本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及神秘果提取物在制備延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激作用的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

神秘果(synsepalumdulcificumdaniell)屬山欖科神秘果屬，雖原產(chǎn)于西非熱帶地區(qū)，現(xiàn)已在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植。神秘果果肉含有豐富奇特的糖蛋白、維生素、有機(jī)酸、黃酮、花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?，F(xiàn)階段對(duì)于神秘果全株的研究表明，其具有調(diào)節(jié)血壓、血脂，減輕痛風(fēng)、尿酸、保肝解酒等功效。

秀麗線(xiàn)蟲(chóng)作為國(guó)際上衰老研究的熱點(diǎn)模式生物及其衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作為天然產(chǎn)物延緩衰老的機(jī)制研究提供了極具價(jià)值的信息平臺(tái)。秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的glp-1是n-糖基化跨膜蛋白，編碼性腺末端細(xì)胞(distaltipcell/dtc)生殖增殖信號(hào)受體，決定生殖細(xì)胞命運(yùn)，是生殖細(xì)胞有絲分裂和維護(hù)生殖干細(xì)胞的基礎(chǔ)，與線(xiàn)蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)有關(guān)。發(fā)明人利用神秘果提取物喂養(yǎng)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(c.elegans)，研究其是否具有提高線(xiàn)蟲(chóng)抗衰老及增強(qiáng)氧化應(yīng)激的能力，進(jìn)而對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行研究，揭示神秘果提取物抗衰老及增強(qiáng)氧化應(yīng)激的機(jī)制，從而安全地用于藥物、食品及化妝品領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了神秘果提取物在制備延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種神秘果提取物在制備延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用，其中，所述神秘果提取物通過(guò)以下步驟提?。?/p>

用提取溶液對(duì)神秘果果肉進(jìn)行負(fù)壓空化提取，得到提取液；

將得到的所述提取液濃縮后，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂分離，收集洗脫液；

所述洗脫液再經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥，獲得神秘果提取物；

所述提取溶液是ph為1.5～5.5的酶溶液，且所述提取溶液與所述神秘果果肉的液固比為5～20ml/g。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述酶為纖維素酶、果膠酶，或質(zhì)量比為1∶2～6∶1的所述纖維素酶和所述果膠酶組成的復(fù)合酶。優(yōu)選地，所述酶與所述神秘果果肉用量比為1.0～8.0mg/g。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述提取溶液用有機(jī)酸，諸如冰乙酸或檸檬酸調(diào)節(jié)ph。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，所述負(fù)壓空化提取的提取溫度為20℃～55℃，提取壓力為-0.04mpa～-0.07mpa。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述大孔吸附樹(shù)脂選自hp2mgl、hp-20、ads-5、ads-8、ads-17、d3520、d4020、d14、d16型大孔吸附樹(shù)脂。

優(yōu)選地，所述大孔吸附樹(shù)脂分離中用的洗脫液為60～90％(v/v)的乙醇水溶液。

在用60～90％(v/v)的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫之前先用10～20％(v/v)的乙醇水溶液洗脫。

所述神秘果提取物依賴(lài)生殖細(xì)胞系(germline)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激作用。

所述神秘果提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的有效作用濃度為0.001～0.01mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物抗衰老作用效果明顯，且具有顯著的生物安全性，從而可用于制備用于延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激的藥物、食品或化妝品。

附圖說(shuō)明

圖1示出了325nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物的uplc色譜圖。

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物依賴(lài)于生殖細(xì)胞系信號(hào)通路來(lái)延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命。

圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)h2o2耐受的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種神秘果提取物在制備延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用，其中，所述神秘果提取物通過(guò)以下步驟提?。?/p>

