本發(fā)明涉及來自植物活性物質(zhì)的提取方法及應用領域，具體涉及圓齒野鴉椿提取物在制備抗肝癌藥物中的應用。
背景技術(shù)：
圓齒野鴉椿（Euscaphis Konishii Hayata，又名福建野鴉椿）為省沽油科野鴉椿屬（Euscaphis）植物，別名雞肫子、雞眼睛、狗頭椒。根據(jù)《中國植物志》的記載，我國有2 種省沽油科野鴉椿屬植物，為野鴉椿[Euscaphis japonica (Thunb.) Dippel]和福建野鴉椿（圓齒野鴉椿）。
野鴉椿是我國民間一種傳統(tǒng)的中草藥，已經(jīng)有良好的藥用基礎及悠久的歷史，主要治療胃痛、跌打損傷、風濕疼痛、眩暈、瀉疾、痢疾?，F(xiàn)代藥理研究表明，野鴉椿具有抗炎、抗菌、抗肝纖維化和抗細胞增殖作用。2009年8月《時珍國醫(yī)國藥》發(fā)表了李先輝等《野鴉椿提取物抗炎鎮(zhèn)痛效應的研究》；2013年15期《當代醫(yī)學》發(fā)表了劉迪棟等《野鴉椿水提物對大鼠慢性肝纖維化的影響》；2007年LEE MK等在《Planta Medica》上發(fā)表了《Inhibitory constituents of Euscaphis japonica on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglia》，從野鴉椿地上部分用無水甲醇提取得到的三萜化合物，能夠顯著抑制肝星形狀細胞（HSC）的增殖；2009年LEE MK等又在《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal》上又發(fā)表了《Antifibrotic activity of triterpenoids from the aerial parts of Euscaphis japonica on hepatic stellate cells》，發(fā)現(xiàn)野鴉椿中的三萜化合物具有抗肝纖維化作用；2008年《癌變? 畸變? 突變》發(fā)表了左敏等《野鴉椿對HeLa細胞的抗增殖作用及其機制的初步研究》；2010年《Journal of Natural Products》發(fā)表了CHENG J J等《Cytotoxic Hexacyclic Triterpene Acids from Euscaphis japonica》從野鴉椿分離出來的六環(huán)三萜化合物有明顯的細胞毒作用。圓齒野鴉椿目前主要用于觀賞植物，對其藥用價值的研究不多。
肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴峻的形勢對國人的健康和社會經(jīng)濟帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。流行病學研究表明，肝癌的發(fā)生發(fā)展多由遺傳和環(huán)境因素相互作用，是一個多誘因、多基因參與、多步驟調(diào)控的復雜過程。目前普遍觀點認為腫瘤是慢性炎癥消退失敗的結(jié)果，而肝癌與慢性肝炎密切相關。當前肝癌的治療主要有根治性切除和藥物介入等手段。根治性切除術(shù)后，早期肝癌患者5年生存率顯著延長，但復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是肝癌根治術(shù)的主要問題。藥物介入目前有靶向治療和抗病毒治療。靶向治療主要通過酪氨酸激酶抑制劑（如索拉菲尼Sorafenib等），抑制肝細胞表面表皮生長因子受體EGFR及其下游信號通路蛋白表達，從而抑制腫瘤細胞生長和血管生成，能顯著抑制術(shù)后腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，然而該類藥物價格昂貴且服用一段時期后可引起耐藥；而抗病毒治療多以干擾素及核苷類藥物為主，干擾素能夠抑制病毒復制，但難以清除病毒，核苷類藥物可抑制HBV-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶活性，但同樣容易產(chǎn)生耐藥性，停藥后易產(chǎn)生“反跳”現(xiàn)象，治療效果有限。因此，提供圓齒野鴉椿制備抗肝癌藥物的用途具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供圓齒野鴉椿在制藥中的新用途。
上述新用途具體是，圓齒野鴉椿提取物在制備抗肝癌藥物中的應用。
上述應用中，所述的圓齒野鴉椿提取物是以圓齒野鴉椿為原料的醇提物及其進一步的提取物，可采用本領域常用的方法提取得到。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
取圓齒野鴉椿植物體，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。取植物體粉末，加5-20倍體積濃度為10%-95%的乙醇加熱至50-95℃回流提取兩次，每一次提取1-3小時，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿醇提物。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明的圓齒野鴉椿提取物，對人肝癌細胞HepG2和BEL-7404具有明顯的抑制作用，并對小鼠肝癌H22移植瘤模型具有顯著的腫瘤抑制作用，可用于制備抗肝癌藥物。
具體實施方式
為進一步公開而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
下述實驗用圓齒野鴉椿（Euscaphis Konishii）來源于福建省邵武市天成巖。
實施例1
