本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及amd3100或其藥學上可接受的鹽在制備治療和/或預(yù)防腫瘤惡液質(zhì)的藥物中的應(yīng)用，以及用于治療和/或預(yù)防腫瘤惡液質(zhì)的藥物。

背景技術(shù)：

腫瘤惡液質(zhì)是腫瘤患者常見的一種伴發(fā)癥狀，主要表現(xiàn)為非意愿性的體重下降和厭食。至少有30％癌癥患者死于惡液質(zhì)，而且至少50％癌癥患者死亡時伴有惡液質(zhì)。英國愛丁堡大學臨床科學和社區(qū)健康學院fearon教授等起草的腫瘤惡液質(zhì)定義，目前基本達成共識：惡液質(zhì)是一種多因素綜合征，表現(xiàn)為患者正在丟失骨骼肌質(zhì)量(伴或不伴有脂肪質(zhì)量丟失)，而傳統(tǒng)營養(yǎng)支持不能完全逆轉(zhuǎn)，繼而引起功能損傷持續(xù)惡化。腫瘤惡液質(zhì)不僅僅使病人生活質(zhì)量明顯降低，而且導致腫瘤治療耐受性，減弱腫瘤治療效果。因此，針對腫瘤惡液質(zhì)的治療對于治療腫瘤和提高病人生活質(zhì)量都有著十分重要的作用。

隨著大量研究的開展，關(guān)于腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生機制也有了更深入的了解。腫瘤惡液質(zhì)的病理生理特征為蛋白質(zhì)和能量呈負性平衡，這一負性平衡由食物攝入減少和異常代謝綜合因素造成。盡管目前有許多臨床前研究在發(fā)生腫瘤惡液質(zhì)的動物模型中取得不錯進展，臨床上卻仍沒有藥物被批準應(yīng)用于腫瘤惡液質(zhì)的預(yù)防和治療。臨床上主要還是通過營養(yǎng)支持和鍛煉的手段來延緩腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生。

因此，急需要深入了解腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生機理，在其發(fā)生的早期進行靶向干預(yù)，以達到更好的治療效果。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,msc)，是最早從骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種非造血類的干細胞(friedenstein,a.j.,etal,1974)，參與構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境，對造血干細胞的增殖與分化具有明顯支持作用。msc廣泛分布于全身各個組織和器官，除骨髓外，還存在于牙齦，骨骼肌、脂肪等組織中，參與組織的損傷修復及穩(wěn)態(tài)維持。msc缺乏特異性標志物，主要表達cd29、cd44、cd73、cd90、cd105和cd166等間質(zhì)標志物，不表達cd11b、cd14、cd19、cd34、cd45等造血相關(guān)標志物。

巢蛋白nestin是一種中間絲蛋白。在胚胎發(fā)育時期，nestin最早表達在具有多向分化潛能的神經(jīng)上皮干細胞中。而在成體組織內(nèi)，中間絲蛋白nestin僅在未完全分化、保持一定增殖能力的成體干/祖細胞群體中表達。因此，這類nestin+細胞是成體干細胞池重要的組成部分，在維持機體干細胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近期，mendez-ferrer等人利用nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠首次證實了骨髓中存在一群nestin+細胞，并可在體外成克隆生長，具備成骨、成脂、成軟骨方向分化特性，提示中間絲蛋白nestin是骨髓間質(zhì)干細胞(msc)的重要標志。本申請發(fā)明人前期利用nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，從睪丸、腎臟、心臟等組織分選得到的gfp陽性細胞具有自我更新和多向分化潛能，并具備了修復病損組織的能力。這些結(jié)果表明nestin+msc對于組織穩(wěn)態(tài)的維持具有十分重要的作用。

