本發(fā)明關(guān)于冰花(mesembryanthemumcrystallinuml.)愈傷組織萃取物及其應(yīng)用，尤其是關(guān)于使用冰花愈傷組織萃取物以推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌、及/或預(yù)防皮膚癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紫外線(uv)是造成皮膚老化及病變的主要因素之一，其依波長可分為長波紫外線(uva)、中波紫外線(uvb)、及短波紫外線(uvc)。已知，日光中的紫外線有超過90％是uva，其具有很強(qiáng)的穿透力，可穿透皮膚的真皮層而對(duì)皮膚造成傷害，經(jīng)常暴露于uva輻射f下將引起皮膚光老化(photoaging)、活性氧分子(ros)生成、dna破壞、膠原蛋白流失、皮膚松弛等，甚至可能造成皮膚癌。

光老化是指皮膚長期暴露于紫外線輻射下，使得皮膚細(xì)胞加速老化，導(dǎo)致皮膚發(fā)生角質(zhì)增厚、皮膚干燥脫屑、產(chǎn)生細(xì)紋及斑點(diǎn)、皮膚松弛等現(xiàn)象。ros的生成則會(huì)造成細(xì)胞中氧化壓力升高、加速細(xì)胞老化，甚至造成細(xì)胞中細(xì)胞基質(zhì)降解酵素的過度活化，進(jìn)而導(dǎo)致膠原蛋白流失及皮膚松弛。此外，uva也可能破壞細(xì)胞中的dna、造成dna受損，過多受損dna的累積不僅造成細(xì)胞老化，還可能使細(xì)胞癌化進(jìn)而導(dǎo)致皮膚癌。

在皮膚癌中，以黑色素細(xì)胞瘤的致死率為最高。目前，臨床上主要是以手術(shù)切除的方式治療黑色素細(xì)胞瘤，至于無法承受手術(shù)治療的患者，則尚無有效的治療或預(yù)防方法。

有鑒于上述問題，業(yè)界仍亟需可有效推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌及/或預(yù)防皮膚癌的方法。本申請(qǐng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，冰花愈傷組織萃取物可有效降低紫外線對(duì)細(xì)胞所造成的傷害，具有降低皮膚紋理、毛孔、及經(jīng)皮水分散失度的效果，且可有效誘發(fā)黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，從而可用于推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌及/或預(yù)防皮膚癌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的，在于提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于制造護(hù)膚產(chǎn)品的用途，其中該護(hù)膚產(chǎn)品用于以下至少一種：推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、及修補(bǔ)皮膚。較佳地，該護(hù)膚產(chǎn)品用于以下至少一種：抗光老化、抗氧化、及修復(fù)dna，或用于以下至少一種：減緩膠原蛋白分解、減緩膠原蛋白流失、及減少肌膚紋理。

其中，該護(hù)膚產(chǎn)品是以精華液或美容飲品的形式提供。

較佳的，該護(hù)膚產(chǎn)品為精華液且該精華液中的冰花愈傷組織萃取物的濃度為0.01至10重量％。

較佳的，該護(hù)膚產(chǎn)品為美容飲品且該美容飲品中的冰花愈傷組織萃取物的濃度為1至1000ppm。

本發(fā)明的另一個(gè)目的，在于提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于制造藥劑的用途，其中該藥劑用于以下至少一種：治療皮膚癌、預(yù)防皮膚癌，該皮膚癌可以為黑色素細(xì)胞瘤。

其中，該藥劑通過經(jīng)皮或口服的方式施用。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的，在于提供一種用于推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌、及預(yù)防皮膚癌的至少一種方法，其包含對(duì)一個(gè)有需要的個(gè)體施用有效量的冰花愈傷組織萃取物。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1：以dcf-da染劑測(cè)試人類皮膚纖維母細(xì)胞中ros含量的結(jié)果；

圖2：以qrt-pcr(real-timequantitativepolymerasechainreaction)檢測(cè)人類皮膚纖維母細(xì)胞中cat-1及sod2-1基因表現(xiàn)量的結(jié)果；

