本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄籽發(fā)酵原漿化妝品及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄籽中多種成分具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值。葡萄籽中含有豐富的水蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、脂肪、碳水化合物和膳食纖維等多種營(yíng)養(yǎng)素。此外，還含有多種功能性成分，包括原花青素、葡萄籽油、白藜蘆醇、維生素E、單寧等，這些成分均具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和美容保健作用。葡萄籽中的多酚類天然抗氧化劑無(wú)論是含量還是種類都比葡萄皮和葡萄果肉豐富得多，籽中的這些多酚類物質(zhì)表現(xiàn)出了極強(qiáng)的抗氧化能力。將葡萄籽進(jìn)行發(fā)酵并加以應(yīng)用，可充分發(fā)揮葡萄籽中功能性成分的美容功效，生物利用率高。

植物活性成分因其高的安全性和功能活性，已明顯地滲入到食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。因此，利用各種提取技術(shù)從植物中提取具有高活性的成分已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的提取技術(shù)包括有機(jī)溶劑提取法、熱水提取法、系統(tǒng)溶劑提取法等，但這些方法產(chǎn)品安全性低、耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低。安全性高、提取率高和環(huán)保的的新型提取方法越來(lái)越備受人們關(guān)注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的多種酶，從而對(duì)植物中的活性成分進(jìn)行提取和修飾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種葡萄籽發(fā)酵原漿的制備方法。

本發(fā)明所提供的葡萄籽發(fā)酵原漿的制備方法，包括如下步驟：將葡萄籽干粉、水和菌液混合得到初始體系，對(duì)所述初始體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到葡萄籽發(fā)酵原漿。

上述制備方法中，所述葡萄籽干粉通過(guò)將新鮮葡萄籽烘干粉碎得到，粒徑可為30～40目，具體可為40目。

所述菌液中，菌種為乳酸乳球菌，具體可為乳桿菌，具體可為德氏乳桿菌，更具體可為德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus delbrueckii bulgaricus。

所述菌液濃度可為(10⁵～10⁸)CFU/mL。

所述菌液的pH值可為6.5～7.5，具體可為7.0

所述初始體系中，所述菌液、葡萄籽干粉和水的配比可為(5～8mL)：(20～25)g：300mL，具體可為6mL：22g：300mL。

所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度可為40～50℃，具體可為45℃；時(shí)間可為30～45h，具體可為36h。

上述制備方法還包括對(duì)所述發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液依次進(jìn)行滅菌、離心、取上清液得到葡萄籽發(fā)酵原漿的步驟。

所述滅菌的條件如下：滅菌溫度可為115～121℃，具體可為115℃；滅菌時(shí)間可為25～35min，具體可為30min。

所述離心的條件如下：離心轉(zhuǎn)速可為3800～4200r/min，具體可為4000r/min；離心時(shí)間可為10～15min，具體可為10min；離心半徑可為9cm。

上述方法制備得到的葡萄籽發(fā)酵原漿也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述葡萄籽發(fā)酵原漿在制備具有下述1)-4)中至少一種功能的化妝品中的應(yīng)用或在直接作為具有下述1)-4)中至少一種功能的化妝品中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)：

1)清除DPPH自由基；

2)刺激膠原蛋白產(chǎn)生；

3)抗氧化；

4)抗衰老。

上述應(yīng)用中，所述化妝品包括但不限于：面膜、精華液或爽膚水。

本發(fā)明方法利用發(fā)酵工程技術(shù)從葡萄籽中提取活性物質(zhì)，操作簡(jiǎn)單，且由于不添加任何外來(lái)物質(zhì)，制備得到的葡萄籽發(fā)酵物即葡萄籽發(fā)酵原漿對(duì)皮膚安全無(wú)傷害，具有更高的抗衰老活性。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的葡萄籽發(fā)酵物(即葡萄籽發(fā)酵原漿)的制備方法采用發(fā)酵工程技術(shù)，通過(guò)選擇合適的菌種及發(fā)酵條件，從葡萄籽中提取得到活性物質(zhì)。一方面，可最大程度保留植物中的活性成分，且相對(duì)于傳統(tǒng)的水提法，避免了有機(jī)溶劑的引入，安全環(huán)保；另一方面，不需要添加酶等外來(lái)物質(zhì)，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本，而且最大化的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，使該發(fā)酵技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)大量生產(chǎn)、工業(yè)化生產(chǎn)，并能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