綜上可見，成體干細胞伴隨著不同器官的終生，具有自我更新以及替代或修復損傷組織的功能。msc作為成體干細胞的一員，是維持機體組織內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的重要成分。在腫瘤的發(fā)生過程中，腫瘤具有招募nestin+msc進入腫瘤微環(huán)境的能力。nestin+msc被腫瘤招募走以后，組織穩(wěn)態(tài)被破壞，引起器官組織功能紊亂，成為誘發(fā)腫瘤惡液質(zhì)的重要因素。

msc表達多種趨化因子和粘附分子受體，在配體存在的條件下，可以介導msc向損傷或炎癥部位發(fā)生遷移。在腫瘤的發(fā)生過程當中，msc被招募進入腫瘤微環(huán)境多次被報道。2011年，michaelquante及其同事發(fā)現(xiàn)，在胃幽門螺旋桿菌誘導的慢性胃癌小鼠模型中，病變組織會從骨髓中招募nestin+細胞；2014年，dianaklein及其同事發(fā)現(xiàn)，小鼠b16f10和llc腫瘤可以招募骨髓以外組織的nestin+細胞參與血管的形成。這些結(jié)果提示，腫瘤具備有招募機體以nestin為標志物的msc的能力。但是，腫瘤招募msc的機制尚未完全研究清楚。

amd3100，又叫普樂沙福(plerixafor)，化學名為：1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷,其結(jié)構(gòu)式如下所示:

amd3100在1994年首次合成，目前已知其治療潛能包括hiv感染、炎癥性疾病、干細胞動員、白血病和固體腫瘤。至今未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于amd3100在惡液質(zhì)預(yù)防和治療方面的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

經(jīng)本申請發(fā)明人長期研究發(fā)現(xiàn)，化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷或其藥學上可接受的鹽可以有效地治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)，尤其為腫瘤惡液質(zhì)的治療提供了新的思路，有利于延緩或減輕腫瘤患者的惡液質(zhì)癥狀，改善腫瘤治療效果，提高生活質(zhì)量，延長生存預(yù)期。

本發(fā)明提供化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷或其藥學上可接受的鹽在制備用于治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的藥物可用作哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴等)中的惡液質(zhì)的治療和/或預(yù)防。

本發(fā)明另一方面還提供一種治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)的方法，所述方法包括向需要治療和/或預(yù)防的受試者施予有效量化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷或其藥學上可接受的鹽。

本發(fā)明所述的受試者可以指任何動物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴等哺乳動物。

本發(fā)明的藥物可經(jīng)由任何生理上可接受途徑施藥，施藥途徑例如口服、注射等。在本發(fā)明提供的實施例中，amd3100的劑型優(yōu)選為注射劑。

當用于上述治療和/或預(yù)防或其他治療和/或預(yù)防時，本發(fā)明化合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴重程度；所采用的具體化合物的活性；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

本發(fā)明所述藥物可制成藥學上可接受的劑型，一般來說，藥物有效成分占治療給藥總質(zhì)量的1-95％。藥物的劑型要適合不同給藥方式，例如口服制劑(如片劑、膠囊劑、溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，可在臨用前溶解或分散于無菌水或其他無菌可注射介質(zhì)可立即使用)等。制劑的制備可采用傳統(tǒng)工藝。

本發(fā)明所述藥物還可以含有藥學上允許的輔料或載體?？筛鶕?jù)需要任選使用藥學上可接受的輔料或載體。這些輔料或載體是我們廣泛熟知的，包括：口服制劑使用的粘合劑(如淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀釋劑(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素，和/或甘油)，潤滑劑(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽，通常是硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，還含有崩解劑，如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽，通常是藻酸鈉，和/或泡騰混合物、助溶劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、色素、矯味劑等、可注射的制劑使用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。