圖3a至3c：以qrt-pcr檢測(cè)人類皮膚纖維母細(xì)胞中ber相關(guān)基因(包括ung-1、ogg1-1、mpg-1、及ape1-1)、ner相關(guān)基因(包括ercc1-1、ercc6-1、及xpa-1)、及dsb相關(guān)基因(包括xrcc1-1及xrcc5-1)的表現(xiàn)量的結(jié)果；

圖4a及4b：以單細(xì)胞電泳檢測(cè)細(xì)胞的dna受損情形的結(jié)果；

圖5：以qrt-pcr檢測(cè)人類皮膚纖維母細(xì)胞中timp1及col1a1基因表現(xiàn)量的結(jié)果；

圖6a及6b：以mtt檢定法檢測(cè)人類皮膚纖維母細(xì)胞的存活率的結(jié)果；

圖7：以skinanalyzertd膚質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)皮膚紋理的結(jié)果；以及

圖8：以mtt檢定法檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞的存活率的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下將描述根據(jù)本發(fā)明的部分具體實(shí)施例；但是，在不背離本發(fā)明精神下，本發(fā)明可以多種不同形式的實(shí)施例來實(shí)踐，不應(yīng)將本發(fā)明保護(hù)范圍限于說明書所陳述的內(nèi)容。此外，除非文中有另外說明，于本說明書中(尤其是在權(quán)利要求書中)所使用的“一”、“該”及類似用語應(yīng)理解為包含單數(shù)及復(fù)數(shù)形式；所謂“有效量”，是指投予至個(gè)體時(shí)，可有效至少部分改善懷疑個(gè)體的病情的化合物數(shù)量；所謂“個(gè)體”是指人類或非人的哺乳動(dòng)物；所謂“治療”是包括預(yù)防特定疾病或癥狀、減輕特定的疾病或癥狀及/或防止或消除該病癥。

冰花(mesembryanthemumcrystallinuml.)在分類學(xué)上屬于番杏科、松葉菊屬的雙子葉一年生植物。本申請(qǐng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，冰花植株在受傷后所產(chǎn)生的愈傷組織具有類似哺乳類全能干細(xì)胞的特性，該愈傷組織萃取物可有效抗光老化、抗氧化、修復(fù)dna、減緩膠原蛋白分解、減緩膠原蛋白流失、及減少肌膚紋理。

因此，本發(fā)明提供一種使用冰花愈傷組織萃取物于推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、預(yù)防皮膚癌、及/或治療皮膚癌的應(yīng)用。前述應(yīng)用包括：使用冰花愈傷組織萃取物制造一種推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、及/或修補(bǔ)皮膚的護(hù)膚產(chǎn)品；使用冰花愈傷組織萃取物制造一種治療皮膚癌及/或預(yù)防皮膚癌的藥劑；以及使用冰花愈傷組織萃取物以對(duì)有需要的個(gè)體提供推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌、及預(yù)防皮膚癌的至少一種的方法。

本發(fā)明所采用的冰花愈傷組織萃取物，可通過以溶劑萃取冰花愈傷組織而提供。其中，所采用的溶劑可以為極性溶劑，例如醇、水、或其組合。較佳地，該溶劑選自c1-4醇、水、及其組合。舉例言之，可以乙醇進(jìn)行該萃取操作。視需要地，可于超音波震蕩操作下進(jìn)行萃取，以提升萃取效果。較佳地，可以在進(jìn)行萃取之前，先進(jìn)行干燥處理。

于本發(fā)明的部分實(shí)施例中，于進(jìn)行萃取之前，先冷凍干燥冰花愈傷組織。舉例言之，可以100：1(水：經(jīng)冷凍干燥的冰花愈傷組織)的重量比混合水與經(jīng)冷凍干燥的冰花愈傷組織，并于70℃下對(duì)所得到的混合物進(jìn)行超音波震蕩，歷時(shí)45分鐘以完成萃取。或者，可以10：1的重量比混合70％的乙醇與經(jīng)冷凍干燥冰花愈傷組織，并在70℃下對(duì)所得到的該混合物進(jìn)行超音波震蕩，歷時(shí)30分鐘以完成萃取。

