本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領域，涉及到一種具有抗丙型肝炎病毒作用的新型藥物組合物；具體來說，該藥物組合物包含丙型肝炎病毒NS5B聚合酶抑制劑以及一種NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑和/或一種NS5A抑制劑。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的慢性肝病。HCV在侵染肝細胞后，逃避宿主免疫監(jiān)視并利用脂質(zhì)代謝過程維持自身復制，引發(fā)慢性感染；同時導致肝細胞物質(zhì)能量代謝紊亂，最終進展為脂肪肝、肝硬化甚至原發(fā)性肝癌。慢性丙肝發(fā)病率高，慢性化程度高，危害性高，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題；在中國，HCV感染者高達2500萬例，針對這樣一種高危感染，卻仍存在認知率低、就診率低、治療率低的窘境。
值得注意的是，丙肝患者若能及時接受規(guī)范的抗病毒治療，可以實現(xiàn)治愈。對于少部分進行治療的感染者來說，可選擇的抗病毒治療方案仍有長效干擾素聯(lián)合使用利巴韋林，該療法給藥依從性差，產(chǎn)生局部、全身甚至精神上的副作用。此外，半數(shù)以上的患者在聯(lián)合治療后并不能夠完全治愈，且需要承擔高昂的治療費用。而與之對比的是，自NS3/4A蛋白酶抑制劑Telaprevir和Boceprevir上市以來，抑制HCV生命周期中的關(guān)鍵蛋白進行抗病毒治療的研究成為領域內(nèi)的熱點。許多直接作用于關(guān)鍵蛋白的抗HCV藥物(DAAs)如NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑均已成功上市，并實現(xiàn)無干擾素全口服治愈HCV。然而，現(xiàn)有的藥物治療手段仍存在治療周期長、藥物劑量大的缺點，且藥物價格昂貴。因此，亟需開發(fā)新的抗HCV藥物以滿足臨床需求。
HCV具有至少六種基因亞型，每種亞型對藥物的敏感程度不同；HCV高度變異，進一步導致相同亞型在不同個體間仍存在治療差異甚至藥物抵抗，因此尋找對全基因型有效，且耐藥屏障高的HCV抑制劑意義重大。目前，應用于臨床或處于臨床試驗階段的NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑主要有Telaprevir、Boceprevir、Danoprevir、Simeprevir、Asunaprevir、Paritaprevir以及Grazoprevir；NS5A抑制劑主要有Daclatasvir、Ledipasvir、Ombitasvir以及Elbasvir；這兩類抑制劑在臨床應用中均極易誘發(fā)耐藥HCV的出現(xiàn)，導致療效大大降低。在中國專利申請201110174871.1“2′-脫氧-2′-氟-2′-甲基核苷衍生物及其制備方法與在制藥中的用途”中，公開了一系列具有抗HCV作用的核苷類NS5B聚合酶抑制劑。雖然該專利中涉及的化合物與現(xiàn)有 同類藥物Sofosbuvir相比，能夠?qū)δ退嶩CV產(chǎn)生較強的抑制活性，但單獨應用這類藥物仍存在抗病毒活性低，潛在的病毒耐藥風險大等缺點，無法滿足治療需求。
解決以上問題最好的策略是針對不同作用靶點，進行抑制劑間的聯(lián)合給藥。而以藥物組合物的形式進行聯(lián)合用藥能夠在簡化給藥方式，提高給藥依從性的同時，克服各組分單獨用藥的不足并進一步提高藥效。目前，F(xiàn)DA已批準上市的藥物組合物僅有Gilead公司的Harvoni與AbbVie公司的Viekira Pak。其中，Harvoni是核苷類NS5B聚合酶抑制劑Sofosbuvir與NS5A抑制劑Ledipasvir的固定劑量組合物，而Viekira Pak是NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑Paritaprevir與NS5A抑制劑Ombitasvir的固定劑量組合物，但同時需要加服非核苷類NS5B聚合酶抑制劑Dasabuvir。而核苷類NS5B聚合酶抑制劑和NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑構(gòu)成的藥物組合物以及NS5B聚合酶抑制劑、NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑和NS5A抑制劑構(gòu)成的藥物組合物，目前均未有成功上市的案例。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有藥物的不足，本發(fā)明提出一種新的藥物組合物，能有效地起到抗HCV作用，減少現(xiàn)有藥物的給藥劑量，縮短治療周期，降低病毒耐藥風險，以獲得更好的臨床療效。
為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種更為安全有效的治療慢性丙型肝炎的新型給藥方案。該技術(shù)方案涉及一種藥物組合物，其中包含核苷類NS5B聚合酶抑制劑以及一種NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑和/或一種NS5A抑制劑以及藥學上可接受的載體。