用提取溶液對(duì)神秘果果肉進(jìn)行負(fù)壓空化提取，得到提取液；

將得到的所述提取液濃縮后，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂分離，收集洗脫液；

所述洗脫液再經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥，獲得神秘果提取物。

其中，提取溶液是ph為1.5～5.5的酶溶液，且所述提取溶液與所述神秘果果肉的液固比為5～20ml/g。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述酶溶液中的酶為纖維素酶、果膠酶，或質(zhì)量比為1∶2～6∶1的所述纖維素酶和所述果膠酶組成的復(fù)合酶。優(yōu)選地，所述酶與所述神秘果果肉用量比為1.0～8.0mg/g。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述提取溶液用諸如冰乙酸或檸檬酸的有機(jī)酸調(diào)節(jié)ph。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，所述負(fù)壓空化提取的提取溫度為20℃～55℃，提取壓力為-0.04mpa～-0.07mpa。

上述負(fù)壓空化提取優(yōu)選進(jìn)行連續(xù)提取1～3次，每次15～35min。

優(yōu)選地，在進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂分離之前，將所得提取液減壓濃縮至所用提取溶劑總體積的1/7～1/5。

根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，所述大孔吸附樹(shù)脂選自hp2mgl、hp-20、ads-5、ads-8、ads-17、d3520、d4020、d14、d16型大孔吸附樹(shù)脂。

優(yōu)選地，所述大孔吸附樹(shù)脂分離中用的洗脫液為60～90％(v/v)的乙醇水溶液。

在用60～90％(v/v)的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫之前先用10～20％(v/v)的乙醇水溶液洗脫。

上述神秘果提取物依賴(lài)生殖細(xì)胞系信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激作用。

所述的大孔吸附樹(shù)脂富集分離技術(shù)，所用大孔吸附樹(shù)脂選自hp2mgl、hp-20、ads-5、ads-8、ads-17、d3520、d4020、d14、d16型大孔吸附樹(shù)。上述層析樹(shù)脂柱的徑高比為1∶5～1∶20，上樣體積為2～6bv，上樣流速為1.5～4bv/h，吸附平衡后以3～8bv/h的流速用5～7bv水洗脫去糖，4～10bv50％～60％酸性乙醇洗脫，所得洗脫溶液經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥后得神秘果果實(shí)提取物。

神秘果提取物的制備

實(shí)施例1

稱(chēng)取去核神秘果果肉400g，加入質(zhì)量比為6:1的纖維素酶和果膠酶的水溶液，用檸檬酸將該水溶液調(diào)節(jié)至ph3.5。酶與神秘果果肉用量比為5.0mg/g，進(jìn)行負(fù)壓空化提取。提取用酶水溶液與神秘果果肉的液固比為10ml/g。提取溫度為50℃，連續(xù)提取3次，每次25min；提取壓力-0.04mpa。

所得提取液減壓濃縮至所用提取溶劑總體積的1/7。然后，利用hp-20大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行富集分離。其中，層析樹(shù)脂柱的徑高比為1∶20，上樣體積為4bv，上樣流速為2bv/h。吸附平衡后以5bv/h的流速用5bv10％(v/v)的乙醇水溶液洗脫去糖，再用8bv60％酸性乙醇水溶液洗脫，收集該洗脫液。

所得洗脫液經(jīng)減壓濃縮，于-45℃冷凍干燥后得神秘果提取物41.37mg。

實(shí)施例2

稱(chēng)取去核神秘果果肉400g，加入質(zhì)量比為1:2的纖維素酶和果膠酶的水溶液，用檸檬酸將該水溶液調(diào)節(jié)至ph2。酶與神秘果果肉用量比為8.0mg/g，進(jìn)行負(fù)壓空化提取。提取用酶水溶液與神秘果果肉的液固比為20ml/g。提取溫度為55℃，連續(xù)提取3次，每次25min；提取壓力-0.06mpa。

所得提取液減壓濃縮至所用提取溶劑總體積的1/5。然后，利用d3520大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行富集分離。其中，層析樹(shù)脂柱的徑高比為1∶20，上樣體積為4bv，上樣流速為2bv/h。吸附平衡后以5bv/h的流速用5bv15％(v/v)的乙醇水溶液洗脫去糖，再用8bv60％酸性乙醇水溶液洗脫，收集該洗脫液。