本發(fā)明所述“藥學上允許”是指該輔料或載體可與藥效成分兼容，較佳為能穩(wěn)定藥效成分且對被治療的個體無害。

本發(fā)明所述的惡液質(zhì)包含在惡性腫瘤、結(jié)核、糖尿病、血液疾病、內(nèi)分泌疾病、感染癥、獲得性免疫缺陷綜合癥等的慢性疾病中，以顯著的體重減少、食欲不振等為主癥狀的全身性的綜合癥。例如癌癥惡液質(zhì)、結(jié)核性惡液質(zhì)、糖尿病性惡液質(zhì)、血液疾病性惡液質(zhì)、內(nèi)分泌疾病性惡液質(zhì)、感染癥性惡液質(zhì)、由獲得性免疫缺陷綜合癥導致的惡液質(zhì)。

優(yōu)選地，所述惡液質(zhì)為腫瘤惡液質(zhì)(即由腫瘤所導致的惡液質(zhì))。

優(yōu)選地，所述治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)包括能減輕或改善腫瘤惡液質(zhì)的癥狀。

優(yōu)選地，所述治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)包括能減輕或改善肌肉、脂肪耗損的惡液質(zhì)病征。

本文使用的治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)，包括減輕或改善患者的惡液質(zhì)癥狀，進一步的，所述癥狀包括但不限于肌肉、脂肪耗損。

本文使用的短語“藥學上可接受的鹽”是指能保持原有生物活性并且適合于醫(yī)藥用途的某些鹽類。化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷能夠與不同的無機酸和有機酸生成許多不同的鹽。可以制備所述鹽的酸為生成無毒性酸加成鹽的酸，所述鹽包括但不限于檸檬酸鹽、馬來酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、丁二酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、延胡索酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽等。

本文使用的術(shù)語“治療”是指減輕或改善病癥，即延緩或抑制病癥或至少一種臨床癥狀的發(fā)展。

本文使用的術(shù)語“預(yù)防”是指所述病癥的癥狀出現(xiàn)之前向受試者施用本發(fā)明化合物。

如本文使用，如果受試者將在生物學上、醫(yī)學上或生活質(zhì)量上受益于治療，則受試者“需要”此類治療。

本申請發(fā)明人提出機體間充質(zhì)干細胞的缺失是導致腫瘤惡液質(zhì)發(fā)生的原因，并經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，化合物1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷或其藥學上可接受的鹽可以有效地治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)，為惡液質(zhì)的治療提供新的思路。不僅是理論上，而且經(jīng)由實驗結(jié)果驗證，它們主要通過阻斷腫瘤對肌肉、脂肪等全身多種組織的間充質(zhì)干細胞的招募，從而有利于維持機體組織的穩(wěn)態(tài)，延緩惡液質(zhì)的發(fā)生，而且還有利于減輕或緩解患者的惡液質(zhì)癥狀，改善治療效果，提高生活質(zhì)量以及延長患者的生存預(yù)期。

附圖說明

圖1中的圖a-圖d分別是c57bl/6惡液質(zhì)組小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后及對照組：(a)小鼠進食檢測；(b)小鼠體重監(jiān)測；(c)和(d)分別是對脂肪組織和肌肉組織的重量檢測。

圖2中的圖a-圖d分別是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠對照組和惡液質(zhì)組：(a)和(b)分別是小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色、對切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計；(c)熒光定量pcr檢測脂肪組織中nestin表達；(d)和(e)分別是小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色、對切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計；(f)熒光定量pcr檢測肌肉組織中nestin表達。

圖3是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后:(a)小鼠腫瘤組織切片免疫熒光染色，以及對切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計；(b)熒光定量pcr檢測腫瘤組織中g(shù)fp表達；(c)和(d)是利用流式細胞術(shù)檢測外周血中nestin-gfp+細胞。

