本發(fā)明涉及益生菌，特別地，但不排外地，涉及衍生自益生菌的抗菌組合物。
背景技術(shù)：
：：對益生菌有益于腸道健康的概念的研究已有多年。研究已經(jīng)證明益生菌通過若干機(jī)制潛在地改善腸道功能，包括增加上皮屏障功能(40)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答(6,51)。還有證據(jù)表明益生菌可以防止病原體對腸道的定殖。這可以通過如下的機(jī)制：比如毒力因子的下調(diào)和病原體對上皮的粘附的抑制(2)。例如，乳桿菌通過競爭性排除抑制阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)對腸粘液的粘附(32)。其它研究表明，一些益生菌增加腸粘蛋白的產(chǎn)量，從而抑制病原體對腸上皮細(xì)胞的粘附(31)。益生菌還能夠產(chǎn)生抗菌肽(細(xì)菌素)和酸?？偟膩碚f，存在許多益生菌介導(dǎo)的機(jī)制，限制病原體殖民化(33)。由于益生菌對腸道有積極的影響，益生菌對其它系統(tǒng)，比如口腔(18)和泌尿生殖道(44)的潛在影響也已經(jīng)開始研究。2001年的研究，調(diào)查乳桿菌口服給藥對患有細(xì)菌性陰道病的婦女的臨床試驗的影響，其表明乳桿菌確實可以抑制病原體對尿路上皮細(xì)胞的定殖(44)。最近，在有限數(shù)量的研究中已經(jīng)調(diào)查了益生菌在皮膚的局部應(yīng)用。將超聲處理的唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)菌株局部應(yīng)用于患有特異性皮炎的患者的結(jié)果是通過提高角質(zhì)層中的神經(jīng)酰胺水平顯然改善屏障功能(13)。局部應(yīng)用植物乳桿菌以治療感染的傷口的結(jié)果是改善小鼠燒傷模型中的組織修復(fù)并預(yù)防慢性下肢潰瘍和人燒傷感染(41,42)。然而，一般來說，尚未很好地了解這些影響隱藏的機(jī)制。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是皮膚的臨時殖民者和主要的機(jī)會性皮膚病原體，其引起的疾病從膿皰病至危及生命的病癥比如敗血癥(25)。以前，我們的實驗室證明了益生菌羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)通過將病原體從角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)合位點競爭性排除可以保護(hù)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌(S.aureus)的毒性作用(43)。發(fā)明人現(xiàn)在將鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)GG識別為第二益生菌，其具有保護(hù)皮膚細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的影響的能力。然而，鼠李糖乳桿菌GG使用多種機(jī)制來抵抗感染，包括抑制金黃色葡萄球菌生長、競爭性排斥和從角質(zhì)形成細(xì)胞置換病原體。技術(shù)實現(xiàn)要素：少有研究評價局部應(yīng)用益生菌或源自它們的物質(zhì)的潛在益處。發(fā)明人研究了益生菌、鼠李糖乳桿菌GG是否能抑制培養(yǎng)物中人原代角質(zhì)形成細(xì)胞的金黃色葡萄球菌感染。當(dāng)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞暴露于金黃色葡萄球菌時，僅25％的角質(zhì)形成細(xì)胞在24小時后保持存活。然而，在存在108CFU/ml活鼠李糖乳桿菌GG時，感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率增加至57％(P＝0.01)。有趣的是，鼠李糖乳桿菌GG裂解物和用過的培養(yǎng)液也為角質(zhì)形成細(xì)胞提供了顯著的保護(hù)作用，分別有65％(P＝0.006)和57％(P＝0.01)的細(xì)胞在24小時孵育后是活的。在金黃色葡萄球菌感染2小時前或同時(P＝0.005)或12小時后(P＝0.01)，無論益生菌是以活體形式還是作為裂解物應(yīng)用，角質(zhì)形成細(xì)胞存活明顯提高。然而，用過的培養(yǎng)液只有在金黃色葡萄球菌之前或同時加入時才具有保護(hù)作用。關(guān)于機(jī)制，鼠李糖乳桿菌GG裂解物或用過的培養(yǎng)液顯然通過競爭性排除抑制金黃色葡萄球菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附，但是只有活細(xì)菌或裂解物可以置換金黃色葡萄球菌(分別為P＝0.04和0.01)。此外，活細(xì)菌或裂解物而不是用過的培養(yǎng)液抑制金黃色葡萄球菌的生長。這些數(shù)據(jù)一起表明鼠李糖乳桿菌GG針對金黃色葡萄球菌的保護(hù)作用、生長抑制和細(xì)菌減少粘附中涉及至少兩種獨立的活性。發(fā)明人先前已證明益生菌及其裂解物保護(hù)細(xì)胞免受病原菌比如金黃色葡萄球菌的感染(參見WO2013/153358)。他們現(xiàn)在已經(jīng)證明，其中先前已培養(yǎng)益生菌的無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液還能夠防止病原菌粘附或感染細(xì)胞。因此，益生菌能夠通過至少兩種機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受感染。首先，益生菌可能能夠通過包含在益生菌中、能夠直接抑制病原菌的生長和/或存活率的一種或多種試劑減少或抑制病原菌的生長。其次，如本文所述，由益生菌分泌(并因此存在于培養(yǎng)基中)的一種或多種試劑可能通過防止病原菌對細(xì)胞的粘附從而能夠抑制病原菌感染細(xì)胞的能力。因此，由益生菌分泌的物質(zhì)對病原菌感染具有保護(hù)作用。因此，分泌物質(zhì)具有抗菌或抗感染性質(zhì)，該性能可以用于本文所述的各種抗細(xì)菌組合物中。說明本發(fā)明包括描述的方面和優(yōu)選特征的組合，除非這樣的組合是明顯不允許或明確避免的。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的，并且不應(yīng)被解釋為限制所描述的主題。益生菌本發(fā)明涉及益生菌的用途。益生菌通常被定義為“當(dāng)足量施用時給予宿主健康益處的活微生物”。腸道研究已經(jīng)證明益生菌通過包括排除、競爭和置換附著于宿主組織的病原體的機(jī)制抑制病原體定殖的能力。本文所使用的術(shù)語“益生菌”還可以指其不再存活時的細(xì)菌，例如在通過加熱或輻射滅活后。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)本發(fā)明特別涉及鼠李糖乳桿菌的益生菌。這樣的細(xì)菌原本被認(rèn)為是干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的亞種，但后來的遺傳研究發(fā)現(xiàn)它是自己的物種。已知有若干鼠李糖乳桿菌菌株。例如，菌株1-1720(PasteurcollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)、AC413、GR-1(Karlssonetal.,BMCmicrobiology2012,12:15)、JB-1(Bravoetal.,PNAS2011108(38)16050-16055)GG和LC705(Savijoketal.,J.ProteomeResearch201110(8)3460-3474)?？梢暂p易分離鼠李糖乳桿菌的其它菌株。特別地，本發(fā)明涉及鼠李糖乳桿菌GG。鼠李糖乳桿菌GG(本文中也稱為LGG)保藏于ATCC(美國組織培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號為ATCC53103。1983年Gorbach和Goldin從健康人類的腸道中分離出LGG。