該冰花愈傷組織可通過包含如下步驟的操作提供：

i.以6％次氯酸鈉溶液沖洗冰花植株，其后以滅菌水沖洗冰花植株，視需要地，可重復(fù)前述沖洗操作；

ii.在冰花植株的表面上切出傷口，以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織(歷時(shí)1至3個(gè)月)；

iii.在25℃、50％至60％的濕度下，以ms培養(yǎng)基(murashigeandskoogbasalmedium，購自sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)：m5519)培養(yǎng)步驟ii所得的愈傷組織(歷時(shí)1至1.5個(gè)月)。

于本發(fā)明中，冰花愈傷組織萃取物可以萃取所得的萃取原液直接使用，或視需要對(duì)該萃取原液進(jìn)行例如過濾、滅菌、濃縮、稀釋等一個(gè)或多個(gè)步驟，以提升萃取液的使用便利性。舉例言之，通過例如濃縮干固、噴霧干燥、或冷凍干燥等操作，可由萃取液得到方便攜帶或方便儲(chǔ)存的粉末產(chǎn)物。

根據(jù)本發(fā)明所提供的護(hù)膚產(chǎn)品可呈任何合適的形式，并無特殊的限制，視所需要的用途而呈對(duì)應(yīng)的合適形態(tài)。舉例言之，但不以此為限，該護(hù)膚產(chǎn)品可呈供直接外用的乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)等形式?；蛘?，可將本發(fā)明的護(hù)膚產(chǎn)品制備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。此外，也可將本發(fā)明護(hù)膚產(chǎn)品以皮下注射的針劑形式提供。

類似地，根據(jù)本發(fā)明所提供的藥劑可呈任何合適的形式，并無特殊限制，視所需要的用途而呈對(duì)應(yīng)的合適形態(tài)。舉例言之，但不以此為限，該藥劑可以口服或不經(jīng)口服(例如：經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉、腹腔、或鼻腔)的方式施用至有需要的個(gè)體上。其中，視使用形式及用途而定，可選用合適的載劑以提供該醫(yī)藥組合物或藥物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結(jié)合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。

以適于口服的藥劑形式為例，該藥劑中可含有任何不會(huì)不利影響冰花愈傷組織萃取物及/或其活性成分的所需效果的醫(yī)藥上可接受的載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、淀粉、糖膨潤土(sugarbentonite)、及前述的組合?？衫萌魏魏线m的方法，以適于口服的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。

至于適于皮下靜脈內(nèi)、肌肉、或腹腔注射的針劑或點(diǎn)滴劑型，則可于該藥劑中含有一種或多種例如等張溶液、鹽類緩沖液(如磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液)、增溶劑、乳化劑、5％糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、干粉注射劑、懸液注射劑、或干粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑?；蛘?，將該藥劑制備成一種注射前固體，以可溶于其他溶液或懸浮液中的劑型、或可乳化的劑型提供該注射前固體，并于施用至有需要的個(gè)體之前，將該注射前固體溶于其他溶液或懸浮液中或?qū)⑵淙榛?，提供所需要的注射劑?/p>

視需要地，可于根據(jù)本發(fā)明所提供的護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑中另外含有合適用量的添加劑，例如可提高該護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑于服用時(shí)的口適感及視覺感受的調(diào)味劑、調(diào)色劑、著色劑等，以及可改善該護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑的穩(wěn)定性及儲(chǔ)存性的緩沖劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑可根據(jù)需要另外含一種或多種其他活性成分(例如，玻尿酸、杏仁酸、熊果素、膠原蛋白、彈性蛋白等)，或者與含該一種或多種其他活性成分的護(hù)膚產(chǎn)品或藥物并用，以進(jìn)一步加強(qiáng)該護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑的功效或增加制劑配方的運(yùn)用靈活性與調(diào)配度。原則上，只要所添加的其它成分或添加劑不會(huì)對(duì)本發(fā)明護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑的需要功效產(chǎn)生不利的影響即可。

