本發(fā)明涉及納米生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體為一種殺傷癌細胞的納米顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前治療惡性腫瘤的多數(shù)化療藥物不是通過誘導腫瘤細胞凋亡來殺死癌細胞，而是通過競爭性抑制作用抑制各種核苷酸的合成或直接細胞毒性作用，因此有很大的副作用，破壞了機體的免疫平衡。細胞的增殖、凋亡、分化、衰老均是細胞周期依賴性的，因此，選擇能破壞細胞周期并引起凋亡的藥物，以調(diào)節(jié)細胞周期為策略將是今后抗腫瘤治療的新途徑。許多研究已經(jīng)顯示，中藥在誘導腫瘤細胞凋亡、抵抗腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移、誘導腫瘤細胞分化、抑制癌基因的表達、促進抑制癌基因的表達等多個環(huán)節(jié)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，而且許多中藥可以同時作用于上述多個環(huán)節(jié)；但傳統(tǒng)中藥成分復雜，作用機制不夠明確，因此尋找天然、有效、副作用小的抗腫瘤藥物是腫瘤治療中的關(guān)鍵所在。紫草提取物作為植物來源的天然藥物，能有效誘導腫瘤細胞凋亡，是一種潛在的、有效的抗腫瘤藥物。紫草主要的抗癌有效成分為萘醌類色素化合物，即紫草素及其衍生物，尤其以乙酰紫草素（acetylshikonin，as）和β,β?-二甲基丙烯酰紫草素為主要抗癌成分。目前，利用現(xiàn)代工藝提取紫草的有效成分用于腫瘤的治療已經(jīng)取得了很大的進展，可以提高有效成分的含量，降低其毒性。然而，當前紫草提取物仍缺乏對腫瘤的特異性，容易導致疾病區(qū)域劑量不足，并對正常組織造成意想不到的副作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對以上不足之處，提供了一種殺傷癌細胞的納米顆粒及其制備方法，本發(fā)明將乙酰紫草素載入到石墨烯/介孔硅納米復合材料中，并用透明質(zhì)酸進行堵孔，透明質(zhì)酸可以靶向癌細胞，載藥納米粒子通過內(nèi)吞作用進入癌細胞后，癌細胞內(nèi)過量表達的透明質(zhì)酸酶可以降解透明質(zhì)酸，釋放紫草素殺死癌細胞。同時，在近紅外光的照射下可實現(xiàn)癌癥的化療/光熱協(xié)同治療。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的有益效果是：

將納米技術(shù)用于其有效成分的輸送，利用腫瘤部位過量表達的酶來操控藥物釋放，可以很好地解決當前紫草提取物缺乏對腫瘤的特異性，容易導致疾病區(qū)域劑量不足，對正常組織造成意想不到的副作用的問題。

類三明治結(jié)構(gòu)的石墨烯/介孔硅納米片層（gs）成為一種新型的藥物載體，它具有優(yōu)異的生物兼容性、親水性及分散性，能將石墨烯的光熱功能與介孔硅的大孔徑結(jié)合起來。gs的介孔中可以裝載藥物，并且可用響應(yīng)靶向位點微環(huán)境的可降解分子進行封裝堵孔。利用這種方式，可以構(gòu)建一種“按需”的藥物遞送平臺。透明質(zhì)酸（ha）是一種生物可降解且無毒的細胞外基質(zhì)的組分，已被廣泛應(yīng)用于癌癥治療的靶向和包裹試劑。它能特異性的與cd44受體結(jié)合，并且可被透明質(zhì)酸酶降解，而cd44和透明質(zhì)酸酶在各種癌細胞中均過量表達。

附圖說明

圖1是石墨烯/介孔硅納米復合材料典型掃描電子顯微鏡（a）和透射電子顯微鏡（b）圖像；

圖2是hela細胞在用gs@ha（a）、gs@ha-as（b）、gs@ha+nir（c）及gs@ha-as+nir（d）處理后的熒光顯微鏡圖片,活細胞用calceinam染色，呈現(xiàn)綠色，死細胞用pi染色，呈現(xiàn)紅色;