組合物根據(jù)本發(fā)明的組合物包含來自益生菌的分泌物質(zhì)或由來自益生菌的分泌物質(zhì)組成。分泌物質(zhì)是指由益生菌分泌的物質(zhì)。分泌物質(zhì)可以是單一試劑。其可以是一種以上試劑的混合物。分泌物質(zhì)可以包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸或脂質(zhì)。分泌物質(zhì)可以包括分泌組(secretome)，分泌組是益生菌的所有分泌蛋白和分泌機(jī)構(gòu)。其可以另外包括不是蛋白質(zhì)的分子，比如碳水化合物、脂質(zhì)和核酸。本文所述的一些組合物包含在載體中的分泌物質(zhì)。載體通常是分泌物質(zhì)溶解、懸浮、稀釋或混合于其中的溶液。在一些情況下，載體可以是在培養(yǎng)期間與益生菌接觸的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的組成會改變，例如，被益生菌分泌物質(zhì)改變。組合物可以構(gòu)成或包含益生菌已經(jīng)在其中生長的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適于培養(yǎng)益生菌的培養(yǎng)基。本文所用的術(shù)語“培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)介質(zhì)”包括任何含養(yǎng)分的液體，其中微生物，比如細(xì)菌，可以得到支持、存活、生長和/或擴(kuò)增。培養(yǎng)基可以含有支持細(xì)菌生命的最少養(yǎng)分，和任選的其它養(yǎng)分。包含在肉湯中的典型養(yǎng)分包括糖、鎂、磷酸鹽、磷和硫。培養(yǎng)基可以由本領(lǐng)域熟知的養(yǎng)分組合(比如Wilkins-Chalgren肉湯)制成或改變而來。培養(yǎng)基可以預(yù)混合商業(yè)來源而獲得，或者可以自制。益生菌可以與培養(yǎng)基接觸至少6小時、至少12小時、至少18小時、至少24小時、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少2周或更長。益生菌可以在需氧或厭氧條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或與培養(yǎng)基接觸。優(yōu)選地，益生菌在厭氧條件下培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)可以在10％H2、10％C02、80％N2下進(jìn)行。益生菌可以在促進(jìn)益生菌生長和擴(kuò)增的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些條件。例如，培養(yǎng)物可以在37℃下孵育。優(yōu)選地，組合物不含任何益生菌?？梢詮呐囵B(yǎng)基中除去益生菌，例如通過離心和/或過濾。例如，通過在離心機(jī)中以15,000×g使細(xì)菌在培養(yǎng)基中沉淀足以使基本上所有細(xì)菌從培養(yǎng)基中沉淀出來的一段時間，從而可以除去細(xì)菌。可以使用具有合適尺寸的孔的微孔過濾器過濾培養(yǎng)基，以從培養(yǎng)基中除去基本所有的細(xì)菌。這些方法可以除去完整的細(xì)菌，并且還可以除去細(xì)菌碎片，比如，已經(jīng)經(jīng)歷細(xì)胞裂解(例如通過凋亡)的任何細(xì)菌的殘余物。含有分泌物質(zhì)的培養(yǎng)基并非從已經(jīng)經(jīng)歷裂解過程的培養(yǎng)物獲得，因此不是并且并非已經(jīng)從裂解物獲得。組合物可以是無菌的。也就是說，分泌物質(zhì)已經(jīng)經(jīng)過滅菌過程，比如照射、加熱、化學(xué)品、壓力或過濾，或其任何組合。這可以包括高壓滅菌、x射線滅菌或紫外線滅菌。在培養(yǎng)基含有分泌物質(zhì)的情況下，可以在引入和培養(yǎng)益生菌之前，和在細(xì)菌從培養(yǎng)基中除去之后將培養(yǎng)基滅菌。在一些情況下，包含分泌物質(zhì)的組合物基本上不含完整細(xì)菌。該組合物還可以基本上不含裂解的細(xì)菌或細(xì)菌片段，例如已經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)菌。完整的細(xì)菌和/或裂解的細(xì)菌或細(xì)菌片段可能已從分泌物質(zhì)中分離。分離可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行，例如離心或過濾?！盎旧喜缓笔侵阜置谖镔|(zhì)不包含非分泌細(xì)菌組分，比如全細(xì)菌、裂解的細(xì)菌，或細(xì)菌片段的污染或其污染最小化。因此，組合物可含有100％分泌物質(zhì)、至少99％分泌物質(zhì)、至少95％分泌物質(zhì)、至少90％分泌物質(zhì)、至少85％分泌物質(zhì)、至少80％分泌物質(zhì)、至少75％分泌物質(zhì)或至少70％分泌物質(zhì)。如本文所述，分泌物質(zhì)可以包含非細(xì)菌來源的另外的組分，例如載體溶液，其它活性劑或防腐劑。本文所述的組合物可以通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)益生菌，從培養(yǎng)基中分離益生菌，以及從培養(yǎng)基制備組合物來制備。益生菌可以在厭氧條件下培養(yǎng)。益生菌可以在高于人體正常溫度的溫度下培養(yǎng)。益生菌可以在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或41℃培養(yǎng)。優(yōu)選地，益生菌在37℃培養(yǎng)。益生菌可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。益生菌或裂解的細(xì)菌或細(xì)菌碎片可通過離心例如15000xg離心從培養(yǎng)基中分離。可以通過過濾將培養(yǎng)基與益生菌、裂解的細(xì)菌或細(xì)菌碎片分離?？梢酝ㄟ^過濾和離心的組合來分離培養(yǎng)基?？梢栽诔ヒ嫔盎蛑髮ε囵B(yǎng)基進(jìn)行滅菌。例如，在從全細(xì)菌、裂解的細(xì)菌或細(xì)菌碎片中分離培養(yǎng)基后，可以對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌?？梢詫ε囵B(yǎng)基進(jìn)行濃縮，使得分泌物質(zhì)的比例相對于培養(yǎng)基的總體積增加?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，比如蒸發(fā)，進(jìn)行濃縮。分泌物質(zhì)可以從培養(yǎng)基分離?？梢允褂脧妮d體溶液中分離物質(zhì)的任何方法。例如，分泌物質(zhì)可以通過色譜、結(jié)晶、蒸餾、干燥、電泳或沉淀從培養(yǎng)基中分離。一旦從培養(yǎng)基分離或在培養(yǎng)基中濃縮，分泌物質(zhì)可以溶解或稀釋于載體中，或者以其它方式配制成本文公開的組合物。治療應(yīng)用本發(fā)明的化合物和組合物可用于多種疾病和病癥的治療。特別地，本發(fā)明的化合物和組合物可用于治療和預(yù)防皮膚感染，包括細(xì)菌感染。特別地，所述化合物和組合物可用于治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌感染。所述化合物和組合物可特別用于治療軟組織細(xì)菌感染，例如皮膚感染。本發(fā)明的化合物和組合物可特別用于預(yù)防或治療金黃色葡萄球菌皮膚感染。本發(fā)明涉及感染的預(yù)防或治療。本發(fā)明的益生菌組合物表現(xiàn)出抗感染活性。例如，抗粘附活性，包括防止金黃色葡萄球菌粘附于細(xì)胞。因此，所述組合物可用于預(yù)防或治療感染，包括細(xì)菌感染，比如，預(yù)防或治療耐多藥細(xì)菌的感染、醫(yī)院獲得性細(xì)菌感染、耐抗生素細(xì)菌感染，革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細(xì)菌感染引起的感染。