(2)本發(fā)明提供的葡萄籽發(fā)酵原漿含有健康皮膚不可或缺的氨基酸、礦物質(zhì)等自然成分，且由于在制備過(guò)程中未引入外來(lái)物質(zhì)，不含任何化學(xué)成分，可以直接作為面膜或精華液或爽膚水的成品使用，比現(xiàn)有市面上的其他產(chǎn)品更加天然，不會(huì)給肌膚造成任何負(fù)作用。

(3)本發(fā)明提供的葡萄籽發(fā)酵原漿，具有較強(qiáng)的抗氧化能力可清除DPPH自由 基、促進(jìn)膠原蛋白生成，提高機(jī)體生命力，從而延緩細(xì)胞老化，具有抗衰老的功效。

附圖說(shuō)明

圖1為葡萄籽發(fā)酵原漿對(duì)DPPH自由基清除率的關(guān)系曲線。

圖2為葡萄籽發(fā)酵原漿促進(jìn)膠原蛋白合成的關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的液體培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在液體培養(yǎng)基中的濃度為：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH值為7.0。

下述實(shí)施例中的YPD培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在液體培養(yǎng)基中的濃度為：酵母提取物1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，胰蛋白胨2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，葡萄糖2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，pH值為7.0。

下述實(shí)施例中的葡萄籽干粉來(lái)自市面銷售，40目。

下述實(shí)施例中的德氏乳桿菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus delbrueckii bulgaricus。

下述實(shí)施例中的菌液按照如下步驟制得：

1、菌種的活化

挑取德氏乳桿菌菌落一環(huán)于液體培養(yǎng)基中，放入搖床中將菌種活化，得到活化后的德氏乳桿菌。

2、菌種的純化

將步驟1得到的活化后的菌液梯度稀釋鋪板，以便獲取單菌落，得到純化后乳桿菌。

3、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將步驟2得到的純化后的菌種接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基(pH值為7.0)中，在25℃的搖床中培養(yǎng)，當(dāng)OD值＝0.5-1.0時(shí)，得到發(fā)酵菌菌液(菌種處在對(duì)數(shù)期，濃度為10⁵～10⁸CFU/mL)。

實(shí)施例1、制備葡萄籽發(fā)酵原漿

按照如下步驟制備葡萄籽發(fā)酵原漿：

(1)將6mL步驟3得到的濃度為10⁵～10⁸CFU/mL的發(fā)酵菌菌液接種到22g的葡萄籽干粉和300mL的水中，得到發(fā)酵體系；

(2)將上述發(fā)酵體系在45℃搖床中發(fā)酵36小時(shí)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

(3)將上述發(fā)酵產(chǎn)物115℃下滅菌30min，使菌失活，得到滅菌后的發(fā)酵產(chǎn)物； 將滅菌后的發(fā)酵產(chǎn)物在4000r/min，離心半徑為9cm的條件下離心10min，棄沉淀，收集上清液，即為葡萄籽發(fā)酵原漿。

實(shí)施例2、葡萄籽發(fā)酵原漿在作為化妝品中的應(yīng)用

一、葡萄籽發(fā)酵原漿的性質(zhì)

將實(shí)施例1所制備所得的發(fā)酵原漿經(jīng)活性炭脫色、去味。其外觀為粘稠液體、顏色為淡黃色至棕黃色。pH值6.2-7.0，粘度190-230cP，可溶性固含物含量3.0-3.5％，菌落總數(shù)小于50CFU/mL，無(wú)致病菌檢出。根據(jù)化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB7916-87，化妝品細(xì)菌總數(shù)不高于1000CFU/ml，所以此發(fā)酵原漿符合化妝品質(zhì)量要求。