圖3是hela細胞用不同方式處理后細胞活力圖。

具體實施方式

實施例1

（1）石墨烯/介孔硅納米復合材料的制備：先50mg氧化石墨烯加入到50ml含有0.5克ctab及20mg氫氧化鈉的水溶液中，超聲分散1小時；然后將上述溶液在40℃下攪拌2小時；接著加入500μlteos繼續(xù)反應(yīng)12小時。所得產(chǎn)物離心收集并用20ml熱無水乙醇清洗三遍；然后將產(chǎn)物分散于50ml丙酮中，在40℃下攪拌24小時脫去ctab模板；得到的產(chǎn)物分別用乙醇和去離子水清洗，分散于10ml去離子水中備用，此即為石墨烯/介孔硅納米粒子。

（2）將上步得到的20mg石墨烯/介孔硅納米粒子和20mg乙酰紫草素（本課題組用高速逆流色譜純化制備，相關(guān)論文已經(jīng)發(fā)表）溶解于pbs緩沖液中（10mm，ph7.4），攪拌24小時；然后在12000rpm下離心收集沉淀物，重復以上步驟三次，收集到的沉淀物即為載入乙酰紫草素的石墨烯/介孔硅納米粒子。

（3）將100mgha中加入50mgedc和30mgnhs，在mes緩沖液（ph5.5）中活化2小時，然后將載入乙酰紫草素的石墨烯/介孔硅納米粒子與之混合，繼續(xù)攪拌6小時；然后將得到的產(chǎn)物用pbs洗滌3次，即得到本發(fā)明的最終產(chǎn)物一種殺傷癌細胞的納米顆粒。

癌細胞死亡成像，如圖2所示

將hela細胞置于含10%的胎牛血清、100μg/ml青霉素和鏈霉素的dmem細胞培養(yǎng)基中，在含有5%co2的細胞培養(yǎng)箱中于37°c下培養(yǎng)；然后用共染色熒光指示劑來區(qū)分活細胞和死細胞，可視化細胞死亡。將hela細胞在100μl的rpmi細胞培養(yǎng)基中以每孔1×10⁴個細胞的密度在24孔板中培養(yǎng)24小時。細胞洗滌后，將納米粒子包裹透明質(zhì)酸的石墨烯/介孔硅（gs@ha）和載入乙酰紫草素的石墨烯/介孔硅納米粒子（gs@ha-as）（gs濃度為200μg/ml）加入孔中共孵育2小時。對于光熱組，用808nm激光器以6w/cm²的強度照射5分鐘。更換新鮮的dmem細胞培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)12小時。最后，細胞用活-死細胞染色，活細胞用calceinam染色，呈現(xiàn)綠色，死細胞用碘化丙啶（pi）染色，呈現(xiàn)紅色，得到的結(jié)果如圖2所示，從圖中我們可以看出：載入乙酰紫草素的納米粒子或近紅外光照都有一定的殺死癌細胞的能力，而當兩者共同作用時具有最高的細胞死亡率。

體外癌細胞殺傷實驗（如圖3所示）

用mtt法來測定不同處理方式下癌細胞的存活率。將密度為1×10⁵細胞/孔的hela細胞置于96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后，將納米粒子gs@ha和gs@ha-as（gs濃度為200μg/ml）加入孔中共孵育2小時。光熱實驗組用808nm激光器以6w/cm2強度照射5分鐘。將上層培養(yǎng)基移除并用pbs溶液洗滌3次，加入新鮮的dmem培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。加入10μlmtt（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時。最后，小心吸去上清液，每孔加入100μldmso在搖床上輕輕搖動。通過記錄在570nm處的光吸收值計算細胞的活力。細胞生長的相對活性計算公式為：%=(1-[od]test/[od]control)×100，結(jié)果如圖3所示。從圖中我們可以看到，納米粒子本身對癌細胞的毒性很小，納米粒子濃度為400μg/ml時，hela細胞仍保持了94%的存活率。該載藥體系可以實現(xiàn)化療/光熱協(xié)同治療，100μg/mlgs@ha-as細胞存活率為80.6%，nir光照100μg/mlgs@ha時細胞存活率為30.6%，而nir光照100μg/mlgs@ha-as納米粒子時，只有25.6%細胞可以存活。

當然，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。