本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取技術(shù)及化妝用品領(lǐng)域，尤其涉及厚皮樹提取物及其制備方法、及其在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、生存環(huán)境的改善，人們對提高生命質(zhì)量越來越重視，延緩衰老、健康長壽成為普遍而迫切的社會需求。然而人體衰老的現(xiàn)象在目前還是人體不可避免的生理規(guī)律，隨著年齡在增長，身體上的皮膚，特別是臉部皮膚會慢慢的失去原有的彈性、原有的皮膚光澤、變得松弛、出現(xiàn)皺紋等。根據(jù)研究，彈性蛋白酶(Elastase，CASNo.39445-21-1)是一種分布于多種組織和細胞中的破壞性酶，它能水解結(jié)締組織成分如：彈性蛋白、蛋白多糖和某些膠原質(zhì)。結(jié)締組織蛋白質(zhì)中的彈性蛋白被彈性蛋白酶消化分解后，可使皮膚失去彈性，表現(xiàn)出皮膚松弛、顯露暗紋和出現(xiàn)皺紋等皮膚衰老現(xiàn)象。人類皮膚的顏色取決于黑色素的含量與分布，當大量黑色素在人體沉積分布不均勻時，就會形成雀斑、黃褐斑。酪氨酸酶廣泛存在于人體中，是產(chǎn)生黑色素的關(guān)鍵酶。黑色素的形成過程為：人體皮膚黑色素細胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下被氧化生成多巴和多巴醌，經(jīng)重排后進一步氧化生成多巴色素、5，6-二羥基吲哚、吲哚醌，最終合成黑色素。目前常用美白劑化妝品的主要機理是通過抑制酪氨酸酶活性或阻斷酪氨酸氧化生成黑色素，從而減少黑色素的生成而達到皮膚美白的效果。隨著人們生活水平的不斷提高以及東方女性對美白的追求，現(xiàn)今的美白化妝品市場發(fā)展十分迅速，美白劑的開發(fā)研究也不斷推出?，F(xiàn)有的針對皮膚緊致和美白作用研究開發(fā)的化妝品很多是通過化學成分合成制得，或多或少都對皮膚造成傷害，更嚴重的甚至對皮膚造成不可修復(fù)的損傷。因此開發(fā)天然的化妝品已經(jīng)成為當前醫(yī)藥和化妝品行業(yè)的主要研究方向之一，具有非常好的發(fā)展前景。厚皮樹為漆樹科厚皮樹屬植物，該屬植物進一步分成細組群包括亞種、變種、栽培品種共在世界上約有87種，主要分布于中南半島、印度和其他一些熱帶地區(qū)，以熱帶非洲最多，我國只有1種。我國的厚皮樹主要分布在云南、廣東、廣西、海南等地，常見于低海拔較干燥的山坡疏林中。部分學者對厚皮樹屬植物進行了化學成分研究，發(fā)現(xiàn)該屬植物中所含化學成分主要為黃酮類、甾醇類、蒽醌類、氫醌類、酚類、烯醇類等成分，且大多具有較好的生物活性。黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老和增加機體免疫力的作用；同時，還具有明顯的抗腫瘤活性。但是目前還沒有針對厚皮樹提取物的制備、以及厚皮樹或厚皮樹提取物在皮膚化妝品中的應(yīng)用的相關(guān)文獻報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種安全可靠、簡單高效的厚皮樹提取物制備方法，并將厚皮樹提取物應(yīng)用在化妝品中，能夠起到降低皮膚黑色素、提高皮膚彈性以及減少皺紋等功效。為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明公開了一種厚皮樹提取物的制備方法，包括以下步驟：S1：將a重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入到8a～10a重量份乙醇水溶液中，提取后進行過濾，減壓濃縮得到b重量份膏狀物；S2：將b重量份所述膏狀物加入到b～3b重量份去離子水中得到分散液，將所述分散液加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到第二萃取液，然后將所述第二萃取液通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附后，洗脫并收集目標洗脫液；S3：將所述目標洗脫液進行減壓濃縮、冷凍干燥后得到所述厚皮樹提取物。優(yōu)選地，步驟S2中在將所述分散液加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到第二萃取液中具體包括：將所述分散液先加入到3b～5b重量份的石油醚或三氯甲烷中進行萃取得到第一萃取液，然后再將所述第一萃取液中的下層加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到所述第二萃取液。