根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所提供的護(hù)膚產(chǎn)品或藥劑可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同頻率施用，視服用個(gè)體的需求、年齡、體重、健康況狀、及施用目的而不同。

當(dāng)施用根據(jù)本發(fā)明所提供的護(hù)膚產(chǎn)品于皮膚表面以推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、及/或修補(bǔ)皮膚時(shí)，可根據(jù)產(chǎn)品形態(tài)而含有不同濃度的冰花愈傷組織萃取物。舉例言之，當(dāng)以精華液的形式提供本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物時(shí)，該精華液中的冰花愈傷組織萃取物的濃度可以為0.01-10重量％(如：1重量％)。而當(dāng)以美容飲品的形式提供本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物時(shí)，該飲品中的冰花愈傷組織萃取物的濃度則可以為1-1000ppm(如：100ppm)。

本發(fā)明也提供一種用于推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、修補(bǔ)皮膚、治療皮膚癌、及預(yù)防皮膚癌的至少一種的方法，其包含對(duì)一個(gè)有需要的個(gè)體施用有效量的冰花愈傷組織萃取物。其中，有關(guān)該冰花愈傷組織萃取物的施用途徑、施用形式、適用劑量、以及相關(guān)治療或預(yù)防的應(yīng)用，均如上述說明。

茲以下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。其中這些實(shí)施例僅提供作為說明，而非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明保護(hù)范圍如權(quán)利要求書所示。

實(shí)施例1：萃取物的制備

將購自中國臺(tái)灣蔬菜之家園藝資材行的冰花種子(商品代碼：00k20)培育成冰花植株，并將該植株分成a、b兩批。其中，對(duì)a批施以如下處理，以提供冰花愈傷組織：

i.以6％次氯酸鈉溶液沖洗冰花植株，其后以滅菌水沖洗冰花植株，視需要地，可重復(fù)前述沖洗操作；

ii.在冰花植株的表面上切出傷口，以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織(歷時(shí)1至3個(gè)月)；

iii.在25℃、50％至60％濕度下，以ms培養(yǎng)基(murashigeandskoogbasalmedium，購自sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)：m5519)培養(yǎng)步驟ii所得的愈傷組織(歷時(shí)1至1.5個(gè)月)。

分別以下列步驟處理上述b批的冰花植株以及由a批冰花植株所得的冰花愈傷組織，以制備冰花植株(ip)萃取物及冰花愈傷組織(ipc)萃取物：

(1)冰花植株(或冰花愈傷組織)置于-22℃下進(jìn)行冷凍干燥，歷時(shí)12小時(shí)；以及

(2)粉碎步驟(1)的經(jīng)干燥的冰花植株(或冰花愈傷組織)，以提供冰花植株粉末(或冰花愈傷組織粉末)。

(3)將70％的乙醇與步驟(2)的冰花植株粉末(或冰花愈傷組織粉末)以10：1(乙醇：粉末)的重量比混合；

(4)在70℃下，對(duì)步驟(3)所獲得的混合物進(jìn)行超音波震蕩，歷時(shí)30分鐘；

(5)以濾膜過濾步驟(4)所得的混合物，以提供一種濾液；

(6)加熱由步驟(5)所獲得的濾液至95℃，并維持20分鐘，以進(jìn)行滅菌；

(7)待步驟(6)的濾液冷卻后，將其冷藏保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

實(shí)施例2：冰花愈傷組織(ipc)萃取物的抗氧化功效

于mem培養(yǎng)基(購自gibco，產(chǎn)品編號(hào)：61100-061)中培養(yǎng)人類皮膚纖維母細(xì)胞(ccd-966sk；購自atcc)，歷時(shí)24小時(shí)，其后，將細(xì)胞分為四組，并進(jìn)行以下處理：