圖4是腫瘤趨化因子表達熒光定量pcr檢測結(jié)果。

圖5是小鼠msc趨化受體表達檢測結(jié)果。

圖6是cxcl12促進小鼠nestin+細胞遷移實驗結(jié)果。

圖7是amd3100體內(nèi)抑制msc遷移實驗結(jié)果。

圖8是體內(nèi)使用amd3100后，小鼠腫瘤惡液質(zhì)癥狀監(jiān)測結(jié)果。

圖9是體內(nèi)使用amd3100的荷瘤小鼠生存期實驗結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。

amd3100從美國apexbio公司購買，藥物貨號為a2025。

實施例中所用試劑若非特別說明，均為本領(lǐng)域現(xiàn)有常規(guī)試劑，均可通過商業(yè)渠道購買獲得。實施例中未特別說明的實驗操作，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作或是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其掌握的現(xiàn)有技術(shù)或公知常識所能理解或知曉的。

實施例1路易斯肺癌llc的培養(yǎng)，以及小鼠nestin+細胞的分離和培養(yǎng)

1.1llc細胞培養(yǎng)：利用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)培養(yǎng)llc細胞(atcc#crl-1642)，備用。

1.2小鼠肌肉nestin+細胞的分離

取成年nestin-gfp轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(由drmasahiroyamaguchi提供，也可通過商業(yè)渠道獲得)，在無菌條件下，完整切取雙側(cè)腓腸肌，迅速置于盛有pbs的培養(yǎng)皿中。將肌肉塊以pbs沖洗3遍，剪成小塊肌組織，盡可能剔除血管、神經(jīng)、結(jié)締組織。采用i型膠原酶消化分離肌細胞：將肌組織轉(zhuǎn)移至離心管，加入i型膠原酶，置于37℃恒溫振蕩水浴箱消化30分鐘。加入血清中止消化，將消化液1,100rpm離心4分鐘，吸除上清液，沉淀以pbs重懸，濾過200目濾網(wǎng)。收集濾液，離心4分鐘，去除上清，沉淀加入pbs重懸，利用流式細胞儀分選nestin+細胞。

1.3小鼠脂肪nestin+細胞的分離

選取6周左右的雄性nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠，在無菌條件下分離小鼠腹股溝處的脂肪組織，pbs充分清洗(至少洗6遍)后，用剪刀將脂肪組織充分剪碎；加入10ml0.1％膠原酶iv+0.05％胰酶+0.1％dispaseⅱ混合液，在37℃攪拌60min；然后加入含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基終止消化，用100目及200目篩網(wǎng)過濾，以800g離心5min，棄去上清液，加入培養(yǎng)基輕輕吹打混勻制備細胞懸液；利用流式細胞儀分選nestin+細胞。

1.4小鼠肌肉、脂肪來源nestin+細胞的培養(yǎng)

上述1.2、1.3中從肌肉、脂肪組織獲得的nestin+細胞，用dmem/低糖(10％胎牛血清)培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)。

實施例2小鼠飼養(yǎng)及腫瘤惡液質(zhì)模型的構(gòu)建

2.1小鼠飼養(yǎng)方法：用常規(guī)小鼠飼料(蛋白質(zhì)含量在20-25wt％，脂肪含量在5％-10wt％，粗纖維含量在3-5wt％)飼養(yǎng)小鼠。

2.2小鼠腫瘤惡液質(zhì)模型的構(gòu)建

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠(從南京大學模式動物研究所購買)或nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠，將小鼠隨機分為對照組和惡液質(zhì)組。每只惡液質(zhì)組小鼠腹股溝皮下注射約4*10^6個路易斯肺癌llc細胞，實驗過程在超凈臺中進行，注意無菌操作。接種當天計為day0，然后為day1、day2，依次類推。在腫瘤接種第7天檢測到荷瘤小鼠體重開始下降，腫瘤惡液質(zhì)已經(jīng)開始發(fā)生；到第21天，小鼠體重明顯下降，惡液質(zhì)體征明顯。