取干燥的圓齒野鴉椿果皮，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍體積濃度為95%的乙醇加熱至80℃回流提取兩次，每一次提取2小時，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿果皮醇提物。
實施例2
取干燥的圓齒野鴉椿枝條，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍體積濃度為95%的乙醇加熱至80℃回流提取兩次，每一次提取2小時，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿枝條醇提物。
實施例3
取干燥的圓齒野鴉椿葉片，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍體積濃度為95%的乙醇加熱至80℃回流提取兩次，每一次提取2小時，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿葉片醇提物。
實施例4
取干燥的圓齒野鴉椿種子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加10倍體積濃度為95%的乙醇加熱至80℃回流提取兩次，每一次提取2小時，合并提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，干燥，得圓齒野鴉椿種子醇提物。
采用人肝癌細胞HepG2和BEL-7404，研究圓齒野鴉椿提取物的體外抗肝癌效果。具體實驗方法如下：
人肝癌細胞HepG2和BEL-7404培養(yǎng)條件為含有胎牛血清（GIBOCO,體積分數(shù)為10%）、青霉素（Thermo Fisher,1×105 IU?L-1）和鏈霉素（Thermo Fisher,100 mg?L-1）的DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher)，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。在96孔培養(yǎng)板上接種細胞，接種量為5×103個細胞/孔，每孔180μL，實驗組分別加入不同濃度的藥物，對照組不加藥，另設空白孔組（只加培養(yǎng)基，無細胞），每組設3個平行孔，37℃培養(yǎng)至所需的時間，加入5 g?L-1的MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150μL DMSO溶解，培養(yǎng)箱孵育20 min后，用酶標儀（Thermo公司）在570 nm波長下測吸光度值（OD值）。根據(jù)吸光度計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（OD對照-OD實驗）/(OD對照-OD空白)×100%。
以同一藥物的不同濃度對細胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥的半數(shù)抑制濃度IC50，即細胞存活率減少50%時的藥物濃度。實驗數(shù)據(jù)以 ±S（均數(shù) ± 標準差）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，以P<0.05時，判斷組間差異具有統(tǒng)計學意義。
實驗結(jié)果如下表所示。
上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述圓齒野鴉椿各提取物對肝癌細胞HepG2和BEL7404均有明顯的增殖抑制作用，其中果皮提取物的抑制作用最為明顯。
采用H22小鼠肝癌移植瘤模型來考察圓齒野鴉椿提取物的體內(nèi)抗腫瘤效果。具體實驗方法如下所述。
普通級昆明種小鼠，體重18-22g,，均為雄性小鼠，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。H22細胞培養(yǎng)條件為含有胎牛血清（GIBOCO，體積分數(shù)為10%）、青霉素（Thermo Fisher,1×105 IU?L-1）和鏈霉素（Thermo Fisher,100 mg?L-1）的1640培養(yǎng)液(Thermo Fisher)，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。取2-3只小鼠腹腔注射H22細胞1×107個?mL-1，在腹腔傳代6~8d。取生長良好的乳白色腹水，用生理鹽水稀釋至1×107個?mL-1。將其余小白鼠隨機分組，每組6只，以0.2ml接種于小鼠右腋皮下，構(gòu)建小鼠肝癌H22移植瘤模型，于接種24h后開始灌胃給藥。圓齒野鴉椿各提取物濃度為200mg?Kg-1, 用生理鹽水配成混懸液進行給藥，對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予5-氟尿嘧啶（5-Fu）20 mg?Kg-1，每天一次，連續(xù)14d，于第15d稱體重，頸椎脫臼處死動物。剝離腫瘤組織，用濾紙吸干后稱重。計算腫瘤抑瘤率。
抑瘤率=（1-實驗組瘤重/對照組瘤重）×100%
實驗數(shù)據(jù)以±s（均數(shù) ± 標準差）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，以P<0.05時，判斷組間差異具有統(tǒng)計學意義。
實驗結(jié)果如下表所示。
上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述各提取物對H22小鼠肝癌移植瘤模型有明顯的抑制作用，且果皮提取物對H22小鼠肝癌移植瘤模型的抑制效果最為明顯。各提取物均可用于制備抗肝癌的治療和預防藥物。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。