(1)控制組：將細(xì)胞置于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)(即，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含ip萃取物及ipc萃取物的培養(yǎng)液中)。

(2)h2o2組：將細(xì)胞置于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)(即，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含ip萃取物及ipc萃取物的培養(yǎng)液中)，接著，加入h2o2(使其于培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到1毫莫耳濃度)進(jìn)行處理，歷時(shí)1小時(shí)。

(3)h2o2+ip組：將細(xì)胞置于含有2毫克/毫升得自實(shí)施例1的冰花植株(ip)萃取物的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，接著，加入h2o2(使其于培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到1毫莫耳濃度)進(jìn)行處理，歷時(shí)1小時(shí)。

(4)h2o2+ipc組：將細(xì)胞置于含有2毫克/毫升得自實(shí)施例1的冰花愈傷組織(ipc)萃取物的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，接著，加入h2o2(使其于培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到1毫莫耳濃度)進(jìn)行處理，歷時(shí)1小時(shí)。

接著，以dcf-da染劑(購自sigma公司，產(chǎn)品型號(hào)：d6883)處理上述各組細(xì)胞，歷時(shí)15分鐘，其后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度，其中，由于ros可將dcf-da(不具熒光)轉(zhuǎn)變?yōu)閐cf(具有熒光)，故所測(cè)得的熒光強(qiáng)度可代表細(xì)胞中的ros含量，熒光強(qiáng)度越高代表細(xì)胞中的ros含量越高。最后，以控制組的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算其他各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖1(*表示與h2o2組有顯著差異，p<0.05；**表示與h2o2組有顯著差異，p<0.01；#表示與h2o2+ip組有顯著差異，p<0.05)。

由圖1可知，相較于控制組，h2o2組的熒光強(qiáng)度顯著上升。然而，相較于h2o2組，h2o2+ip組與h2o2+ipc組的熒光強(qiáng)度皆明顯下降。此外，相較于h2o2+ip組，h2o2+ipc組的熒光強(qiáng)度明顯更低。前述結(jié)果顯示，冰花愈傷組織(ipc)萃取物可有效抵抗h2o2氧化壓力、降低細(xì)胞中的ros含量，可用于抗氧化，而且所提供的效果明顯優(yōu)于冰花植株(ip)萃取物。

實(shí)施例3：冰花愈傷組織萃取物于推遲皮膚細(xì)胞老化、調(diào)理皮膚、及修補(bǔ)皮膚的效果

(3-1)人類皮膚纖維母細(xì)胞的處理

于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類皮膚纖維母細(xì)胞(ccd-966sk；購自atcc)，歷時(shí)24小時(shí)，其后，將細(xì)胞分為四組，并進(jìn)行以下處理：

(1)控制組：將細(xì)胞置于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)(即，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含冰花愈傷組織萃取物的培養(yǎng)液中)。

(2)uva+6hr組、uva+24hr組、uva+48hr組：分別將細(xì)胞置于含有2毫克/毫升得自實(shí)施例1的冰花愈傷組織萃取物的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)、24小時(shí)、及48小時(shí)。

(3)接著，以u(píng)va照射上述各組細(xì)胞，歷時(shí)1小時(shí)。

(3-2)抗光老化及抗氧化

為進(jìn)一步了解本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物于抗光老化及抗氧化的效果，于完成實(shí)施例3-1之后，進(jìn)行qrt-pcr，以檢測(cè)各組細(xì)胞中cat-1及sod2-1等抗氧化基因的表現(xiàn)量，并以控制組的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算其他組的相對(duì)基因表現(xiàn)量。結(jié)果示于圖2。

由圖2可知，相較于控制組(未經(jīng)冰花愈傷組織萃取物處理)，經(jīng)冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+6hr組uva+24hr組、及uva+48hr組)的抗氧化基因(即，cat-1及sod2-1)表現(xiàn)量皆明顯提升。此結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可提供抗光老化及抗氧化的效果，故可用于推遲皮膚細(xì)胞老化。