實施例3小鼠腫瘤惡液質(zhì)的評價

實施例2中惡液質(zhì)組小鼠接種腫瘤后每天同一時間點觀察小鼠毛色和活動情況、體重、攝食量和腫瘤大小，并與對照組對比。接種腫瘤后每隔2天直至21天，或取第7天、第14天、第21天，采用過量麻醉法處死小鼠，去除腫瘤組織，并稱量所有動物去瘤體重；分離股四頭肌(quad)、腓腸肌(gast)、脛骨前肌(ta)、附睪脂肪組織(ewat)、腹股溝脂肪組織(iwat)、背肩胛間棕色脂肪組織(ibat)，分別進行稱重。

圖1中圖a所示為對照組和惡液質(zhì)組c57bl/6小鼠每天進食檢測結(jié)果，圖b是對照組和惡液質(zhì)組小鼠的體重監(jiān)測結(jié)果；圖c和圖d分別是脂肪組織和肌肉組織的重量檢測。由圖1可知：c57bl/6小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后，小鼠發(fā)生了腫瘤惡液質(zhì)。

實施例4小鼠骨骼肌、脂肪組織、腫瘤中nestin-gfp+細胞的檢測

4.1免疫熒光染色

對照組和惡液質(zhì)組的nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠分別分離股四頭肌(quad)、腓腸肌(gast)、脛骨前肌(ta)，用4％pfa固定8h后，換30％濃度(質(zhì)量)蔗糖脫水48小時，采用冰凍切片。利用laminin抗體標示基底膜后，孵育熒光二抗，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察。

對照組和惡液質(zhì)組的c57bl/6小鼠分別分離附睪脂肪組織(ewat)、腹股溝脂肪組織(iwat)、背肩胛間棕色脂肪組織(ibat)，用4％pfa固定8h后，利用酒精梯度脫水，采用石蠟切片。利用二甲苯、酒精梯度脫蠟后，參考前文中骨骼肌染色方法利用nestin抗體染色，并在顯微鏡下觀察。

惡液質(zhì)組nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤組織的處理同肌肉組織，冰凍切片后，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察。

圖2中的圖a為nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組的小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色觀察結(jié)果；圖2中的圖b是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天的小鼠脂肪組織切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計和對照組的nestin-gfp+細胞統(tǒng)計結(jié)果。

圖2中的圖d是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組培養(yǎng)21天的小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色觀察結(jié)果；圖2中的圖e是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天，以及對照組培養(yǎng)21天的小鼠肌肉組織切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計結(jié)果。

圖3中的圖a是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組在皮下移植llc腫瘤細胞后7天、14天、21天的腫瘤組織切片免疫熒光染色觀察結(jié)果；圖3中的圖c和圖d是利用流式細胞術(shù)檢測對照組和惡液質(zhì)組的小鼠外周血中nestin-gfp+細胞的結(jié)果圖。

4.2熒光定量pcr

用定量pcr對nestin基因表達進行分析的具體步驟如下：從實施例2每個實驗組中小鼠取肌肉(quad、gast、ta)和脂肪(ewat、iwat、ibat)、以及惡液質(zhì)組中小鼠取腫瘤組織，液氮研磨組織后，使用trizol法提取總rna。對rna進行逆轉(zhuǎn)錄，得到單鏈cdna，然后利用roche公司lc480系統(tǒng)進行熒光定量pcr檢測nestin或gfp基因表達狀況，所用的nestin引物為5’-ggctacatacaggattctgctgg-3’(f)和5’-caggaaagccaagagaagcct-3’(r)，所用的gfp引物為5’-ggagctgcacacaacccattgcc-3’(f)和5’-gatcactctcggcatggacgagc-3’(f)。

檢測結(jié)果見圖2中的圖c、f。其中，圖2中的圖c是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測脂肪組織中的nestin表達；圖2中的圖f是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測肌肉組織中的nestin表達。

圖3中的圖b是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后熒光定量pcr檢測腫瘤組織中g(shù)fp表達。

由實施例4的檢測結(jié)果可見：nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠皮下移植llc腫瘤細胞后，骨骼肌和脂肪組織中nestin-gfp+細胞不斷減少，腫瘤中nestin-gfp+細胞不斷增加。