本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)的感染，比如腐生葡萄球菌(S.saprophytics)，木糖葡萄球菌(S.xylosus)，呂克杜納西藏葡萄球菌(S.lugdenensis)，施氏葡萄球菌(S.schleiferi)，頭狀葡萄球菌(S.capitis)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，華納葡萄球菌(S.warneri)，金黃色葡萄球菌(S.aureus)、人型葡萄球菌(S.hominis)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MethicilinresistantS.aureus(MRSA))，釀膿葡萄球菌(S.pyrogenes)、S.saiivariu、變形鏈球菌(S.mutans)和S.pneumonia。特別地，本發(fā)明的組合物表現(xiàn)出抗葡萄球菌粘附活性，因此可用于預(yù)防或治療葡萄球菌感染。例如，本發(fā)明的組合物表現(xiàn)出抗金黃色葡萄球菌活性，因此可用于預(yù)防或治療金黃色葡萄球菌感染。感染發(fā)生在疾病引起微生物侵入身體組織時。那些微生物的繁殖及其產(chǎn)生的毒素與身體組織反應(yīng)，常常引起被感染的宿主的免疫反應(yīng)。感染可能由細(xì)菌、病毒、類病毒、真菌和其它寄生物引起。感染可以通過身體的任何組織發(fā)生，比如皮膚、腸或膜。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明的益生菌或裂解物用于治療腸道以外的組織的感染，例如在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的益生菌或裂解物不用于治療消化道、食管、胃、小腸、直腸或肛門的感染。在特定方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防身體，特別是皮膚的外表面的感染。根據(jù)本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防或治療皮膚感染。感染可以因細(xì)菌，例如葡萄球菌細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌而引起。組合物可以單獨地、循序地或在暴露于傳染物的同時應(yīng)用。優(yōu)選地，在暴露于傳染物之前應(yīng)用所述組合物。本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于預(yù)防細(xì)菌感染。所述組合物優(yōu)選在受試者暴露于傳染物，比如金黃色葡萄球菌之前，給受試者施用。受試者可能已被鑒定為處于被傳染物感染的風(fēng)險中。受試者可以被鑒定為由于其環(huán)境，例如位于已知存在傳染物的環(huán)境中，或者由于受試者的健康，例如存在開放性傷口或較差的免疫健康，而處于被傳染物感染的風(fēng)險中。例如，組合物可以用于醫(yī)院或其中已知或懷疑存在病原菌的其它臨床環(huán)境中。在一些情況下，患者將要接受或最近已接受手術(shù)。本文所述的組合物可用于防止開放性傷口(比如，由病原菌引起的手術(shù)切口或移植物)的感染。在一些情況下，確定受試者沒有被傳染物感染。例如，可以確定受試者沒有被金黃色葡萄球菌感染。用于確定受試者是否感染的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可以包括對從受試者獲得的樣品分析傳染物的存在。組合物可以單獨施用或與其它治療組合，根據(jù)待治療的病癥同時或循序地施用。分泌物質(zhì)可以溶解于、懸浮于一種或多種其它藥學(xué)上可接受的成分中或與一種或多種其它藥學(xué)上可接受的成分混合。益生菌或其裂解物可以存在于脂質(zhì)體或其它微粒中。在一些實施例中，分泌物質(zhì)可以作為藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體中的懸浮液提供。在一些實施例中，益生菌可以作為凍干物提供。非治療應(yīng)用本發(fā)明還提供清潔產(chǎn)品、洗滌劑、表面涂層或不用于人或動物體的醫(yī)療的其它組合物形式的抗菌組合物。這樣的試劑可用于除去、殺死或防止細(xì)菌在表面上的積累或抑制細(xì)菌的作用或生長。將分泌物質(zhì)配制為抗菌組合物。根據(jù)本發(fā)明的抗菌組合物可以用于在給患者或受試者施用、或治療或使用之前處理生物物質(zhì)、植入物和假體(包括支架、瓣膜、眼睛、助聽器、胃束帶、假牙、人工關(guān)節(jié)置換物等)，手術(shù)器械或其它醫(yī)療裝置?？咕M合物可用于處理易于定殖或暴露于細(xì)菌的表面，例如扶手、食物制備表面、廚房表面或設(shè)備、桌子、水槽、馬桶或其它浴室五金件?？咕M合物可以包含除了裂解物之外的試劑，例如清潔劑、穩(wěn)定劑、陰離子表面活性劑、香料、螯合劑、酸、堿、緩沖劑或洗滌劑。這些試劑可以促進(jìn)或增強(qiáng)試劑的抗菌性質(zhì)，比如殺死或抑制細(xì)菌，或防止已清潔表面的再菌落化。本發(fā)明還產(chǎn)生一種制備表面的方法，包括將分泌物質(zhì)應(yīng)用于表面。該方法可以導(dǎo)致病原微生物對表面的定殖減少。制劑盡管分泌物質(zhì)可以單獨使用，但優(yōu)選將其作為包含所述物質(zhì)和載體的制劑提供。分泌物質(zhì)可以溶解于、懸浮于一種或多種其它成分中或與一種或多種其它成分混合。在一些情況下，分泌物質(zhì)存在于脂質(zhì)體或其它微粒中。本文公開的制劑包括皮膚護(hù)理、傷口護(hù)理、呼吸護(hù)理和口腔護(hù)理制劑，包括醫(yī)療、個人護(hù)理和消費(fèi)品。制劑可以適當(dāng)?shù)貫橐后w、溶液(例如水性的、非水性的)、懸浮液(例如，水性的、非水性的)、乳液(例如水包油、油包水)、酏劑、糖漿、藥糖劑、漱口劑、滴劑、片劑(包括，例如，包衣片劑)、顆粒、粉末、糖錠、錠劑、膠囊(包括，例如，硬和軟明膠膠囊)、扁囊劑、丸劑、安瓿、大片劑、塞劑、陰道栓、酊劑、凝膠、糊劑、軟膏、霜劑、洗劑、油、泡沫、噴霧、薄霧或氣溶膠的形式。制劑可適當(dāng)?shù)靥峁橛靡环N或多種活性化合物和任選的一種或多種其它藥學(xué)上可接受的成分(包括，例如穿透、滲透和吸收增強(qiáng)劑)浸漬的貼劑、膠布、繃帶、敷料等。制劑也可適當(dāng)?shù)匾蚤L效制劑和貯存囊的形式提供。在一些制劑中，分泌物質(zhì)與一種或多種藥學(xué)上可接受的成分一起配制。藥學(xué)上可接受的成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、賦形劑、稀釋劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、增溶劑(solubiliser)、表面活性劑(例如，潤濕劑、掩蔽劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。制劑還可以包含其它活性劑，例如，其它治療劑或預(yù)防劑。本文的某些產(chǎn)品和制劑適于皮膚護(hù)理或傷口護(hù)理。“護(hù)膚”是指個人局部護(hù)理和/或衛(wèi)生保健產(chǎn)品，包括用于治療成人或嬰兒皮膚，以維持或改善皮膚健康或改善皮膚外觀的產(chǎn)品?！皞谧o(hù)理”包括用于治療傷口，以協(xié)助傷口的閉合或愈合，和/或減少與傷口有關(guān)的疼痛或疤痕，保持或改善這種組織或皮膚健康，修復(fù)這類組織或皮膚，并且減少這種組織或皮膚刺激、瘙癢和/或發(fā)紅的產(chǎn)品。在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的分泌物質(zhì)配制用于局部給藥，特別是用于或應(yīng)用于皮膚或皮膚上。適于局部給藥的制劑包括凝膠，糊劑，軟膏，霜劑，洗劑和油，以及貼劑，膠布，繃帶，敷料，長效制劑，接合劑，膠和貯存囊。軟膏通常由分泌物質(zhì)和石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)制備。霜劑通常由益生菌或裂解物和水包油霜底制備。