(3-3)修復(fù)dna

生物體中具有堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair，ber)、核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair，ner)、雙股斷裂末端接合(double-strandbreakendjoint，dsb)等dna修復(fù)機(jī)制，故可避免因?yàn)閐na突變或斷裂所造成的傷害。

為了解本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物是否可修復(fù)dna，于完成實(shí)施例3-1之后所進(jìn)行的qrt-pcr中，除檢測(cè)各組細(xì)胞中cat-1及sod2-1等抗氧化基因的表現(xiàn)量以外，并檢測(cè)細(xì)胞中有關(guān)ber、ner、及dsb等機(jī)制的基因表現(xiàn)量，后者的結(jié)果示于圖3a至3c(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

由圖3a至3c可知，相較于控制組，經(jīng)冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+6hr組uva+24hr組、及uva+48hr組)的ber相關(guān)基因(包括ung-1、ogg1-1、mpg-1、及ape1-1)、ner相關(guān)基因(包括ercc1-1、ercc6-1、及xpa-1)、及dsb相關(guān)基因(包括xrcc1-1及xrcc5-1)表現(xiàn)量皆明顯提升。前述結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效修復(fù)dna，并借此達(dá)到推遲皮膚細(xì)胞老化的效果。

(3-4)保護(hù)dna

已知，在單細(xì)胞電泳檢測(cè)中，dna受損的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)拖尾的現(xiàn)象，因此，可通過計(jì)算有拖尾現(xiàn)象的細(xì)胞的比例來評(píng)估dna受損程度。

為進(jìn)一步了解本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物是否可保護(hù)細(xì)胞的dna，對(duì)實(shí)施例2的控制組、h2o2組、及h2o2+ipc組三組細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞電泳檢測(cè)。結(jié)果示于圖4a及4b(**p<0.01)。

由圖4a及4b可知，相較于控制組，h2o2組中有拖尾現(xiàn)象(即，dna受損)的細(xì)胞比例明顯較高。然而，相較于h2o2組，h2o2+ipc組中有拖尾現(xiàn)象的細(xì)胞比例則明顯較低。前述結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效保護(hù)細(xì)胞dna，并借此達(dá)到推遲皮膚細(xì)胞老化的效果。

(3-5)減緩膠原蛋白分解及流失

膠原蛋白分解及流失會(huì)加速皮膚老化，其中，已知timp1的基因表現(xiàn)量上升代表膠原蛋白的分解被抑制，col1a1表現(xiàn)上升，代表膠原蛋白表現(xiàn)量增加。為了解本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物是否可減緩皮膚的膠原蛋白分解及流失，于完成實(shí)施例3-1之后所進(jìn)行的qrt-pcr中，也檢測(cè)控制組及uva+24hr組細(xì)胞中timp1及col1a1的表現(xiàn)量，并以控制組作為基準(zhǔn)計(jì)算uva+24hr組的相對(duì)基因表現(xiàn)量。結(jié)果示于圖5(*p<0.05、**p<0.01)。

由圖5可知，相較于控制組，uva+24hr組的timp1及col1a1表現(xiàn)量皆明顯提升。此結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效降低膠原蛋白分解及提升膠原蛋白合成，故可用于減緩膠原蛋白分解及/或流失，達(dá)到調(diào)理皮膚、及修補(bǔ)皮膚的效果。

(3-6)提高人類皮膚纖維母細(xì)胞存活率

于人類皮膚纖維母細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24小時(shí)后，將其分為六組，并進(jìn)行以下處理：

(1)控制組：將細(xì)胞置于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)(即，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含冰花愈傷組織萃取物的培養(yǎng)液中)。

(2)uva組：將細(xì)胞置于mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)(即，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含冰花愈傷組織萃取物的培養(yǎng)液中)，接著，以u(píng)va照射細(xì)胞，歷時(shí)1小時(shí)。

