本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體地涉及mir-1288在診斷或治療骨關節(jié)炎疾病中的應用。
背景技術：
：骨關節(jié)炎(osteoarthritis，oa)是一種以關節(jié)軟骨退變、破壞、消失和關節(jié)周圍骨質增生為主要病變特征的慢性進行性疾病，隨著年齡增加，患病率顯著升高。其主要的臨床表現(xiàn)為：受累關節(jié)的疼痛、腫脹、畸形、活動受限，x線片的主要表現(xiàn)為受累關節(jié)的關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化、周圍骨贅形成。目前oa的發(fā)病機制尚不清楚，比較統(tǒng)一的解釋是，機械力學和生物學因素導致軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨的退化。關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞、ii型膠原、蛋白聚糖和水組成。關節(jié)軟骨沒有血或神經(jīng)分布，軟骨細胞是該組織中僅有的細胞類型。軟骨細胞負責制造軟骨基質的ii型膠原和蛋白聚糖。其后該基質又具有允許用水使基質飽和的物理化學特性。這種結構-功能關系的凈效應是關節(jié)軟骨具有特殊的耐磨特征，并且關節(jié)軟骨面之間發(fā)生幾乎無摩擦的移動。在未患骨關節(jié)炎時，關節(jié)軟骨經(jīng)常在甚至高需求的身體條件下提供終生的無痛承重和無限制的關節(jié)移動?，F(xiàn)有的骨關節(jié)炎治療方法包括運動、藥物、休息和關節(jié)保健、手術、疼痛緩解技術、替代治療和體重控制。由于軟骨組織病變的不可逆性，目前臨床上還未出現(xiàn)一種有效的治療方法。此外，由于骨關節(jié)炎隱匿式發(fā)生并且發(fā)展緩慢，因此骨關節(jié)炎經(jīng)常在疾病發(fā)展的晚期才得到鑒定，而不是潛在治療可能更有效的疾病發(fā)展早期。micrornas(mirnas)是一類長約19-23個核苷酸的內源性非編碼單鏈rna分子，大量的研究表明microrna是一類重要的調控因子，通過與靶基因序列特異性相互作用在轉錄水平調節(jié)基因表達，參與多種生物學過程，進化過程保守。越來越多的研究表明，mirna的表達具有時序特異性和組織特異性。每種mirna針對的數(shù)個甚至上百個潛在靶基因，mirna與risc的復合體通過堿基配對可與靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互補序列相結合，抑制蛋白質翻譯，或是引發(fā)mrna降解，從而負調控靶基因的表達。目前普遍認為mirna的功能是參與生命的一些基本過程如生長發(fā)育、器官形成、造血、細胞增殖與凋亡、應激反應和腫瘤生成等。因此尋找mirnas作為早期診斷骨關節(jié)炎退行性疾病的標志物，對骨關節(jié)炎疾病的診斷和治療具有重要意義。技術實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)骨關節(jié)炎的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預，本發(fā)明的目的之一在于提供mir-1288在制備治療shisa4基因相關疾病的藥物中的應用。本發(fā)明的目的之二在于提供一種治療骨關節(jié)炎的藥物。本發(fā)明的目的之三在于提供一種診斷早期骨關節(jié)炎的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了mir-1288在制備治療shisa4基因相關疾病的藥物中的應用，所述mir-1288包括前體mirna和成熟mirna；所述前體mirna的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述成熟的mirna為mir-1288-5p和mir-1288-3p序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。優(yōu)選地，所述shisa4基因相關疾病是由于shisa4基因表達下調引起的，所述疾病為骨關節(jié)炎，所述mir-1288的靶基因為shisa4。優(yōu)選地，所述mir-1288的核苷酸序列在骨關節(jié)炎組織中表達上調。進一步地，本發(fā)明提供了一種治療骨關節(jié)炎的藥物，所述的藥物包含mir-1288抑制劑。優(yōu)選地，所述mir-1288抑制劑能夠抑制mir-1288的功能，進而促進shisa4基因的表達。優(yōu)選地，所述mir-1288抑制劑是mir-1288的反義寡核苷酸或拮抗劑，所述的mir-1288的反義寡核苷酸序列如seqidno.4所示。優(yōu)選地，所述的藥物能夠促進軟骨細胞的增殖和抑制軟骨細胞的凋亡。本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即可，包括但不限于口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。進一步地，本發(fā)明提供了一種診斷早期骨關節(jié)炎的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測mir-1288的表達水平的試劑。優(yōu)選地，所述的試劑包括特異性擴增mir-1288引物或探針。優(yōu)選地，所述的引物序列包括正向引物序列和反向通用引物，其中正向引物序列如seqidno.5所示。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與骨關節(jié)炎相關的mir-1288，并進一步證實mir-1288在骨關節(jié)炎組織中表達上調。利用mir-1288檢測骨關節(jié)炎不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1rt-pcr驗證骨性關節(jié)炎患者和對照組mir-1288的表達情況；圖2rt-pcr驗證骨性關節(jié)炎患者和對照組shisa4的表達情況；圖3mir-1288抑制劑對oa軟骨細胞中shisa4蛋白表達的影響；圖4mir-1288抑制劑對oa軟骨細胞增殖能力的影響。圖5mir-1288抑制劑對oa軟骨細胞凋亡的影響。