優(yōu)選地，步驟S2中聯(lián)用至少兩種樹脂具體是指聚酰胺樹脂聯(lián)用大孔樹脂，其中所述大孔樹脂是指LSA-10大孔樹脂、DM130大孔樹脂或HP20大孔樹脂。優(yōu)選地，步驟S2中將所述第二萃取液通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附后，洗脫并收集目標洗脫液具體包括：首先將所述第二萃取液通過聚酰胺樹脂進行吸附，并依次采用水洗、質(zhì)量百分比為10％以下的乙醇水溶液洗脫至無色；然后將所述聚酰胺樹脂置于所述大孔樹脂的上端，并采用質(zhì)量百分比為60～85％的乙醇水溶液洗脫后收集所述目標洗脫液。優(yōu)選地，步驟S1中的乙醇水溶液中還含有增溶助劑，其中所述增溶助劑的質(zhì)量為乙醇水溶液的質(zhì)量的0.1～1％，優(yōu)選地，步驟S1中的乙醇水溶液中的乙醇的質(zhì)量百分比為70～95％。優(yōu)選地，所述增溶助劑是吐溫20、吐溫60、吐溫80、PEG-40氫化蓖麻油、PEG-60氫化蓖麻油、氫化大豆卵磷脂中的至少一種。優(yōu)選地，步驟S1中提取步驟的時間2～3h，優(yōu)選地，在過濾步驟之前將加入到8a～10a重量份乙醇水溶液中并提取的步驟重復(fù)至少一次。本發(fā)明還公開了一種通過上述的制備方法制得的厚皮樹提取物。本發(fā)明另外還公開了一種上述的厚皮樹提取物在制備化妝品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述化妝品包括基質(zhì)和所述厚皮樹提取物，其中所述厚皮樹提取物占所述化妝品的重量的0.1～5％；優(yōu)選地，所述化妝品的劑型為溶液、乳液或霜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的厚皮樹提取物的制備方法安全可靠、簡單高效，首先將粉碎的厚皮樹樹皮溶解到乙醇水溶液中，使得其中的活性物質(zhì)溶解，并提取過濾、減壓濃縮得到膏狀物實現(xiàn)活性成分的初步提??；然后將膏狀物溶解在去離子水中并加入到正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取，正丁醇或乙酸乙酯可以富集活性成分，并通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附后進一步提高活性成分的純度，再經(jīng)過洗脫以收集包含提純后的活性成分的目標洗脫液，最終將目標洗脫液進行減壓濃縮、冷凍干燥后得到含有高純度活性成分的厚皮樹提純物；該厚皮樹提取物中的活性成分具有抑制彈性蛋白酶和酪氨酸酶活性、以及消除自由基等作用，故該厚皮樹提取物可制成具有提高皮膚彈性、減少皺紋以及降低皮膚黑色素等功能的化妝品。在進一步的方案中，本發(fā)明還具有以下有益效果：步驟S1中將粉碎后的厚皮樹樹皮加入到含有增溶助劑的乙醇水溶液中，增溶助劑具有濕潤和分散作用，可以與水充分融合，使得厚皮樹樹皮中的難溶性活性物質(zhì)的溶解度增大，并分散懸浮在溶液中，從而提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性以有利于后續(xù)的過濾等步驟的操作。步驟S2中在將分散液加入到正丁醇或乙酸乙酯中萃取之前先將分散液加入到石油醚或三氯甲烷中進行萃取，以除去分散液中的脂溶性色素，從而可以降低厚皮樹提取物的顏色，并進一步可以降低制備的化妝品的顏色。步驟S2中對第二萃取液通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附，具體采用聚酰胺樹脂聯(lián)用大孔樹脂，先采用聚酰胺樹脂吸附，將正丁醇或乙酸乙酯洗脫掉，得到吸附有活性成分的聚酰胺樹脂；然后采用大孔樹脂，將活性成分洗脫至目標洗脫液中，進一步提高了活性成分的純度，同時也使用方便，易于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施方式下面對照結(jié)合優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中公開了一種厚皮樹提取物的制備方法，包括以下步驟：S1：將a重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入到8a～10a重量份乙醇水溶液中，提取后進行過濾，減壓濃縮得到b重量份膏狀物；S2：將b重量份所述膏狀物加入到b～3b重量份去離子水中得到分散液，將所述分散液加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到第二萃取液，然后將所述第二萃取液通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附后，洗脫并收集目標洗脫液；S3：將所述目標洗脫液進行減壓濃縮、冷凍干燥后得到所述厚皮樹提取物。