(3)uva+0.75組、uva+1組、uva+1.5組、及uva+2組：分別將細(xì)胞置于含有0.75、1、1.5、及2毫克/毫升由實(shí)施例1獲得的冰花愈傷組織萃取物的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，接著，以u(píng)va照射細(xì)胞，歷時(shí)1小時(shí)。

其后，以mtt檢定法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果示于圖6a及6b(**p<0.01)。由圖6a可知，相較于控制組，uva組的細(xì)胞存活率明顯較低。然而，由圖6b可知，相較于uva組，經(jīng)冰花愈傷組織萃取物處理的組別(包括uva+0.75組、uva+1組、uva+1.5組、及uva+2組)的細(xì)胞存活率皆顯著回升，且冰花愈傷組織萃取物的使用濃度與細(xì)胞存活率成正比。前述結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效降低uva對(duì)細(xì)胞的傷害，且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)正常人類皮膚纖維母細(xì)胞不具毒性。

(3-7)減少肌膚紋理

本實(shí)驗(yàn)采取自身對(duì)照方式進(jìn)行，10位自愿受試者在第0周時(shí)，以skinanalyzertd膚質(zhì)檢測(cè)儀及combo超音波膚質(zhì)分析儀測(cè)試并記錄自身的皮膚紋理、毛孔、及經(jīng)皮水分散失度；接著，每位受試者早晚各一次以精華液(含有1重量％的由實(shí)施例1獲得的冰花愈傷組織萃取物)涂抹半臉，并以安慰劑(即，成分皆與精華液相同，但不含本發(fā)明的冰花愈傷組織萃取物)涂抹另半臉，持續(xù)6周；其后，測(cè)試并記錄使用精華液(含有本發(fā)明的冰花愈傷組織萃取物)或安慰劑6周后的皮膚紋理(即，細(xì)紋)、毛孔、及經(jīng)皮水分散失度。結(jié)果示于表1及圖7。

表1

如表1所示，在使用含有本發(fā)明冰花愈傷組織萃取物的精華液6周后，受試者的皮膚紋理明顯減少、毛孔明顯縮小，且經(jīng)皮水分散失度明顯降低。此外，如圖7顯示，相較于涂抹安慰劑，受試者在涂抹精華液(含有本發(fā)明的冰花愈傷組織萃取物)6周后，眼部周圍的細(xì)紋明顯改善。前述結(jié)果顯示，本發(fā)明的冰花愈傷組織萃取物確實(shí)具有調(diào)理皮膚及修補(bǔ)皮膚的效果。

實(shí)施例4：冰花愈傷組織萃取物于治療及預(yù)防黑色素細(xì)胞瘤的效果

于黑色素瘤細(xì)胞(購自atcc，產(chǎn)品編號(hào)：crl-6475)穩(wěn)定培養(yǎng)24小時(shí)后，將其分為六組，其中一組繼續(xù)培養(yǎng)于不含冰花愈傷組織萃取物的dmem培養(yǎng)基(購自gibco，產(chǎn)品編號(hào)：12100-046)中，歷時(shí)48小時(shí)(此為“控制組”)，其余五組則分別培養(yǎng)于含有由實(shí)施例1獲得的冰花愈傷組織萃取物的dmem培養(yǎng)基中(冰花愈傷組織萃取物于培養(yǎng)基中的最終濃度分別為0.25、0.5、1、2及4毫克/毫升)，歷時(shí)48小時(shí)。接著，以mtt檢定法檢測(cè)各組的存活率，并以控制組的結(jié)果為基準(zhǔn)，計(jì)算其他各組的相對(duì)細(xì)胞存活率。結(jié)果示于圖8(**p<0.01)。

如圖8所示，當(dāng)冰花愈傷組織萃取物的濃度高于0.5毫克/毫升時(shí)，黑色素瘤細(xì)胞的存活率與冰花愈傷組織萃取物的使用濃度呈反比。此結(jié)果顯示，冰花愈傷組織萃取物可有效毒殺黑色素瘤細(xì)胞，故可用于治療及/或預(yù)防皮膚癌。