個步驟中的離心處理的參數(shù)為：3136～4000g，6-8℃，10-30min。

進一步的，進行步驟(2)時，步驟(1)中得到的沉淀碎片與無水乙醇的比例為1g：5-8ml。

進一步的，所述步驟(1)至步驟(3)的每個步驟均可重復(fù)1-2遍。

由上述對本發(fā)明的描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：整個提取過程中先采用乙酸乙酯提取，再用無水乙醇洗滌，最后用無水乙醇提取，在不影響紅色諾卡氏菌細胞壁骨架療效的同時減少有機溶劑種類的使用，減少提取步驟，在降低提取時間、節(jié)約成本的同時降低了環(huán)境污染和在操作過程中可能對人員造成的傷害；與現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)工藝相比，本發(fā)明能有效去除細胞壁中的脂類、色素、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，同時能有效減低有機溶劑殘留，避免了傳統(tǒng)工藝中出現(xiàn)的甲醇和三氯甲烷等毒性較高的有機溶劑的殘留可能，采用的乙酸乙酯毒性較低，產(chǎn)品中可能殘留的無水乙醇屬低毒有機溶劑，遠低于國家藥典標(biāo)準(zhǔn)，由此提高了產(chǎn)品用藥安全性，保證了產(chǎn)品質(zhì)量。

具體實施方式

以下通過具體實施方式對本發(fā)明作進一步描述。

一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、乙酸乙酯提?。涸诿附夂笏玫募t色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室溫攪拌5-18小時，離心處理，棄上清液，保留沉淀碎片，紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片與乙酸乙酯的比例為1g：5-8ml，其中，離心處理的參數(shù)為：3136～4000g，8℃，20min；

(2)、重復(fù)步驟(1)1-2遍；

(3)、無水乙醇攪洗：往步驟(2)中得到的沉淀碎片加入無水乙醇攪拌均勻，離心處理，棄上清液，保留沉淀碎片，其中，離心處理的參數(shù)為：3136～4000g，8℃，20min；

(4)、重復(fù)步驟(3)1-2遍；

(5)、無水乙醇提取：往步驟(2)中得到的沉淀碎片中加入無水乙醇，室溫攪拌5-18小時，離心處理，棄上清液，得到最終的沉淀碎片，步驟(2)中得到的沉淀碎片與無水乙醇的比例為1g：5-8ml，其中，離心處理的參數(shù)為：3136～4000g，8℃，20min；

(6)、重復(fù)步驟(5)1-2遍；

(7)、往步驟(6)得到的最終的沉淀碎片中加入無水乙醇，轉(zhuǎn)入干燥工序進行干燥，制得原粉，其中無水乙醇與最終的沉淀碎片的比例為2ml：1g。

實施例1

一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、將乙酸乙酯按照乙酸乙酯與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片為6ml：1g的比例加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片中，至常溫下、磁力攪拌5小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(2)、將乙酸乙酯加入步驟(1)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌16小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯與步驟(1)得到的沉淀碎片的比例為6ml：1g；

(3)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(2)中得到的沉淀碎片為6ml：1g的比例加入步驟(2)中得到的沉淀碎片中攪勻、洗滌1次，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(4)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(3)得到的沉淀碎片為6ml：1g的比例加入步驟(3)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌5小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(5)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(4)得到的沉淀碎片為6ml：1g的比例加入步驟(4)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌16小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，得最終的沉淀碎片；

(6)、將無水乙醇按照無水乙醇與步驟(5)中得到的最終的沉淀碎片為2ml：1g的比例加入沉淀碎片中攪勻，轉(zhuǎn)入干燥工序進行干燥，得原粉。

實施例2

一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、將乙酸乙酯按照乙酸乙酯與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片為5ml：1g的比例加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片中，至常溫下、磁力攪拌7小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(2)、將乙酸乙酯加入步驟(1)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌15小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯與步驟(1)得到的沉淀碎片的比例為5ml：1g；

(3)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(2)中得到的沉淀碎片為5ml：1g的比例加入步驟(2)中得到的沉淀碎片中攪勻、洗滌1次，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(4)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(3)得到的沉淀碎片為5ml：1g的比例加入步驟(3)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌7小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(5)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(4)得到的沉淀碎片為5ml：1g的比例加入步驟(4)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌15小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，得最終的沉淀碎片；