實施例5腫瘤趨化因子表達檢測，與小鼠msc趨化受體表達檢測

5.1腫瘤趨化因子表達利用熒光定量pcr檢測

利用4.2提到的腫瘤組織處理方法得到單鏈cdna，然后利用roche公司lc480系統(tǒng)進行熒光定量pcr檢測各趨化因子基因表達狀況。

熒光定量pcr所用的各引物如下：

(1)小鼠ccl2引物為：

5’-tgtcatgcttctgggcctgct-3’(f)；和

5’-ttcactgtcacactggtcact-3’(r)；

(2)小鼠ccl3引物為：

5’-ggtctccacactgccctt-3’(f)；和

5’-tcaggcattcagttccaggtc-3’(r)，

(3)ccl5引物為：

5’-atatggctcggacaccactc-3’(f)；和

5’-tccttcgagtgacaaacacg-3’(r)，

(4)ccl7引物為：

5’-gtgtccctgggaagctgtta-3’(f)；和

5’-ctttggagttggggttttca-3’(r)，

(5)ccl8引物為：

5’-cgcagtgcttctttgcctg-3’(f)；和

5’-tctggcccagtcagcttctc-3’(r)，(6)cxcl1引物為：

5’-gctgggattcacctcaagaa-3’(f)；和

5’-aagggagcttcagggtcaag-3’(r)，

(7)cxcl2引物為：

5’-gccaagggttgacttcaaga-3’(f)；和

5’-ttcagggtcaaggcaaactt-3’(r)，

(8)cxcl3引物為：

5’-ttctaaatcagagaaaagcgat-3’(f)；和

5’-tagatgcaattatacccgtag-3’(r)，

(9)cxcl11引物為：

5’-tgtaatttacccgagtaacggc-3’(f)；和

5’-cacctttgtcgtttatgagcctt-3’(r)，

(10)cxcl12引物為：

5’-tgcatcagtgacggtaaacca-3’(f)；和

5’-ttcttcagccgtgcaacaatc-3’(r)，

(11)hgf引物為：

5’-tcttgccagaaagatatccc-3’(f)；和

5’-ttttaattgcacaatactccc-3’(r)。

熒光定量pcr結(jié)果如圖4所示，從圖4可見，小鼠腫瘤中高表達趨化因子cxcl12。

5.2小鼠msc趨化受體cxcr4表達檢測

將小鼠脂肪和肌肉來源的細胞利用4％pfa固定15min后，利用0.2％triton穿透15min，再利用1％bsa封閉30min。4℃孵育1:100稀釋的nestin抗體(小鼠來源)和1:100稀釋的cxcr4抗體(兔來源)14h。pbs洗10min，3遍，再37℃孵育綠色小鼠熒光二抗(1:500)和紅色兔熒光二抗(1:500)30min。pbs洗10min，3遍，利用0.2％1g/mldapi復染細胞核5min，0.01mpbs洗2次，顯微鏡下觀察?？梢姡瑥男∈蠹∪夂椭窘M織分離得來的nestin+細胞表達cxcr4。

實施例6cxcl12促進小鼠nestin+細胞遷移實驗

將corningtranswell小室(8μm孔徑)架在24孔板上，接種體外培養(yǎng)的肌肉和脂肪來源的nestin+細胞(見實施例1)于transwell的小室中，2x10⁴個/孔，置5％co²、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔分別加入500μldmem/低糖到transwell下室，實驗組含1μmol/mlcxcl12因子，對照組不添加cxcl12因子。24小時后取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)的細胞，輕柔沖洗；無水乙醇固定漂洗兩遍；將各組小室做好標記，分別架在廢棄的孔板上，每孔中加入結(jié)晶紫染色液，室溫孵育15分鐘；洗去多余染液。在倒置顯微鏡下檢測各組遷移的細胞數(shù)量，隨機取個5視野(400倍)，計算每組遷移細胞鏡下數(shù)目，每組3個復孔，將所得結(jié)果取平均值。結(jié)果見圖6所示，從圖6可見，cxcl12可促進小鼠nestin+細胞的遷移。