如果需要，霜底的水相可以包括例如，至少約30％w/w的多元醇，即，具有兩個或更多個羥基的醇，例如丙二醇，丁-1,3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制劑可期望地包括增強(qiáng)活性化合物經(jīng)由皮膚或其它受影響區(qū)域的吸收或滲透的化合物。這種真皮滲透增強(qiáng)劑的實例包括二甲基亞砜和相關(guān)的類似物。乳液通常由益生菌或裂解物和油相制備，所述油相可以僅任選地包含乳化劑(或者稱為乳劑)，或者其可以包含至少一種乳化劑與脂肪或油，或與兩者的混合物。優(yōu)選地，親水性乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑包含在一起。還優(yōu)選包括油和脂肪兩者。具有或不具有穩(wěn)定劑的乳化劑一起構(gòu)成所謂的乳化蠟，并且該蠟與油和/或脂肪一起構(gòu)成所謂的乳化軟膏基質(zhì)，乳化軟膏基質(zhì)形成霜劑制劑的油性分散相。合適的乳化劑和乳液穩(wěn)定劑包括Tween60、Span80、鯨蠟硬脂醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸鈉。用于制劑的合適的油或脂肪的選擇是基于實現(xiàn)所需的化妝品性質(zhì)，因為活性化合物在可能用于藥物乳液制劑中的大多數(shù)油中的溶解度可能非常低。因此，霜劑應(yīng)該優(yōu)選為具有合適稠度的不油膩、非染色和可洗滌的產(chǎn)品，以避免從管或其它容器中泄漏?？梢允褂弥辨溁蛑ф湹囊辉蚨榛ト缍惣憾狨ァ愽L蠟醇硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、2-棕櫚酸乙基己酯或稱為CrodamolCAP的支鏈酯的摻合物，最后三種為優(yōu)選的酯。取決于所需性能，可以單獨使用或組合使用這些物質(zhì)?？商鎿Q地，可以使用高熔點脂質(zhì)如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。本文所述的一些產(chǎn)品和制劑適于口腔護(hù)理?！翱谇蛔o(hù)理”是指在口腔或其任何部分中使用和/或使用物質(zhì)的產(chǎn)品，包括在牙齒、粘膜、舌頭等上使用的產(chǎn)品。口腔護(hù)理領(lǐng)域中的產(chǎn)品和用途包括那些意圖用于牙齒美容，包括例如牙齒美白、防止污染等，以及抗牙斑、抗牙齦炎、抗過敏、抗齲、口氣清新、干口緩解、侵蝕修復(fù)和預(yù)防、活性遞送和保留，知覺增強(qiáng)和口感改變等。用于口腔護(hù)理的制劑包括牙科用噴霧、漱口劑、牙膏、糖錠、抗菌洗滌劑、飲料(例如牛奶、酸奶)、食品(例如酸奶、冰淇淋、糖果棒)或粉末食品(例如奶粉)。適于口腔護(hù)理的制劑包括適于口服和/或口腔給藥的制劑。適于口服給藥(例如通過攝取)的制劑包括液體、溶液(例如，水性的、非水性的)，混懸劑(例如水性，非水性)、乳液(例如水包油、油包水)、酏劑，糖漿、藥糖劑、片劑、顆粒、粉末、膠囊、扁囊劑、丸劑、安瓿、大片劑。適于口腔給藥的制劑包括漱口劑、糖錠、錠劑、以及貼劑、膠布、長效制劑和貯存囊。糖錠通常在調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中包含活性化合物。錠劑通常在惰性基體(例如，明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)中包含活性化合物。漱口劑通常在合適的液體載體中包含活性化合物。本文公開的一些制劑適當(dāng)?shù)刈鳛橘N劑、膠布、繃帶、敷料等提供，其用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種分泌物質(zhì)和任選的一種或多種其它藥學(xué)上可接受的成分浸漬或涂布，所述其它藥學(xué)上可接受的成分包括，例如，穿透、滲透和吸收增強(qiáng)劑。益生菌、裂解物或培養(yǎng)基也可以以涂層的形式提供用于醫(yī)療裝置比如植入物、假肢、外科器械、手套、導(dǎo)管、瓣膜、起搏器等。本文公開的一些組合物和制劑適于呼吸護(hù)理?！昂粑o(hù)理”是指用于治療病癥，包括預(yù)防和治療鼻炎、竇炎、季節(jié)性過敏、鼻塞和感冒，的產(chǎn)品。所述組合物可用于預(yù)防呼吸道，包括鼻竇、氣道、咽喉或肺，的細(xì)菌感染。在一些情況下，將這種制劑配制用于鼻內(nèi)給藥或肺部給藥。適于鼻內(nèi)給藥的制劑(其中載體為液體)包括，例如，鼻噴霧劑、滴鼻劑或經(jīng)由噴霧器的氣霧劑給藥，包括活性化合物的水性或油性溶液。適于鼻內(nèi)給藥的制劑(其中載體為固體)包括，例如，以粒徑范圍為例如約20至約500微米的粗粉末呈現(xiàn)的那些制劑，其以吸取鼻煙的方式給藥，即，通過從靠近鼻子的粉末容器經(jīng)由鼻道快速吸入。適于肺部給藥(例如通過吸入或吹入療法)的制劑包括呈現(xiàn)為來自加壓包的氣溶膠噴霧的那些制劑，并且使用合適的推進(jìn)劑，比如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。根據(jù)本發(fā)明的組合物和制劑還可以包含其它活性劑，例如，其它抗菌劑，比如，殺菌劑。在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明使用的制劑可以包含至少約0.01wt％、約0.05wt％、約0.1wt％、約0.2wt％、約0.3wt％、約0.4wt％、約0.5wt％、約0.6wt％、約0.7wt％、約0.8wt％、約0.9wt％、約1.0wt％、約1.5wt％、約2.0wt％、約3.0wt％、約4.0wt％、約5.0wt％、約6.0wt％、約7.0wt％、約8.0wt％、約9.0wt％、約10.0wt％、約11.0wt％、約12.0wt％、約13.0wt％、約14.0wt％、約15.0wt％、約16.0wt％、約17.0wt％、約18.0wt％、約19.0wt％、約20.0wt％、約25.0wt％、約30.0wt％、約35.0wt％、約40.0wt％、約45.0wt％、約50.0wt％的分泌物質(zhì)。在一些實施例中，制劑可以包含約0.01wt％至約30wt％，約0.01wt％至約20wt％，約0.01wt％至約5wt％，約0.1wt％至約30wt％，約0.1wt％至約20wt％約0.1wt％至約15wt％，約0.1wt％至約10wt％，約0.1wt％至約5wt％，約0.2wt％至約5wt％，約0.3wt％至約5wt％，約0.4wt％至約5wt％，約0.5wt％至約5wt％，約1wt％至10約5wt％中至少一個的分泌物質(zhì)。藥物制劑根據(jù)本發(fā)明的益生菌制劑可以配制成用于臨床應(yīng)用的藥物組合物，并且可以包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或佐劑。其可以配制用于局部給藥。優(yōu)選以預(yù)防或治療有效量給藥，這是足以顯示對個體有益的量。實際施用量、給藥速率和時間進(jìn)程將取決于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療處方，例如，劑量等的決定在普通醫(yī)生和其他醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通?？紤]待治療或預(yù)防的疾病、個體患者的狀況、遞送位點、給藥方法和從業(yè)者所知的其它因素。上述技術(shù)和方案的實例可見于Remington'sPharmaceuticalSciences,20thEdition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，活性化合物和包含該活性化合物的組合物的合適劑量可隨患者而變化。本發(fā)明的組合物可以配制成藥劑，即，配制成藥物。藥劑可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它藥學(xué)上可接受的成分，包括但不限于藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、賦形劑、稀釋劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、表面活性劑(例如，潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。