在進一步的實施例中，步驟S2中在將所述分散液加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到第二萃取液中具體包括：將所述分散液先加入到3b～5b重量份的石油醚或三氯甲烷中進行萃取得到第一萃取液，然后再將所述第一萃取液中的下層加入到3b～5b重量份的正丁醇或乙酸乙酯中進行萃取得到所述第二萃取液。在進一步的實施例中，步驟S2中聯(lián)用至少兩種樹脂具體是指聚酰胺樹脂聯(lián)用大孔樹脂，其中所述大孔樹脂是指LSA-10大孔樹脂、DM130大孔樹脂或HP20大孔樹脂。在進一步的實施例中，步驟S2中將所述第二萃取液通過聯(lián)用至少兩種樹脂吸附后，洗脫并收集目標洗脫液具體包括：首先將所述第二萃取液通過聚酰胺樹脂進行吸附，并依次采用水洗、質(zhì)量百分比為10％以下的乙醇水溶液洗脫至無色；然后將所述聚酰胺樹脂置于所述大孔樹脂的上端，并采用質(zhì)量百分比為60～85％的乙醇水溶液洗脫后收集所述目標洗脫液。在進一步的實施例中，步驟S1中的乙醇水溶液中還含有增溶助劑，其中所述增溶助劑的質(zhì)量為乙醇水溶液的質(zhì)量的0.1～1％，優(yōu)選地，步驟S1中的乙醇水溶液中的乙醇的質(zhì)量百分比為70～95％。在進一步的實施例中，所述增溶助劑是吐溫20、吐溫60、吐溫80、PEG-40氫化蓖麻油、PEG-60氫化蓖麻油、氫化大豆卵磷脂中的至少一種。在進一步的實施例中，步驟S1中提取步驟的時間2～3h，且在過濾步驟之前將加入到8a～10a重量份乙醇水溶液中并提取的步驟重復(fù)至少一次。本發(fā)明的優(yōu)選實施例還公開了一種通過上述制備方法制得的厚皮樹提取物。本發(fā)明的優(yōu)選實施例還另外公開了一種上述厚皮樹提取物在制備化妝品中的應(yīng)用；在進一步的實施例中，所述化妝品包括基質(zhì)和所述厚皮樹提取物，其中所述厚皮樹提取物占所述化妝品的重量的0.1～5％；優(yōu)選地，所述化妝品的劑型為溶液、乳液或霜。下述結(jié)合具體實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施例中的厚皮樹提取物的制備方法作進一步說明。實施例1：制備厚皮樹提取物A將c重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入8c重量份的75％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液中，其中乙醇水溶液中含有0.5％質(zhì)量百分比的PEG-60氫化蓖麻油，提取2h，并重復(fù)一次加入乙醇水溶液和提取步驟，過濾，減壓濃縮得到d重量份的膏狀物；將d重量份的膏狀物加入到d重量份的去離子水中分散后，加入3d重量份的石油醚進行萃取得到第一萃取液，第一萃取液的下層繼續(xù)用3d重量份的正丁醇萃取得到第二萃取液；第二萃取液通過聚酰胺樹脂吸附后，依次用水洗、10％質(zhì)量百分比的濃度的乙醇洗脫物至無色后，得到吸附有活性成分的聚酰胺樹脂，再將該聚酰胺樹脂置于DM130大孔樹脂上端，并采用60％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液洗脫后收集目標洗脫液；將目標洗脫液通過減壓濃縮、冷凍干燥后得到厚皮樹提取物A。