所得洗脫液經(jīng)減壓濃縮，于-45℃冷凍干燥后得神秘果果實(shí)提取物43.62mg。

實(shí)施例3

稱(chēng)取去核神秘果果肉400g，加入質(zhì)量比為3∶1的纖維素酶和果膠酶的水溶液，用檸檬酸將該水溶液調(diào)節(jié)至ph5.5。酶與神秘果果肉用量比為8.0mg/g，進(jìn)行負(fù)壓空化提取。提取用酶水溶液與神秘果果肉的液固比為5ml/g。提取溫度為20℃，連續(xù)提取3次，每次25min；提取壓力-0.07mpa。

所得提取液減壓濃縮至所用提取溶劑總體積的1/5。然后，利用d3520大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行富集分離。其中，層析樹(shù)脂柱的徑高比為1∶20，上樣體積為4bv，上樣流速為2bv/h。吸附平衡后以5bv/h的流速用5bv20％(v/v)的乙醇水溶液洗脫去糖，再用8bv60％酸性乙醇水溶液洗脫，收集該洗脫液。

所得洗脫液經(jīng)減壓濃縮，于-45℃冷凍干燥后得神秘果果實(shí)提取物42.09mg。

神秘果提取物中的成分分析

采用高效液相色譜法測(cè)定上述目標(biāo)產(chǎn)物中的多酚組成。其中，高效液相色譜(hplc)條件為：

supelco(bellefonte，pa)discoveryc18十八烷基固相萃取柱，柱溫35℃；

waters2690分離器單元；

water996光電二極管檢測(cè)器；

watersmillennium32色譜管理軟件；

流動(dòng)相為乙腈和10％乙酸水溶液的混合液，流速為0.8ml/min，采用梯度洗脫；

檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm和260nm。

根據(jù)標(biāo)樣確定目標(biāo)產(chǎn)物中的組成。

目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)的乙腈和乙酸水梯度分離后的hplc見(jiàn)圖1，由結(jié)果可知神秘果果肉提取物中的主要活性物質(zhì)為：

1、維生素c2、沒(méi)食子酸3、兒茶酸4、表兒茶酸5、鞣花酸6、蘆丁7、楊梅酮8、槲皮素9、山萘酚。

神秘果提取物延緩衰老性能的實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明以秀麗線(xiàn)蟲(chóng)作為研究延緩衰老的動(dòng)物模型，通過(guò)突變基因線(xiàn)蟲(chóng),觀察線(xiàn)蟲(chóng)的存活率和壽命，驗(yàn)證神秘果提取物延緩衰老的信號(hào)通路。

1、延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)

線(xiàn)蟲(chóng)：野生型線(xiàn)蟲(chóng)n2(bristolstrain)，購(gòu)買(mǎi)自上海模式生物科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)材料：由實(shí)施例1-3制得的神秘果提取物；0.1％dmso，上海模式生物科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)在每個(gè)60mm的含有ngm(nematodegrowthmedim)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中放入10條體內(nèi)有蛋的成蟲(chóng)，30min后，將成蟲(chóng)挑出，進(jìn)行同步化，共3個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)溫度為20℃，濕度40～60％。

(2)3天后，將已經(jīng)發(fā)育為成蟲(chóng)的雌雄同體線(xiàn)蟲(chóng)在涂有op50和含有400um5-氟去氧尿苷(5-fluoro-2’-deoxyuridine,fudr,sigma)的ngm培養(yǎng)基上培養(yǎng)，ngm培養(yǎng)基中含有12.5ug/ml(或50um)fudr。

(3)3個(gè)處理組分別為實(shí)施例1～3制備的神秘果提取物，給藥劑量均為10ug/ml，靈芝為陽(yáng)性對(duì)照(0.1mg/ml)，空白對(duì)照不做任何處理，處理組和對(duì)照組各10個(gè)皿，每天記錄死亡蟲(chóng)體的數(shù)目。3天成蟲(chóng)記為壽命的第0天。死亡標(biāo)準(zhǔn)是用金屬絲觸碰線(xiàn)蟲(chóng)，如蟲(chóng)體不動(dòng)則判為死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1根據(jù)本發(fā)明的神秘果提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