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對10例骨性關節(jié)炎樣本及4例對照樣本進行高通量測序，結合生物信息學方法進行差異性表達mirna和mrna的篩選，再進行mirna和mrna關聯(lián)分析，共得到109個mirna-靶基因關系對，挑選了差異表達上調最明顯的mir-1288，其靶標基因為shisa4。現(xiàn)有研究中并沒有mir-1288和骨性關節(jié)炎相關的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學方法驗證，證實了mir-1288在骨性關節(jié)炎組織中表達上調，其相關制劑可用于治療骨性關節(jié)炎。本發(fā)明的shisa4基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：genbank登錄號：ncbigeneid:149345，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用rt-pcr方法檢測上述mir-1288和shisa4在骨關節(jié)炎患者和正常人群中的表達，并驗證了該mirna在骨關節(jié)炎表達上調，其靶基因shisa4在骨關節(jié)炎表達下調。實施例1高通量測序1、取樣取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診骨性關節(jié)炎患者，病例組共收集10例，對照來源于同時期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。獲取所有研究對象的滑液樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。病例組均符合膝關節(jié)oa診斷標準，進行膝關節(jié)人工關節(jié)置換術患者；對照組為半月板損傷及交叉韌帶損傷進行關節(jié)鏡手術治療的患者。根據(jù)1995年美國風濕協(xié)會骨性關節(jié)炎的診斷標準，診斷為重度骨性關節(jié)炎，有膝關節(jié)置換指征的患者病例。其中，臨床診斷標準依據(jù)1995年美國風濕病協(xié)會所制定的標準：(1)1個月內大多數(shù)時間有膝痛；(2)關節(jié)活動時響聲；(3)晨僵不大于30分鐘；(4)年齡不小于40歲；(5)膝關節(jié)骨性腫脹伴彈響；(6)膝關節(jié)骨性腫脹不伴有彈響。最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可診斷oa。2、對滑液進行總rna提取采用reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本rna提取，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把滑液放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入depc處理過的水溶解沉淀；⑥用nanodrop2000紫外分光光度計測量rna純度及濃度，凍存于-80℃。rna質量判定標準：rna樣本的od260/od280值為1.7-2.2之間；總rna電泳圖譜有清晰的28s、18s條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、rna樣品的質量分析rna提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結果可以初步判定提取的rna樣品質量合格與否，是否可以用于進一步的轉錄組分析。進而通過nanodrop1000分光光度計檢測rna樣品的提取情況，rna-seq測序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為illumina公司的hiseq2500高通量測序平臺，進行高通量轉錄組深度測序，測序后我們運用fast-qc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質量進行整體評估，包括堿基的質量值分布，質量值的位置分布，gc含量，pcrduplication含量，kmer的frequency等。在差異mirna及mrna表達分析時，根據(jù)得到的fpkm值，采用國際公認算法ebseq進行差異篩選。其中，篩選時，log2fc>1或<-1，fdr<0.05，共篩選出15個差異表達的mirna，其中表達水平上調的mirna6個，表達水平下調的mirna9個。分析過程中l(wèi)og2fc>1或<-1，fdr<0.05，共篩選出435個差異表達的mrna，其中表達水平上調的基因265個，表達水平下調的基因170個。利用包括rna22，miranda，mirdb，mirwalk，pictar2及targetscan這些算法預測差異表達mirna的靶基因，選取≥4個算法預測出來的靶基因，并在mirwalk數(shù)據(jù)庫查找已驗證的差異表達的mirna的靶基因，然后將所有靶基因與mrna測序結果中與mirna表達負相關的基因進行整合分析，我們共得到109個mirna-靶基因關系對，結合文獻我們篩選了差異表達上調最明顯的mir-1288，通過預測得到mir-1288-靶基因關系對，其靶標基因為shisa4。實施例2rt-pcr驗證骨性關節(jié)炎患者mir-1288和shisa4的表達情況1、材料選取36例骨性關節(jié)炎患者滑液及10例對照滑液，對其進行分組及編號。病例組均符合膝關節(jié)oa診斷標準，進行膝關節(jié)人工關節(jié)置換術患者；對照組為半月板損傷及交叉韌帶損傷進行關節(jié)鏡手術治療的患者。2、方法2.1對滑液進行總rna提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉錄(1)mrna逆轉錄采用iiireversetranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cdna反轉錄，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉錄試劑盒，用逆轉錄緩沖液對lμg總rna進行逆反錄合成cdna。采用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna。獲得的cdna保存放-20℃冰箱備用。(2)mirna逆轉錄使用onestepprimescriptmirnacdnasynthesiskit(takara，codeno.d350a)進行逆轉錄，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：采用20μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板。獲得的cdna保存放-20℃冰箱備用。2.3real-timepcr用abi7500型熒光定量pcr儀，采用2-δδct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。(1)mrna的rt-pcr使用powergreenpcrmastermix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。反應體系如表1所示。表1mrna的rt-pcr反應體系mrnas的表達檢測每次設置3個平行管反應。擴增shisa4(nm_198149.2)正向引物序列如seqidno.5所示，反向引物序列如seqidno.6所示。以gapdh作為內參基因，其上游引物如seqidno.7所示，下游引物如seqidno.8所示。擴增程序為：95℃10min，45x(95℃15s，60℃60s)。(2)mirna的rt-pcr使用sybrprimesciptmirnart-pcrkit(takara，codeno.rr716)進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。表2mirna的rt-pcr反應體系組分加入量sybrpremixextaqii(2×)10μlpcrforwardprimer(10μm)0.5μluni-mirqpcrprimer(10μm)0.5μlroxreferencedyeii(50×)2μl模板(cdna溶液)2μldh2o至20μlmirnas的表達檢測每次設置3個平行管反應。擴增mir-1288正向引物序列如seqidno.9所示，以snrnau6作為內參，其上游引物如seqidno.10所示，下游引物如seqidno.11所示。擴增程序：95℃30s；40x(95℃5s，60℃34s)。3統(tǒng)計學分析實時定量pcr擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產物溶解曲線都是單峰，說明擴增產物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qrt-pcr的相對定量公式：2-δδct×100％，比較mir-1288和shisa4基因在骨關節(jié)炎組織和對照組織中的表達水平。結果顯示：qrt-pcr擴增結果穩(wěn)定，其中mir-1288在骨關節(jié)炎組織表達水平明顯高于對照組，約是對照的3.5倍，具體見圖1，而shisa4在骨關節(jié)炎組織中的表達水平明顯低于正常對照，約為對照的25％，具體見圖2，以上結果驗證了高通量轉錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析的結果。實施例3mir-1288與shisa4靶基因關系驗證1、設計合成針對mir-1288的反義寡核苷酸(anti-mir-1288)根據(jù)mir-1288的序列信息由大連寶生物生物技術有限公司設計合成mir-1288的反義寡核苷酸序列和隨機對照序列，mir-1288的反義寡核苷酸序列如seqidno.4所示。2、細胞培養(yǎng)用含青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)的磷酸鹽緩沖液(petalbovineserum，pbs)沖洗從關節(jié)置換取下的無菌膝關節(jié)軟骨組織置于無菌培養(yǎng)皿數(shù)次后，將軟骨修剪至1mm×1mm×1mm大小；加入3倍體積的0.25％胰蛋白酶于37℃消化30-50分鐘，然后輕輕吹打棄去上清液，d-hanks(百浩生物)液沖洗3-5次；加入3倍體積的0.15％的ii型膠原酶(invitrogen)，37℃下?lián)u蕩消化6小時，每3個小時收一次細胞；200目篩網(wǎng)過濾消化后的細胞懸液，低溫離心5分鐘(約2800轉/分)后再次棄去上清液，dmem/f12(invitrogen)培養(yǎng)液沖洗3次，加入含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細胞懸液分布均勻，從而得到含有軟骨細胞的細胞懸液；將細胞以1×108個/l接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(5ml/瓶)，置于37℃恒溫，5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。培養(yǎng)中使用倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁生長情況和形態(tài)，待細胞貼壁后再第一次換液，以后每2天換液一次。原代培養(yǎng)細胞的覆蓋超過瓶子底部面積的80％時傳代。3、轉染采用陽離子脂質體法進行瞬時轉染，操作按照lipofectaminetm2000transfectionreagent試劑說明書進行。轉染前24h將生長狀態(tài)良好的細胞接種到6孔板中，細胞計數(shù)約5×104，常規(guī)培養(yǎng)至轉染當天，細胞融合度為50-60％時進行試驗。將80nmanti-mir-1288加入到100uldmem培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用100uldmem培養(yǎng)基稀釋2ullipofectamintm2000脂質體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合dmem-脂質體與dmem-mirnas，室溫孵育20min，以形成轉染復合物；然后將上述混合物加到細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使他們充分混合。其中，非特異性序列作為陰性對照(anti-nc)，同期設有空白對照組。