實施例2：制備厚皮樹提取物B將e重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入10e重量份的85％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液中，其中乙醇水溶液中含有0.1％質(zhì)量百分比的吐溫20，提取3h，并重復(fù)一次加入乙醇水溶液和提取步驟，過濾，減壓濃縮得到f重量份的膏狀物；將f重量份的膏狀物加入到3f重量份的去離子水中分散后，加入5f重量份的石油醚進行萃取得到第一萃取液，第一萃取液的下層繼續(xù)用5f重量份的正丁醇萃取得到第二萃取液；第二萃取液通過聚酰胺樹脂吸附后，依次用水洗、10％質(zhì)量百分比的乙醇洗脫物至無色后，得到吸附有活性成分的聚酰胺樹脂，再將該聚酰胺樹脂置于HP20大孔樹脂上端，并采用60％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液洗脫后收集目標洗脫液；將目標洗脫液通過減壓濃縮、冷凍干燥后得到厚皮樹提取物B。實施例3：制備厚皮樹提取物C將i重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入10i重量份的70％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液中，其中乙醇水溶液中含有0.5％質(zhì)量百分比的氫化大豆卵磷脂，提取2h，并重復(fù)一次加入乙醇水溶液和提取步驟，過濾，減壓濃縮得到j(luò)重量份的膏狀物；將j重量份的膏狀物加入到j(luò)重量份的去離子水中分散后，加入3j重量份的三氯甲烷進行萃取得到第一萃取液，第一萃取液的下層繼續(xù)用3j重量份的正丁醇萃取得到第二萃取液；第二萃取液通過聚酰胺樹脂吸附后，依次用水洗、8％質(zhì)量百分比的乙醇洗脫物至無色后，得到吸附有活性成分的聚酰胺樹脂，再將該聚酰胺樹脂置于LSA-10大孔樹脂上端，并采用85％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液洗脫后收集目標洗脫液；將目標洗脫液通過減壓濃縮、冷凍干燥后得到厚皮樹提取物C。實施例4：制備厚皮樹提取物D將m重量份的厚皮樹樹皮粉碎，加入8m重量份的95％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液中，其中乙醇水溶液中含有1％質(zhì)量百分比的吐溫80，提取2h，并重復(fù)一次加入乙醇水溶液和提取步驟，過濾，減壓濃縮得到n重量份的膏狀物；將n重量份的膏狀物加入到n重量份的去離子水中分散后，加入3n重量份的石油醚進行萃取得到第一萃取液，第一萃取液的下層繼續(xù)用3n重量份的乙酸乙酯萃取得到第二萃取液；第二萃取液通過聚酰胺樹脂吸附后，依次用水洗、10％質(zhì)量百分比的乙醇洗脫物至無色后，得到吸附有活性成分的聚酰胺樹脂，再將該聚酰胺樹脂置于HP20大孔樹脂上端，并采用80％質(zhì)量百分比的乙醇水溶液洗脫后收集目標洗脫液；將目標洗脫液通過減壓濃縮、冷凍干燥后得到厚皮樹提取物D。下述對上述具體實施例的制備方法制備得到的厚皮樹提取物的抑制彈性蛋白酶和酪氨酸酶活性、以及消除自由基活性的效果進行測試。實施例5：彈性蛋白酶抑制活性的檢測分別將實施例1、2、3、4制備得到的厚皮樹提取物A、B、C、D溶于二甲亞砜，配制成質(zhì)量百分比0.5％的溶液，用于測定彈性蛋白酶抑制活性。測定步驟為：在96孔板中加入10uL樣品溶液和130uL含有1.015mM反應(yīng)底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1MTris-Cl緩沖溶液(PH8.0)，在25℃下溫育5分鐘，加入15uL彈性蛋白酶溶液(0.5U/ml)，繼續(xù)在25℃下溫育30min，然后用酶標儀測定410nm波長的吸光度A410。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液同樣測定吸光度。彈性蛋白酶活性抑制率計算公式為：抑制率(％)＝(A0-(A410-B))/A0×100％，其中A0是參比溶液的吸光度，A410是樣品溶液的吸光度，B是樣品水溶液稀釋3倍后的吸光度。最終測得厚皮樹提取物A、B、C、D的彈性蛋白酶抑制率如表1所示。表1厚皮樹提取物A、B、C、D的彈性蛋白酶抑制率樣品質(zhì)量百分比彈性蛋白酶抑制率厚皮樹提取物A0.5％68％厚皮樹提取物B0.5％75％厚皮樹提取物C0.5％64％厚皮樹提取物D0.5％81％從表1中可以看出，從厚皮樹樹皮獲得的提取物，經(jīng)吸附樹脂分離后，所得提取物均能實現(xiàn)對彈性蛋白酶活性的抑制，其中厚皮樹提取物D對彈性蛋白酶活性的抑制作用最強。實施例6：體外抑制酪氨酸酶活性測試分別將實施例1、2、3、4制備得到的厚皮樹提取物A、B、C、D溶于二甲亞砜中，配成質(zhì)量百分比0.5％的樣品溶液，進行下面試驗。同時以熊果苷作為對照樣品。