實施例7amd3100體內(nèi)抑制msc遷移實驗實施例

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠，設(shè)對照組(control)、惡液質(zhì)組(llc)、及amd3100組(llc+amd3100)。

對照組：不處理。

惡液質(zhì)組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內(nèi)含有生理鹽水。

amd3100組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內(nèi)含有amd3100。小鼠amd3100的使用量為0.15mg/kg體重/天。安裝緩釋泵14天后，處死小鼠，取肌肉和脂肪組織切片進行免疫熒光染色或提取rna逆轉(zhuǎn)錄進行熒光定量pcr，檢測nestin的表達。

免疫熒光染色結(jié)果參見圖7中圖a、圖b。圖7中的圖a為nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，以及對照組小鼠培養(yǎng)21天后小鼠脂肪組織切片免疫熒光染色觀察結(jié)果；圖7中的圖b是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，以及對照組小鼠培養(yǎng)21天后的小鼠脂肪組織切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計結(jié)果。

圖7中圖c、圖d。圖7中的圖c為nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，及對照組小鼠培養(yǎng)21天后小鼠肌肉組織切片免疫熒光染色觀察結(jié)果；圖7中的圖d是nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠惡液質(zhì)組、amd3100組在皮下移植llc腫瘤細胞后21天后，及對照組小鼠培養(yǎng)21天后的小鼠肌肉組織切片中nestin-gfp+細胞統(tǒng)計結(jié)果。

由實驗結(jié)果可見，體內(nèi)使用amd3100后，荷瘤小鼠骨骼肌和脂肪組織中nestin-gfp+細胞增加。

實施例8amd3100延長荷瘤小鼠生存期實施例

取8周齡體重相差不超過2g的雄性c57bl/6小鼠。設(shè)對照組(control)、惡液質(zhì)組(llc)、及amd3100組(llc+amd3100)。

對照組：不處理。

惡液質(zhì)組：將4x106llc移植至小鼠腹股溝皮下。7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內(nèi)含有生理鹽水。

amd3100組：將4x10⁶llc移植至小鼠腹股溝皮下7天后，使用100μl10％水合氯醛麻醉小鼠，在其背部皮下植入alzet緩釋泵(型號：1004)，泵內(nèi)含有amd3100。小鼠amd3100的使用量為0.15mg/kg體重/天。連續(xù)觀察小鼠狀態(tài)至腫瘤細胞接種后35天。

實驗結(jié)果參見圖8、圖9。

其中，圖8中的圖a是各實驗組小鼠體重情況，圖8中的圖b是各實驗組小鼠脂肪和肌肉組織發(fā)生萎縮情況。圖8中的圖c是各實驗組小鼠的脂肪和肌肉重量情況。由圖8的實驗結(jié)果可見，體內(nèi)使用amd3100后，小鼠腫瘤惡液質(zhì)癥狀得到緩解。

圖9是各實驗組小鼠生存期對比圖，可見，體內(nèi)使用amd3100，能夠延長荷瘤小鼠生存期。

本發(fā)明通過上述實驗，證實了腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生與間充質(zhì)干細胞有關(guān)，并評估了nestin+間充質(zhì)干細胞在發(fā)生腫瘤惡液質(zhì)的小鼠肌肉和脂肪組織中的含量。對小鼠肌肉和脂肪進行切片和免疫熒光染色，統(tǒng)計nestin+細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)發(fā)生腫瘤惡液質(zhì)小鼠相對正常小鼠具有更少的nestin+細胞。同時，熒光定量pcr也提示，發(fā)生腫瘤惡液質(zhì)小鼠肌肉和脂肪中nestin表達下降。以上結(jié)果提示，腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生，伴隨著肌肉和組織中間充質(zhì)干細胞的減少。