(6)、將無水乙醇按照無水乙醇與步驟(5)中得到的最終的沉淀碎片為2ml：1g的比例加入沉淀碎片中攪勻，轉(zhuǎn)入干燥工序進行干燥，得原粉。

實施例3

一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、將乙酸乙酯按照乙酸乙酯與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片為8ml：1g的比例加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片中，至常溫下、磁力攪拌6小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(2)、將乙酸乙酯加入步驟(1)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌18小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯與步驟(1)得到的沉淀碎片的比例為8ml：1g；

(3)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(2)中得到的沉淀碎片為8ml：1g的比例加入步驟(2)中得到的沉淀碎片中攪勻、洗滌1次，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(4)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(3)得到的沉淀碎片為8ml：1g的比例加入步驟(3)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌6小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(5)、將無水乙醇按無水乙醇與步驟(4)得到的沉淀碎片為8ml：1g的比例加入步驟(4)離心處理得到的沉淀碎片，至常溫下、磁力攪拌18小時，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，得最終的沉淀碎片；

(6)、將無水乙醇按照無水乙醇與步驟(5)中得到的最終的沉淀碎片為2ml：1g的比例加入沉淀碎片中攪勻，轉(zhuǎn)入干燥工序進行干燥，得原粉。

對比例

現(xiàn)有技術(shù)中一種紅色諾卡氏菌細胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步驟：

(1)、將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，無水乙醇與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片的比例為6ml：1g；

(2)、將無水乙醇加入步驟(1)離心處理得到的沉淀碎片，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，離心處理：3136g，8℃，15min，棄上清液，留沉淀碎片；其中，無水乙醇與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片的比例為6ml：1g；

(3)、無水乙醇、無水乙醚按1：1的比例加入步驟(2)中得到沉淀碎片中攪勻，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，離心處理：3136g，-4℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片的比例為6ml：1g；

(4)、無水乙醇、無水乙醚按1：1的比例加入步驟(3)中得到的沉淀碎片中攪勻，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，離心處理：3136g，-4℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏菌細胞壁骨架碎片的比例為6ml：1g；

(5)、將三氯甲烷加入步驟(4)中得到的沉淀碎片中攪勻，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，三氯甲烷與沉淀碎片的比例為3ml：1g，加入甲醇進行離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，甲醇與沉淀碎片的比例為5ml：1g；

(6)、將三氯甲烷加入步驟(5)中得到的沉淀碎片中攪勻，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，三氯甲烷與沉淀碎片的比例為3ml：1g，加入甲醇進行離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片，其中，甲醇與沉淀碎片的比例為5ml：1g；

(7)、將甲醇加入步驟(6)中得到的沉淀碎片中攪勻、洗滌1次，三氯甲烷與沉淀碎片的比例為6ml：1g，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，留沉淀碎片；

(8)、將無水乙醇加入步驟(7)中得到的沉淀碎片中攪勻，至20～24℃恒溫下、磁力攪拌7～18h，離心處理：3136g，8℃，20min，棄上清液，得最終的沉淀碎片，無水乙醇與細胞壁骨架碎片的比例為6ml：1g；

(9)、往步驟(8)中得到的最終的沉淀碎片再加入無水乙醇，然后轉(zhuǎn)移至干燥容器進行干燥，得原粉，其中，無水乙醇與最終的沉淀碎片的比例為2ml：1g。

將實施例1、實施例2、實施例3和對比例中干燥得到的原粉，經(jīng)原粉鑒定、乳化，乳化液測其阿拉伯糖含量、取樣做抑瘤等相關(guān)檢測，得到如下的實驗數(shù)據(jù)：

通過上述的表格可知：實施例1、實施例2和實施例3相較對比例而言，原粉性狀穩(wěn)定，質(zhì)量可靠、安全、有效，特別是實施例1，原粉原有相關(guān)特性更顯著，阿拉伯糖含量、抑瘤率高；創(chuàng)新后的提取工藝不僅滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求，又可減少環(huán)境污染，保證人員健康指數(shù)，而且降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)時間，有效避免工藝操作冗長帶來的污染風(fēng)險，由此工藝生產(chǎn)出來的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架原粉不僅可用于注射用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架制劑的生產(chǎn)，還可以用于新型劑型、新適應(yīng)癥產(chǎn)品的開發(fā)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能以此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明申請專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明專利涵蓋的范圍內(nèi)。