該制劑還可以包含其它活性劑，例如，其它治療劑或預(yù)防劑?，F(xiàn)在將參考附圖通過實例來說明本發(fā)明的方面和實施例。其它方面和實施例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本文中提及的所有文件通過引用并入本文。附圖說明現(xiàn)在將參考附圖來討論說明本發(fā)明的原理的實施例和實驗，其中：圖1：鼠李糖乳桿菌GG保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的毒性作用。未感染的細(xì)胞平均存活率為90％。金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞的平均存活率為25％±3.4。在用金黃色葡萄球菌和鼠李糖乳桿菌GG(LGG+SA)的組合感染的角質(zhì)形成細(xì)胞中，24小時后的存活率為57％±2.7(P＝0.01，n＝3)。圖2：來自鼠李糖乳桿菌GG的裂解物和用過的培養(yǎng)液(CM)保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的影響。相比單獨用金黃色葡萄球菌(SA)感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率25％±3.1，以鼠李糖乳桿菌GG裂解物和金黃色葡萄球菌(LGGLYS+SA)感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率為65％±2.4，并且以用過的培養(yǎng)液和金黃色葡萄球菌(LGGCM+SA)感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率為57％±1.5(分別為P＝0.006，P＝0.01，n＝3)。圖3：鼠李糖乳桿菌GG保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌感染。角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率百分比在預(yù)先暴露于鼠李糖乳桿菌GG(LGG+SA)、裂解物(LGGLYS+SA)或用過的培養(yǎng)液(LGGCM+SA)(58％±1.4,57％±1.9,55％±0.5,P＝0.006,P＝0.005,P＝0.004)的細(xì)胞中明顯比金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞(25％±1.3)高(n＝3)。圖4：鼠李糖乳桿菌GG，但不是其用過的培養(yǎng)液，從金黃色葡萄球菌介導(dǎo)的毒性中解救角質(zhì)形成細(xì)胞。A)將未感染的角質(zhì)形成細(xì)胞孵育過夜；大約90％的細(xì)胞在24小時后存活。在用鼠李糖乳桿菌GG(P＝0.003，n＝3)暴露2h(52％±1.6)、4h(54％±1.4)、6h(57％±1.3)、8h(58％±1.3)或12h(58％±1.5)后的細(xì)胞中金黃色葡萄球菌感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率明顯較高。B)在感染開始后，用鼠李糖乳桿菌GG裂解物處理2h(574％±3.1)、4h(58％±2.1)、6h(63％±1.2)、8h(63％±1.3)或12h(55％±2.4)的細(xì)胞存活率(P＝0.01,n＝3)之間的差異顯著，而已被金黃色葡萄球菌(SA)單獨感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率為25％±1.7。C)用鼠李糖乳桿菌GG用過的培養(yǎng)液(CM)暴露后的細(xì)胞沒有明顯的保護(hù)作用(P＝0.15,n＝3)，2h(32％±2.6)、4h(39％±2.4)、6h(37％±1.8)、8h(36％±1.3)或12h(35％±3.5)，而共同暴露的細(xì)胞對金黃色葡萄球菌感染具有顯著的保護(hù)作用(56％±2.1,P＝0.01,n＝3)。圖5：鼠李糖乳桿菌GG裂解物，但不是用過的培養(yǎng)液降低葡萄球菌的存活率。A)在每小時測定在角質(zhì)形成細(xì)胞存在下生長并用鼠李糖乳桿菌GG裂解物(LGGLYS)或用過的培養(yǎng)液(LGGCM)處理的金黃色葡萄球菌(SA)培養(yǎng)物的光密度以監(jiān)測該細(xì)菌的生長。在益生菌裂解物存在下金黃色葡萄球菌的生長明顯低于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物(P＝0.02，n＝3)，而用過的培養(yǎng)液沒有作用。B)單獨的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物中活金黃色葡萄球菌(SA)的數(shù)量為8logCFU/ml或在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物和用過的培養(yǎng)液(LGGCM)中活金黃色葡萄球菌(SA)的數(shù)量為7.87logCFU/ml，而在鼠李糖乳桿菌GG裂解物存在下，活金黃色葡萄球菌為5logCFU/ml。C)在感染后測定(2-4-6-8和12小時)中，鼠李糖乳桿菌GG裂解物使角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物中活葡萄球菌的總數(shù)減小，還表明在2小時孵育后金黃色葡萄球菌的存活率相比單獨的金黃色葡萄球菌的存活率明顯降低(P＝0.05,n＝3)。圖6：活鼠李糖乳桿菌GG、裂解物或用過的培養(yǎng)液通過從結(jié)合位點競爭性排除抑制金黃色葡萄球菌附著于角質(zhì)形成細(xì)胞。細(xì)菌粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞的能力，當(dāng)應(yīng)用于角質(zhì)形成細(xì)胞1小時時，約7.5±0.6logCFU/ml的金黃色葡萄球菌(SA)(106)附著于細(xì)胞，而鼠李糖乳桿菌GG(LGG)(108)為約7.9±0.5logCFU/ml。相比單獨用金黃色葡萄球菌(SA)感染的細(xì)胞(7.9±0.6logCFU/ml)，用鼠李糖乳桿菌GG(LGG+SA)、裂解物(LGGLYS+SA)或用過的培養(yǎng)液(LGGCM+SA)預(yù)暴露的細(xì)胞具有明顯較少的葡萄球菌粘附于該細(xì)胞(分別為5.83±0.2logCFU/ml、5.9±0.6logCFU/ml和6.4±0.7logCFU/ml)(P＝0.04,n＝3)。圖7：活鼠李糖乳桿菌GG或裂解物通過競爭性取代至結(jié)合位點抑制金黃色葡萄球菌而粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞。與單獨用金黃色葡萄球菌(SA)感染的細(xì)胞相比(7.95±0.6logCFU/ml)，用鼠李糖乳桿菌GG(LGG-12h)或裂解物(LGGLYS-12h)暴露后的細(xì)胞在12小時后具有明顯較少的葡萄球菌粘附于該細(xì)胞(分別為5.8±0.7logCFU/ml，5.4±0.3logCFU/ml)(P＝0.01,n＝3)。然而，用鼠李糖乳酸GG用過的培養(yǎng)液(LGGCM-12h)暴露后的細(xì)胞并不降低金黃色葡萄球菌的粘附數(shù)(7±0.6logCFU/ml,P>0.05,n＝3)。實施例實施例1：材料和方法哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物將在含有補(bǔ)充混合物(牛垂體提取物0.004mg/ml、表皮生長因子(重組人)0.125ng/ml、胰島素(重組人)5μg/ml、氫化可的松0.33μg/ml、腎上腺素0.39μg/ml和轉(zhuǎn)鐵蛋白、全蛋白(人)10μg/ml)的角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Promocell，Heidelberg，Germany)和0.06mMCaCh(Promocell,Heidelberg,Germany)中培養(yǎng)的正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NHEK)用作模型系統(tǒng)。