培養(yǎng)48h后提取細胞總rna進行下一步實驗。4、anti-mir-1288對于oa軟骨細胞mir-1288表達的作用：細胞總rna提取和pcr步驟同實施例2。real-timepcr結果顯示，陰性對照組對軟骨細胞中mir-1288表達無明顯抑制作用，和空白對照組無統(tǒng)計學差異，轉染的anti-mir1288組對軟骨細胞中mir-1288表達起到一定抑制作用抑制率為59％。5、anti-mir-1288對oa軟骨細胞中shisa4基因表達的影響取對數(shù)期生長細胞，以4×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，按照所述各組進行轉染。并重復3次。48h后收集細胞，裂解細胞并提取細胞總蛋白質，將蛋白加入到10％sds-page進行電泳，再將蛋白轉至pvdf膜上，經(jīng)5％脫脂奶粉封閉后，加入相應的一抗于4℃孵育過夜，anti-shisa4antibody(1∶1000稀釋，abcam，ab167046)。二抗(goatanti-rabbitigg,hrpconjugated(cw0103))室溫孵育1h后，利用ecl液顯影，掃描儀中成像。以β-actin作為內參進行數(shù)據(jù)標準化，與對照組相比，觀察anti-mir-1288組中shisa4蛋白的相對表達水平情況，采用imagej分析軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量,最后得到的數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗統(tǒng)計分析。結果如圖3顯示，將anti-mir-1288轉染至oa軟骨細胞中，48h后提取細胞蛋白質，空白對照為未轉染mirna的軟骨細胞，轉染非特異性序列作為陰性對照。用wb方法檢測靶基因shisa4的蛋白表達水平變化，結果顯示，與空白對照組相比，轉染非特異性序列沒有明顯變化，轉染anti-mir-1288組中shisa4蛋白表達明顯上調(p<0.01)，表明shisa4是anti-mir-1288的靶基因。實施例4mir-1288的抑制劑對oa軟骨細胞增殖能力的影響實驗分組：空白對照組，陰性對照組，轉染anti-mir-1288實驗組。取對數(shù)增殖期細胞配置成1×104/ml單細胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，每組設6個復孔。待細胞貼壁后，加入cck-8試劑，2h后用酶標儀測定其450nm波長吸光度值作為零點。以后連續(xù)5d每過24h，每孔加入cck-8試劑10μl溫育2h后，酶標儀測定細胞吸光度值，并繪制細胞增殖曲線。結果如圖4顯示，與對照組相比較，陰性對照組細胞增殖無顯著差異，而經(jīng)anti-mir-1288轉染后軟骨細胞，其細胞增殖能力顯著上升(p<0.05)。實施例5mir-1288抑制劑對oa軟骨細胞凋亡的影響按照實施例3的方法對軟骨細胞進行anti-mir-1288和anti-nc的轉染。細胞轉染48h后，將細胞用不含edta的胰酶消化收集(注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性)；用pbs洗滌細胞二次(2000rpm離心5min)收集1～5×105細胞；按照annexinv-fitc/pi雙染試劑盒(購自invitrogen公司)的操作說明進行細胞處理。加入500μl的bindingbuffer(凱基，南京)懸浮細胞；加入5μlannexinv-fitc(凱基，南京)混勻后，加入5μlpropidiumiodide(凱基，南京)，混勻；室溫、避光、反應5-15min后進行流式細胞儀的檢測。統(tǒng)計細胞凋亡率，實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss19.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。結果如圖5所示，與轉染anti-nc細胞組相比，轉染anti-mir-1288的細胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院<120>mir-1288在診斷或治療骨關節(jié)炎疾病中的應用<130>16zjp115<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>75<212>rna<213>rna序列<400>1gaggguguugaucagcagaucaggacuguaacucaccauagugguggacugcccugaucu60ggagaccacugccuu75<210>2<211>23<212>rna<213>rna序列<400>2gcagaucaggacuguaacucacc23<210>3<211>21<212>rna<213>rna序列<400>3uggacugcccugaucuggaga21<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<400>4accugacgggacuagaccucu21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcagtcgcatcattggaccc20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6tgtagtgcaaacgagcatctct22<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ggagcgagatccctccaaaat21<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8ggctgttgtcatacttctcatgg23<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9tggactgccctgatctggaga21<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<400>10gtgctcgcttcggcagcacatat23<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11aaaatatggaacgcttcacgaa22當前第1頁12