配制pH＝6.8，0.1M的磷酸鹽緩沖溶液。取1.770mLPBS，先后加入30μ質(zhì)量百分比0.5％的厚皮樹提取物A、B、C、D樣品溶液與0.2mL(100U)的酪氨酸酶溶液，混勻。30℃水浴10分鐘，然后加入1mL加入0.1％L-DOPA溶液，水浴20分鐘后，475nm下測定吸光度。同時熊果苷也采用上述方法進行測試。厚皮樹提取物A、B、C、D及熊果苷的酪氨酸酶抑制率如表2。表2厚皮樹提取物A、B、C、D及熊果苷的酪氨酸酶抑制率樣品酪氨酸酶抑制率厚皮樹提取物A84.5％厚皮樹提取物B92.4％厚皮樹提取物C87.2％厚皮樹提取物D93.3％熊果苷77.2％從表2中可以看出，本發(fā)明的厚皮樹提取物能有效地抑制體外酪氨酸酶活性，而且明顯優(yōu)于目前常用的熊果苷美白劑。實施例7：B16細胞酪氨酸酶活性抑制評價用胰蛋白酶消化對數(shù)期的單層細胞，將細胞收集至細胞培養(yǎng)液中；離心，棄上清。用培養(yǎng)液重新懸浮細胞，計數(shù)。調(diào)整細胞懸液的濃度至2.5×103～50×103個/mL。96孔板，于二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中孵育24h。將實施例1、2、3、4分別所得的厚皮樹提取物A、B、C、D以及作為對照樣品的熊果苷以一定濃度稀釋，加入細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。PBS洗滌1遍。每孔加入0.5％質(zhì)量百分比的脫膽酸鈉溶液100μL，震蕩10min，0℃。30min后升溫至37℃，加入0.1％質(zhì)量百分比的L-DOPA溶液10L。孵育20min后，475nm下測定吸光度。厚皮樹提取物A、B、C、D以及熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制率結(jié)果如表3。表3厚皮樹提取物A、B、C、D以及熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制率從表3中可以看出，本發(fā)明的厚皮樹提取物能有效地抑制B16細胞酪氨酸酶活性，且在同等濃度下，明顯優(yōu)于目前常用的熊果苷美白劑。實施例7：清除自由基活性的檢測分別將實施例1、2、3、4制備得到的厚皮樹提取物A、B、C、D溶于二甲亞砜，配制成質(zhì)量百分比0.5％的溶液，用DPPH法測定其清除自由基活性，以VC(維生素C)為對照樣品。測定步驟為：準確移取提取液2mL于10mL具塞試管中，加人2mLDPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混勻，室溫靜置，30min后用分光光度計測定517nm波長的吸光度A517(以乙醇為參比)；同時測定2mLDPPH溶液與2mL乙醇混合后的吸光度AC，以及2mL提取液與2mL乙醇溶液混合后的吸光度A0。平行測定三次，取平均值，根據(jù)以下公式計算自由基清除率：自由基清除率＝(1-(A517-A0)/AC)×100％。最終測得厚皮樹提取物A、B、C、D及VC的自由基清除率如表4所示。表4厚皮樹提取物A、B、C、D及VC的自由基清除率從表4中可以看出，本發(fā)明的從厚皮樹樹皮獲得的提取物均能實現(xiàn)自由基清除作用，而且明顯優(yōu)于目前常用的VC，其中厚皮樹提取物B對自由基清除作用最強。下述結(jié)合具體實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施例中的厚皮樹提取物在化妝品中的應(yīng)用作進一步說明。實施例8：制備含厚皮樹提取物的精華霜精華霜包含以下質(zhì)量百分比的組分：鯨蠟硬脂醇2％、辛酸/癸酸甘油三酯5％、角鯊?fù)?％、聚二甲基硅氧烷2％、環(huán)五聚二甲基硅氧烷5％、甘油5％、1,3-丁二醇3％、尿囊素0.2％、厚皮樹提取物2％、漢生膠0.3％、聚丙烯酰胺和C13-14異鏈烷烴和桂醇醚-70.8％、防腐劑0.3％、水余量，具體原料及含量如表5所示。表5精華霜的原料及含量該精華霜可由以下工藝制備：將A相加入油相鍋中，加熱到80℃；將B相加入乳化鍋中，加熱到80℃；把A相加入B相均質(zhì)2-3分鐘；加入C相均質(zhì)2-3分鐘；攪拌冷卻至30-40℃加入D相、E相；制得精華霜，該精華霜能夠提高皮膚彈性、減少皺紋以及降低皮膚黑色素。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3