由表1可見(jiàn)，在向?qū)嶒?yàn)線(xiàn)蟲(chóng)給予了根據(jù)實(shí)施例1～3制備的神秘果提取物后，處理組的線(xiàn)蟲(chóng)壽命明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明本發(fā)明制備得到的神秘果提取物具有很好的延緩衰老的作用，尤其是根據(jù)實(shí)施例2制備的提取物，效果顯著高于陽(yáng)性藥物(靈芝)。

神秘果提取物濃度對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

參見(jiàn)圖2，根據(jù)實(shí)施例2的神秘果提取物作為受試樣品，以上述方法處理線(xiàn)蟲(chóng)，處理濃度為0.001～0.01mg/ml，處理組和對(duì)照組各10個(gè)皿，同上，每天記錄死亡蟲(chóng)體的數(shù)目。3天成蟲(chóng)記為壽命的第0天。在受試濃度范圍內(nèi)，均有延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的效果。而在0.05mg/ml時(shí)，線(xiàn)蟲(chóng)壽命縮短，可能由于神秘果提取物濃度過(guò)高，超過(guò)其致死濃度所致。

神秘果提取物延緩線(xiàn)蟲(chóng)衰老機(jī)制實(shí)驗(yàn)

線(xiàn)蟲(chóng)：glp-1(e2141)突變體線(xiàn)蟲(chóng)，購(gòu)買(mǎi)自上海模式生物科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)材料：由實(shí)施例2制得的神秘果提取物；0.1％dmso，上海模式生物科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)方法：

液體培養(yǎng)基壽命實(shí)驗(yàn)：將單條線(xiàn)蟲(chóng)挑入含有液體培養(yǎng)基的96孔板的每個(gè)孔中，液體ngm培養(yǎng)基中含有12.5ug/ml(或50um)fudr。分對(duì)照組和處理組，每天記錄死亡蟲(chóng)體的數(shù)目。3天成蟲(chóng)記為壽命的第0天。死亡為金屬絲觸后不動(dòng)。

參見(jiàn)圖3，表示用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的神秘果提取物處理線(xiàn)蟲(chóng)，根據(jù)神秘果提取物濃度對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響實(shí)驗(yàn)，選擇以0.005mg/ml的給藥劑量處理后，線(xiàn)蟲(chóng)壽命與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，表明神秘果提取物延緩線(xiàn)蟲(chóng)衰老的作用是依賴(lài)于生殖細(xì)胞系信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

h2o2應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

將同步化3天的雌雄同體成蟲(chóng)用m9緩沖液沖洗到1.5mlep管中，然后用m9緩沖液洗3遍，除去大腸桿菌op50。將線(xiàn)蟲(chóng)分配在48孔板的孔中，每組線(xiàn)蟲(chóng)分3個(gè)孔，每個(gè)孔不少于30條線(xiàn)蟲(chóng)，h2o2終濃度0.5mm。處理組分別為實(shí)施例1～3制備所得的神秘果提取物，vc為陽(yáng)性對(duì)照，給藥劑量均為10ug/ml?？瞻讓?duì)照組用m9緩沖液補(bǔ)足。死亡的標(biāo)準(zhǔn)以用金屬絲觸碰身體不動(dòng)為準(zhǔn)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組在用h2o2處理線(xiàn)蟲(chóng)22個(gè)小時(shí)后，存活的線(xiàn)蟲(chóng)很少，而用神秘果提取物處理的線(xiàn)蟲(chóng)在22小時(shí)時(shí)，被處理的線(xiàn)蟲(chóng)存活率均高于50％。由此，可說(shuō)明處理組可顯著提高線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)h2o2的耐受力，可顯著增強(qiáng)氧化應(yīng)激能力。

基于上述研究結(jié)果，證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物具有延緩衰老和增強(qiáng)氧化應(yīng)激的作用，可用于制備延緩衰老或增強(qiáng)氧化應(yīng)激的藥物、食品或化妝品。