本申請發(fā)明人利用nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠，給小鼠荷瘤后，在腫瘤切片中發(fā)現(xiàn)了nestin-gfp+細胞。并且隨著腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生，nestin-gfp+細胞的數(shù)目會越來越多。以上結(jié)果提示，機體nestin+細胞減少，是因為向腫瘤發(fā)生了遷移，證明了機體間充質(zhì)干細胞的減少是因為向腫瘤發(fā)生了遷移。

本申請發(fā)明人首先利用熒光定量pcr在腫瘤中檢測到了cxcl12的高表達，而通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)從小鼠肌肉和脂肪組織分離得來的nestin+細胞表達cxcr4。在體外，發(fā)明人使用cxcl12發(fā)現(xiàn)可以促進肌肉和脂肪來源nestin+細胞的transwell遷移。在小鼠體內(nèi)，利用alzet緩釋泵給荷瘤小鼠使用0.15mg/kg體重/天的amd3100，可以成功抑制肌肉和脂肪nestin+細胞向腫瘤的遷移，使肌肉脂肪中nestin+細胞相對不給amd3100組有明顯恢復。以上結(jié)果證實在腫瘤惡液質(zhì)的情況下，cxcl12-cxcr4趨化軸介導小鼠肌肉和脂肪來源nestin+細胞的遷移。

本申請發(fā)明人通過對小鼠體重以及肌肉、脂肪的重量的稱量，發(fā)現(xiàn)在荷瘤同等天數(shù)，使用amd3100的小鼠比不使用的小鼠惡液質(zhì)癥狀更輕。另外，對荷瘤小鼠的生存期觀察發(fā)現(xiàn)，amd3100的小鼠比不使用的小鼠生存期更長。

以上實驗結(jié)果顯示，amd3100對于腫瘤惡液質(zhì)的預(yù)防和治療有著明顯的療效，對腫瘤患者使用amd3100，可以阻斷腫瘤對肌肉、脂肪、骨髓等全身多種組織的間充質(zhì)干細胞的招募，有利于維持機體組織的穩(wěn)態(tài)，延緩腫瘤惡液質(zhì)的發(fā)生，并有利于減輕腫瘤患者的惡液質(zhì)癥狀，改善腫瘤治療效果，提高生活質(zhì)量，延長生存預(yù)期。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

序列表

<110>中山大學

<120>amd3100在制備治療和/或預(yù)防惡液質(zhì)的藥物中的應(yīng)用

<160>26

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>1

ggctacatacaggattctgctgg23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>2

caggaaagccaagagaagcct21

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>3

ggagctgcacacaacccattgcc23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>4

gatcactctcggcatggacgagc23

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>5

tgtcatgcttctgggcctgct21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>6

ttcactgtcacactggtcact21

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>7

ggtctccacactgccctt18

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>8

tcaggcattcagttccaggtc21

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>9

atatggctcggacaccactc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>10

tccttcgagtgacaaacacg20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>11

gtgtccctgggaagctgtta20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>12

ctttggagttggggttttca20

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>13

cgcagtgcttctttgcctg19

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>14

tctggcccagtcagcttctc20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>15

gctgggattcacctcaagaa20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>16

aagggagcttcagggtcaag20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>17

gccaagggttgacttcaaga20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>18

ttcagggtcaaggcaaactt20

<210>19

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>19

ttctaaatcagagaaaagcgat22

<210>20

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>20

tagatgcaattatacccgtag21

<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>21

tgtaatttacccgagtaacggc22

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>22

cacctttgtcgtttatgagcctt23

<210>23

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>23

tgcatcagtgacggtaaacca21

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>24

ttcttcagccgtgcaacaatc21

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>25

tcttgccagaaagatatccc20

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>26

ttttaattgcacaatactccc21