如前所述(43)，將這些在37℃，5％CO2的潮濕氛圍中，于T-75培養(yǎng)燒瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌Goldin和Gorbach(L.rhamnosusGG)(ATCC53103.ATCC，Middlesex，UK)在37℃，Wilkins-ChalgrenBroth或Agar(Oxoid，Basingstoke，UK)于厭氧箱(氛圍，0：10：80的H2-CO2-N2)培養(yǎng)，使其常規(guī)生長。如先前所述(43)，在37℃，NutrientBroth(Oxoid，Basingstoke，UK)中使金黃色葡萄球菌進(jìn)行有氧生長。用細(xì)菌處理角質(zhì)形成細(xì)胞將細(xì)菌(108CFU/ml益生菌和106CFU/ml金黃色葡萄球菌)以15,000xg離心，在0.85％NaCI中洗滌兩次，并重懸浮于角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。將該懸浮液直接加到生長在24孔板中的5x103個細(xì)胞/cm2的NHEK中。對于使用益生菌裂解物的實驗，將10ml108CFU/ml鼠李糖乳桿菌GG離心，洗滌，重懸于pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)(10mM)中，并使用MSESoniprep150裂解。使用0.22μm孔過濾器(Millipore，Billerica，USA)過濾樣品以除去任何剩余的全細(xì)菌。將約100μΙ的該裂解物用于處理角質(zhì)形成細(xì)胞(5x103個細(xì)胞/cm2)。在一些實驗中，將細(xì)胞在離心機(jī)中以15,000×g沉降5分鐘，收集無細(xì)胞的上清液(用過的培養(yǎng)液)，并使用0.22μm孔過濾器(Millipore，Billerica，USA)過濾以除去任何殘留的全細(xì)菌。在其它實驗中，角質(zhì)形成細(xì)胞單層用病原體加益生菌或裂解物同時共同感染。在獨立實驗中，在金黃色葡萄球菌感染消耗后，將細(xì)胞暴露于鼠李糖乳桿菌GG裂解物2、4、6、8和12小時。在所有實驗中，分離角質(zhì)形成細(xì)胞，并且如(43)中所述使用臺盼藍(lán)排除測定法測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞培養(yǎng)物中的金黃色葡萄球菌存活率的測量為了確定鼠李糖乳桿菌GG裂解物或角質(zhì)形成細(xì)胞是否能夠抑制金黃色葡萄球菌在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長，角質(zhì)形成細(xì)胞在24孔板中生長至匯合。將它們暴露于單獨的金黃色葡萄球菌，或金黃色葡萄球菌加鼠李糖乳桿菌GG裂解物或條件培養(yǎng)基。在獨立實驗中，在金黃色葡萄球菌感染后將細(xì)胞暴露于鼠李糖乳桿菌GG裂解物2、4、6、8和12小時。通過如先前(43)所述計算菌落來確定活葡萄球菌的總數(shù)。細(xì)菌粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞的測量將匯合的角質(zhì)形成細(xì)胞暴露于細(xì)菌1小時。然后將細(xì)胞在pH＝7.4(10mM)的磷酸鹽緩沖液(PBS)(Invitrogen，LifeTechnologiesLtd，Paisley，UK)中洗滌三次以除去非粘附細(xì)菌。細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并進(jìn)行系列稀釋板計數(shù)以評估粘附細(xì)菌的數(shù)量。選擇性瓊脂用于葡萄球菌的生長。細(xì)菌拮抗作用的測定將金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物的10μΙ等份樣品接種到7ml軟瓊脂培養(yǎng)基(0.7％瓊脂)中，并直接加入預(yù)先倒有瓊脂基的平板上。將100μΙ每種有機(jī)體或鼠李糖乳桿菌GG培養(yǎng)物的提取物點在金黃色葡萄球菌菌苔上。共同培養(yǎng)的結(jié)果的測定(競爭性測定)將鼠李糖乳桿菌GG裂解物和金黃色葡萄球菌的等分樣品(100μΙ)接種到10mlWCB肉湯中。在0和24小時測量培養(yǎng)物的pH和光密度。以規(guī)律的間隔(在文中指示)，使用選擇性瓊脂通過連續(xù)稀釋板計數(shù)來計算細(xì)菌。統(tǒng)計分析所有實驗進(jìn)行至少三次，在每個實驗中有三次重復(fù)。使用SPSS(IBMSPSSStatistics版本16.0)程序通過單因素方差分析(onewayANOVA)和事后Tukey檢驗分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。如果P<0.05，則認(rèn)為結(jié)果是顯著的。數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。實施例2：結(jié)果鼠李糖乳桿菌GG保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的致病作用。最初，我們調(diào)查角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率是否受用鼠李糖乳桿菌GG孵育的影響。然而，在24小時孵育后，用益生菌孵育的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率與未處理的角質(zhì)形成細(xì)胞的對照相比沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。接下來，研究鼠李糖乳桿菌GG保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的影響的能力。與我們以前的發(fā)現(xiàn)(43)一致，角質(zhì)形成細(xì)胞暴露于106CFU/ml金黃色葡萄球菌24小時導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞明顯死亡。然而，與病原體和鼠李糖乳桿菌GG同時孵育的角質(zhì)形成細(xì)胞的百分比存活率(57％P＝0.01)比單獨用病原體感染的單層的百分比存活率明顯更高(圖1)。鼠李糖乳桿菌GG裂解物和用過的培養(yǎng)液保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的影響。我們通過調(diào)查益生菌裂解物和用過的培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，研究了活細(xì)菌對鼠李糖乳桿菌GG的保護(hù)作用是否是必需的。裂解物和用過的培養(yǎng)液都不會明顯影響角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率(P>0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，相比單獨用金黃色葡萄球菌感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率25％，裂解物和用過的培養(yǎng)液都降低了金黃色葡萄球菌的毒性，使得經(jīng)處理的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率分別為65％和57.93％(分別為P＝0.006和P＝0.01)(圖2)。鼠李糖乳桿菌GG、裂解物，但不是用過的培養(yǎng)液從金黃色葡萄球菌毒性中解救角質(zhì)形成細(xì)胞。接下來，我們通過在金黃色葡萄球菌感染角質(zhì)形成細(xì)胞前或后加入活細(xì)菌或裂解物來研究鼠李糖乳桿菌GG的保護(hù)作用的時機(jī)。在用金黃色葡萄球菌感染之前暴露于鼠李糖乳桿菌GG或用過的培養(yǎng)液2小時的單層中的角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率的百分比明顯大于單獨用金黃色葡萄球菌感染的單層中的角質(zhì)形成細(xì)胞存活率的百分比(P＝0.006)。