對(duì)該葡萄籽發(fā)酵原漿進(jìn)行成分分析，粗多糖檢測(cè)方法參照GB/T 5009.8-2008；黃酮檢測(cè)方法參照GB/T 5009.124-2003，蛋白質(zhì)檢測(cè)方法參照GB5009.5-2010，原花青素檢測(cè)方法參照GB/T 22244-2008，所得結(jié)果如下：

本發(fā)明制得的葡萄籽發(fā)酵原漿含粗多糖2.48g/kg、總黃酮17.36g/kg、總蛋白7.73g/kg、原花青素1.39g/kg。

二、葡萄籽發(fā)酵原漿的安全性檢測(cè)

人體斑貼試驗(yàn)主要是用于檢測(cè)化妝品終產(chǎn)品或原料的刺激性。本發(fā)明對(duì)實(shí)施例1中獲得的葡萄籽發(fā)酵原漿進(jìn)行人體封閉式斑貼試驗(yàn)，旨在對(duì)其潛在皮膚刺激性進(jìn)行評(píng)估。

1、試驗(yàn)對(duì)象

選擇合適的志愿者30人，年齡范圍在18-60歲隨機(jī)選擇。

2、試驗(yàn)方法

稱取0.020g-0.025g固體樣品或半固體的樣品放入斑試器中備用。將液體樣品0.2mL到0.025mL滴加在濾紙片上，再將濾紙片置于斑試器內(nèi)。每個(gè)樣品均設(shè)置空白對(duì)照，在對(duì)照斑試器孔內(nèi)加入與樣品等量的樣品溶劑，如蒸餾水或橄欖油(本實(shí)施例采用蒸餾水)。

試驗(yàn)部位選為人體背部，利用無(wú)刺激性的膠帶將斑試器固定貼敷于受試者背部。測(cè)試周期持續(xù)24h。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可信和科學(xué)，在測(cè)試期間志愿者按照要求，不能摘掉斑試器，亦不可使受試部位接觸水。24h后去除斑試器，靜置30min后，等待壓痕消失，觀察皮膚的反應(yīng)。如果試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則需要在斑貼試驗(yàn)后24h和48h分別再觀察一次。

3、試驗(yàn)結(jié)果

斑貼試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表1中各符號(hào)表示的含義如下："-"＝陰性反應(yīng)；"±"＝可疑反應(yīng)：僅有微弱紅斑；"+"＝弱陽(yáng)性反應(yīng)(紅斑反應(yīng))：紅斑、浸潤(rùn)、水腫、可有 丘疹；"++"＝強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(皰疹反應(yīng))；紅斑、浸潤(rùn)、水腫、丘疹、皰疹；反應(yīng)可超出受試區(qū)；"+++"＝極強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(融合性皰疹反應(yīng))；明顯紅斑、嚴(yán)重浸潤(rùn)、水腫、融合性皰疹；反應(yīng)超出受試區(qū)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)化妝品衛(wèi)生規(guī)范2007，30例受試者中出現(xiàn)1級(jí)皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于5例，或出現(xiàn)二級(jí)皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于2例，或出現(xiàn)任何1例三級(jí)或三級(jí)以上皮膚不良反應(yīng)時(shí)，則判定受試物對(duì)人體有不良反應(yīng)，反之，則視為對(duì)人體無(wú)不良反應(yīng)。

表1、實(shí)施例1獲得的葡萄籽發(fā)酵原漿的斑貼試驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出：實(shí)施例1得到的葡萄籽發(fā)酵原漿產(chǎn)生2例可疑反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明提供的葡萄籽發(fā)酵原漿均具有安全性，不會(huì)給人體帶來(lái)不良反應(yīng)。

三、葡萄籽發(fā)酵原漿的抗氧化性能檢測(cè)

DPPH是一種早期合成的有機(jī)自由基，常用來(lái)評(píng)估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，而且在517nm處有一個(gè)特征吸收峰，當(dāng)遇到自由基清除劑時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)而使其退色，也就是在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值變小。因此，可通過(guò)測(cè)定吸光值的變化來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果。