裂解物和用過的培養(yǎng)液都提供了類似的保護(hù)水平(P＝0.005，p＝0.004)(圖3)。在感染后實驗中，加入活鼠李糖乳桿菌GG、裂解物或用過的培養(yǎng)液之前，角質(zhì)形成細(xì)胞暴露于金黃色葡萄球菌2h，4h，6h，8h和12h。然后在用金黃色葡萄球菌感染后24小時測量角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率。圖4(A，B)中的數(shù)據(jù)顯示，在金黃色葡萄球菌后添加時，活益生菌及其裂解物可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞。即使在金黃色葡萄球菌感染后的12小時，鼠李糖乳桿菌GG或裂解物仍然為角質(zhì)形成細(xì)胞提供保護(hù)，使得分別有58％和55％的細(xì)胞保持存活，相比之下當(dāng)暴露于單獨的金黃色葡萄球菌時為25％(P＝0.003，P＝0.01)。然而，來自鼠李糖乳桿菌GG的用過的培養(yǎng)液在金黃色葡萄球菌后添加時對角質(zhì)形成細(xì)胞沒有保護(hù)作用(圖4C)。鼠李糖乳桿菌GG裂解物，但不是用過的廢培養(yǎng)液，抑制金黃色葡萄球菌的生長。探討了鼠李糖乳桿菌GG裂解物發(fā)揮其保護(hù)作用的機(jī)制。我們調(diào)查益生菌裂解物是否通過使其在培養(yǎng)物中同時生長從而對病原體的生長具有直接影響。與未處理的培養(yǎng)物相比，競爭試驗表明在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中，在鼠李糖乳桿菌GG裂解物存在下，24小時后金黃色葡萄球菌的增長明顯下降(P＝0.02)(圖5A)。然而，來自鼠李糖乳桿菌GG的用過的培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌的生長沒有影響(圖5A)。相比單獨生長的金黃色葡萄球菌(P＝0.02)的8log10cfu/ml，在裂解物(但不是用過的培養(yǎng)液)存在下，活葡萄球菌的總數(shù)也明顯減少至5log10cfu/ml(圖5B)。此外，活的葡萄球菌培養(yǎng)物的總數(shù)由于鼠李糖乳桿菌GG裂解物而隨時間減少(圖5C)。由于乳桿菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸，我們測量了用金黃色葡萄球菌、鼠李糖乳桿菌GG裂解物或兩者同時感染24小時的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的pH。然而，處理組之間的pH沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。我們還測量了單獨的裂解物的pH，發(fā)現(xiàn)其為pH＝7.2，因此消除了酸介導(dǎo)作用的可能性。鼠李糖乳桿菌GG抑制金黃色葡萄球菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附。鼠李糖乳桿菌GG的活細(xì)菌、裂解物或用過的培養(yǎng)液可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞的另一機(jī)制是通過抑制病原粘附。以前，我們展示了粘附是金黃色葡萄球菌的毒性作用和特定益生菌(如羅伊氏乳桿菌)通過將病原體從角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)合位點競爭性排除(43)保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞的要求。因此，我們認(rèn)為抑制粘附也是鼠李糖乳桿菌GG、裂解物或用過的培養(yǎng)液的保護(hù)機(jī)制的一部分。進(jìn)行粘附測定以確定抑制是否是由于從角質(zhì)形成細(xì)胞上的結(jié)合位點競爭，排除或置換病原體引起的(圖6A&B和圖7)。我們的結(jié)果表明，如果角質(zhì)形成細(xì)胞被共感染(競爭，P＝0.03)，預(yù)暴露(排除，P＝0.04)或甚至在用金黃色葡萄球菌感染開始后12小時應(yīng)用(置換，P＝0.01)，活鼠李糖乳桿菌GG或裂解物能夠抑制病原體粘附。然而，如果在加入病原體之前或與病原體同時將用過的培養(yǎng)液加入角質(zhì)形成細(xì)胞，則用過的培養(yǎng)液僅抑制病原體粘附(圖7)。討論本研究探討腸道益生菌、鼠李糖乳桿菌GG是否可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌的致病作用。確定同時添加金黃色葡萄球菌和鼠李糖乳桿菌GG對角質(zhì)形成細(xì)胞存活率的影響的初步實驗表明，相比單獨用金黃色葡萄球菌感染的角質(zhì)形成細(xì)胞，在益生菌存在下，活角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量增加，可見保護(hù)作用顯著(圖1)。此外，鼠李糖乳桿菌GG的保護(hù)作用不需要活細(xì)菌，因為來自益生菌的裂解物和用過的培養(yǎng)液也保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌之害。鼠李糖乳桿菌GG或裂解物的應(yīng)用時間不影響益生菌或裂解物賦予的保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之害的保護(hù)程度(圖3)。數(shù)據(jù)表明，預(yù)先、過后或共同暴露于鼠李糖乳桿菌GG或裂解物的角質(zhì)形成細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之害。然而，益生菌用過的培養(yǎng)液只有當(dāng)其在病原體之前或同時加入時才保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，鼠李糖乳桿菌GG抵抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)作用涉及至少兩種獨立的活性，一種包含在用過的培養(yǎng)液中，一種包含在裂解物中。我們的數(shù)據(jù)表明，用過的培養(yǎng)液中含有的活性可能具有抗粘附作用。這是基于以下觀察結(jié)果：A)鼠李糖乳桿菌GG-用過的培養(yǎng)液僅當(dāng)其在金黃色葡萄球菌感染之前或同時加入才抑制病原體對角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附。B)我們以前已經(jīng)表明，金黃色葡萄球菌必須粘附至角質(zhì)形成細(xì)胞，以對該細(xì)胞產(chǎn)生毒性，并且抑制粘附的試劑保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受這種病原體之害(43)。C)與此相一致，用過的培養(yǎng)液僅在加入金黃色葡萄球菌前或共感染時才具有保護(hù)作用。其它體外研究證明來自推定的益生菌(乳桿菌、雙歧桿菌屬、乳球菌、鏈球菌鏈球菌)的無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(CFCS)能夠抑制幾種病原體如鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對Caco-2細(xì)胞的粘附(11)。乳桿菌裂解物保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞可能涉及至少兩種機(jī)制。首先，裂解物可能能夠降低金黃色葡萄球菌的增長。競爭測定表明鼠李糖乳桿菌GG裂解物降低活葡萄球菌的總數(shù)(圖5A、B、C)。此外，在抑制測定中，當(dāng)用來自厭氧生長的益生菌的裂解物挑戰(zhàn)金黃色葡萄球菌時觀察到抑制區(qū)(表1)。這些數(shù)據(jù)表明鼠李糖乳桿菌GG裂解物抑制金黃色葡萄球菌生長的能力。這可能是由于在益生菌內(nèi)存在能夠直接抑制金黃色葡萄球菌生長和/或存活率的有毒分子。這種分子可能是合成的，但不是分泌的，因為鼠李糖乳桿菌GG用過的培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌的存活率沒有影響。