取不同量的實(shí)施例1制備得到的葡萄籽發(fā)酵原漿溶于去離子水中，制得體積百分濃度為0.63％、1.25％、2.5％、5％和10％的一系列葡萄籽發(fā)酵原漿待測(cè)液。

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)步驟為：

(1)取等體積(一般為3mL)的待測(cè)液與2×10^-4mol/L的DPPH溶液混勻(A₁管)；

(2)取等體積的無(wú)水乙醇(待測(cè)物溶劑)與2×10^-4mol/L的DPPH溶液混勻(A₂管)；

(3)取等體積的無(wú)水乙醇與待測(cè)液混勻(A₃管)；

(4)反應(yīng)30min后，在517nm下測(cè)A₁、A₂、A₃管吸光度值。

清除率計(jì)算公式為：清除率(％)＝[(A₂+A₃)-A₁]/A₂ (1)

以葡萄籽發(fā)酵原漿待測(cè)液的體積百分濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，制作葡萄籽發(fā)酵原漿對(duì)DPPH自由基清除作用曲線，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，實(shí)施例1所得葡萄籽發(fā)酵原漿在稀釋10倍后對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)105.16％，0.1％(體積百分濃度)的葡萄籽發(fā)酵原漿可清除50％的DPPH自由基。，說(shuō)明葡萄籽發(fā)酵原漿具有很強(qiáng)的抗氧化能力可清除自由基，促進(jìn)細(xì)胞代謝，增強(qiáng)細(xì)胞活力，改善機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能，提高機(jī)體生命力，從而延緩細(xì)胞老化，發(fā)揮其抗衰老的作用。

四、葡萄籽發(fā)酵原漿刺激膠原蛋白生成

膠原蛋白是人體皮膚的主要成分，起到支撐器官，保護(hù)機(jī)體的功能。同時(shí)膠原蛋白是維持皮膚與肌肉彈性的主要成分，隨著年齡的增長(zhǎng)、紫外線照射等內(nèi)外因素，膠原蛋白的合成能力下降，皮膚的膠原蛋白含量每年以平均1％的速度遞減，一旦膠原蛋白缺乏，膠原纖維就會(huì)發(fā)生交聯(lián)固化，使細(xì)胞間粘多糖減少，膠原蛋白與彈力蛋白交互構(gòu)成有規(guī)則的網(wǎng)目結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸崩解，同時(shí)可導(dǎo)致真皮的纖維斷裂，脂肪萎縮，汗腺及皮脂腺分泌減少，皮膚便會(huì)失去彈性并變薄老化，使皮膚出現(xiàn)色斑、皺紋、皺裂等一系列老化現(xiàn)象。通過(guò)檢測(cè)葡萄籽發(fā)酵原漿作用對(duì)膠原蛋白合成的影響。

采用0.22um濾膜對(duì)葡萄籽發(fā)酵原漿進(jìn)行過(guò)濾，使用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基將樣品稀釋為0.06％、0.53％和5％(體積百分濃度)，作用于成纖維細(xì)胞24h后，取上清液。膠原蛋白含量具體檢測(cè)方法參照南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的人Ⅰ型膠原(COLⅠ)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

以葡萄籽發(fā)酵原漿濃度為橫坐標(biāo)，膠原蛋白濃度為縱坐標(biāo)，制作葡萄籽發(fā)酵原漿對(duì)膠原蛋白合成作用柱狀圖。見(jiàn)圖2。

由圖2可知，實(shí)施例1獲得的葛根發(fā)酵原漿對(duì)膠原蛋白合成有促進(jìn)作用。1％和5％濃度的葡萄籽發(fā)酵原漿作用下，膠原蛋白濃度分別為11.14ng/ml,14.92ng/ml,，均高于未加葡萄籽發(fā)酵原漿的對(duì)照組。因此，葡萄籽發(fā)酵原漿有促進(jìn)膠原蛋白合成，從而起到減緩皮膚衰老的功效。