如果鼠李糖乳桿菌GG含有抑菌物質(zhì)，則這也可以至少部分地解釋益生菌在角質(zhì)形成細(xì)胞存活測定中的保護(hù)作用。益生菌，特別是乳桿菌，先前已顯示對金黃色葡萄球菌生長發(fā)揮強(qiáng)抑制作用。據(jù)報道，某些乳桿菌菌株對形成生物膜的金黃色葡萄球菌具有高度拮抗作用(28,30)。其它研究報道，益生菌可以通過產(chǎn)生細(xì)菌素，抑制病原體的生長來改善腸道健康(16,48)。此外，鼠李糖乳桿菌GG已顯示通過產(chǎn)生乳酸抑制腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的生長(29)。然而，在本研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)酸生產(chǎn)作為鼠李糖乳桿菌GG的保護(hù)作用的一部分的參與證據(jù)。實際上，來自該生物的裂解物是中性的(pH7.2)，但仍然能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長。表1：菌苔上的菌斑的測定中的金黃色葡萄球菌的抑制區(qū)(ZOI)(n＝3)。菌苔上的菌斑的測定顯示在厭氧條件下但不在有氧條件下由鼠李糖乳桿菌(LGG)和裂解物(LGGLYS)產(chǎn)生的抑制區(qū)。結(jié)果表示為平均值±SEM。鼠李糖乳桿菌GG的活細(xì)菌或裂解物可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞的第二種機(jī)制是通過抑制病原粘附。實際上，我們的數(shù)據(jù)證明了在鼠李糖乳桿菌GG或其裂解物存在下，金黃色葡萄球菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附減少。這個數(shù)據(jù)暗示了排除機(jī)制，如我們以前所觀察到的羅伊氏乳桿菌那樣(43)。然而，有趣的是，當(dāng)添加到現(xiàn)有的感染時，活鼠李糖乳桿菌GG或其裂解物也抑制金黃色葡萄球菌的粘附，這證明了另一種保護(hù)機(jī)制，即，鼠李糖乳桿菌GG可以從角質(zhì)形成細(xì)胞中置換病原體(圖7)。類似地，活鼠李糖乳桿菌GG已經(jīng)顯示從腸道的腸細(xì)胞中置換病原體(47)。然而，我們的數(shù)據(jù)表明活細(xì)菌的存在對于從角質(zhì)形成細(xì)胞置換金黃色葡萄球菌不是必需的。重要的是，我們的數(shù)據(jù)表明乳桿菌用于降低病原體毒性的機(jī)制中的物種依賴差異。我們以前的工作強(qiáng)調(diào)羅伊氏乳桿菌作為一種有機(jī)體，能夠排除金黃色葡萄球菌形成角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)合位點(43)。在這項研究中，我們已經(jīng)表明鼠李糖乳桿菌GG可以，不僅排除病原體，還可以降低病原體的增長和從角質(zhì)形成細(xì)胞置換病原體。當(dāng)然，這種置換活性可能與鼠李糖乳桿菌GG抑制生長的能力相關(guān)，這是可能的，并且需要進(jìn)一步研究來澄清這一點?？傊?，我們報道鼠李糖乳桿菌GG是抑制金黃色葡萄球菌的致病性的潛在的新試劑。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示鼠李糖乳桿菌GG在皮膚上的效用不受其是否能在皮膚上生長和存活的限制，因為有機(jī)體的裂解物在防止金黃色葡萄球菌定殖上如活細(xì)菌一樣有效。此外，裂解物可用作預(yù)防劑，例如，用于洗手液，但是可能作為現(xiàn)有傳染物的抗生素的輔助劑或甚至替代物。參考文獻(xiàn)1.AlyR,ShinefieldHR,LitzC,MaibachHI.1980.RoleofTeichoicAcidintheBindingofStaphylococcusaureustoNasalEpithelialCells.J.Infect.Dis.141:463-465.2.BackhedF,LeyRE,SonnenburgJL,PetersonDA,GordonJl.2005.Host-BacterialMutualismintheHumanIntestine.Science.307:1915-1920.3.Balma-MenaA,Lara-CorralesI,ZellerJ,RichardsonS,McGavinMJ,WeinsteinM.2011.Colonizationwithcommunity-acquiredmethicillin-resistantStaphylococcusaureusinchildrenwithatopicdermatitis:across-sectionalstudy.J.Dermatol.50:682-688.4.BanerjeeP,MerkelG,BhuniaA.2009.Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricusB-30892caninhibitcytotoxiceffectsandadhesionofpathogenicClostridiumdifficiletoCaco-2cells.GutPathogens.1:8-16.5.Bek-ThomsenM,LomholtHB,KilianM.2008.AcneisNotAssociatedwithYet-UnculturedBacteria.J.Clin.Microbiol.46:3355-3360.6.BorruelN,CasellasF,AntolinM,LlopisM,CarolM,EspiinE.2003.Effectsofnon-pathogenicbacteriaoncytokinesecretionbyhumanintestinalmucosa.J.AmericanGastroenterology.98:865-870.7.BowlerPG,DuerdenBl,ArmstrongDG.2001.WoundMicrobiologyandAssociatedApproachestoWoundManagement.Clin.Microbiol.Rev.14:244-269.8.BurkhartCN,BurkhartCG.2003.Microbiology'sprincipleofbiofilmsasamajorfactorinthepathogenesisofacnevulgaris.J.Dermatol.42:925-927.9.CaglarE,KavalogluCildirS,ErgeneliS,SandalliN,TwetmanS.2006.SalivarymutansstreptococciandlactobacillilevelsafteringestionoftheprobioticbacteriumLactobacillusreuteriATCC55730bystrawsortablets.ActaOdontol.Scand.64:314-318.10.ChenX,XuJ,ShuaiJ,ChenJ,ZhangZ,FangW.2007.TheS-layerproteinsofLactobacilluscrispatusstrainZJ001isresponsibleforcompetitiveexclusionagainstEscherichiaco//0157:H7andSalmonellatyphimurium.Int.J.FoodMicrobiol.115:307-312.11.Dabedi,FeizizadehS,Jafarian-DehkordiA.2013.Invitroanti-bacterialandanti-adherenceeffectsofLactobacillusdelbrueckiisubspbulgaricusonEscherichiacoli.ResPharmSci.4:260-268.12.DeepikaG,CharalampopoulosD,AllenIL,SimaS,GeoffreyMG.2010.SurfaceandAdhesionPropertiesofLactobacilli,Adv.Appl.Microbiol.70:127-152.13.DiMarzio,CinqueLB,DeSimoneC,CifoneMG.1999.Effectofthe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