上述藥物組合物中，所述的核苷類NS5B聚合酶抑制劑為(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正丁酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基-四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯I-1、(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正戊酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基-四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸異丙酯I-2、(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正己酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基-四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸異丙酯I-3或(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正己酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基-四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯I-4，其結(jié)構(gòu)如下所示；
其中優(yōu)選NS5B聚合酶抑制劑為I-1。
上述藥物組合物中，所述的NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑為Telaprevir、Boceprevir、Danoprevir、Simeprevir、Asunaprevir、Paritaprevir或Grazoprevir，其結(jié)構(gòu)如下所示：
其中，優(yōu)選NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑為Simeprevir。
上述的藥物組合物中，所述的NS5A抑制劑為Daclatasvir、Ledipasvir、Ombitasvir或Elbasvir，其結(jié)構(gòu)如下所示：
其中，優(yōu)選NS5A抑制劑為Daclatasvir。
上述藥物組合物中，NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑的濃度配比為1∶(1/5000～100)；優(yōu)選為1∶(1/2000～10)；更優(yōu)選為1∶(1/600～1)。
上述藥物組合物中，NS5B抑制劑I與NS5A抑制劑的濃度配比為1∶(1/50000～10)；優(yōu)選為1∶(1/20000～1)；更優(yōu)選為1∶(1/6000～0.1)。
上述藥物組合物中，NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑及NS5A抑制劑的濃度配比為1∶(1/5000～100)∶(1/50000～10)；優(yōu)選為1∶(1/2000～10)∶(1/20000～1)；更優(yōu)選為1∶(1/600～1)∶(1/6000～0.1)。
上述藥物組合物中，優(yōu)選NS5B抑制劑I-1與Simeprevir的濃度配比為1∶(1/5000～100)；優(yōu)選為1∶(1/2000～10)；更優(yōu)選為1∶(1/600～1)。
上述藥物組合物中，優(yōu)選NS5B抑制劑I-1與Daclatasvir的濃度配比為1∶(1/50000～10)；優(yōu)選為1∶(1/20000～1)；更優(yōu)選為1∶(1/6000～0.1)。
上述藥物組合物中，優(yōu)選NS5B抑制劑I-1與Simeprevir及Daclatasvir的濃度配比為1∶(1/5000～100)∶(1/50000～10)；優(yōu)選為1∶(1/2000～10)∶(1/20000～1)；更優(yōu)選為1∶(1/600～1)∶(1/6000～0.1)。
本發(fā)明還提供上述藥物組合物在制備抗丙型肝炎藥物中的用途。將上述濃度配比換算為質(zhì)量配比后，混勻各組分藥物并直接或間接加入藥學上可接受的載體，通過本領域技術(shù)人員熟知的操作手段制成片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑、口服液或注射劑。
令人驚奇的是，本發(fā)明所涉及的藥物組合物具有明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
本發(fā)明首次提供了含有核苷類NS5B抑制劑I的新型藥物組合物給藥方案。
本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)了不可預見的抗病毒效果：HCV復制子細胞水平顯示，核苷類NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑或NS5A抑制劑組合后，均表現(xiàn)出意想不到的協(xié)同作用；而在現(xiàn)有藥物組合物中，并不存在明顯的協(xié)同作用。
NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑及NS5A抑制劑聯(lián)合用藥，與各組分中任一組分單獨給藥或任兩組分聯(lián)合給藥相比，能夠顯著提高抗病毒效果，且大大降低用藥劑量。
變異型HCV復制子細胞活性顯示，本發(fā)明提供的藥物組合物對變異型HCV能夠產(chǎn)生有效的抑制作用，保持較高的抗病毒水平。這提示本發(fā)明能夠有效防止臨床應用中多種耐藥變異型HCV的出現(xiàn)。
附圖說明
圖1藥物組合物耐藥性質(zhì)的測試
具體實施方式
為了更好的理解并驗證本發(fā)明的可靠性，下面通過具體實施例進行詳細解釋，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1 NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑或NS5A抑制劑的聯(lián)合用藥
藥品：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞模型：1b基因型HCV亞基因組復制子細胞系統(tǒng)(Conl cells)。
實驗步驟：
1.共孵育：將復制子細胞接種到96孔板中，每孔8000個細胞；在不同濃度的化合物I-1中(0、25、50、100、200、400、800、1600nM)，加入不同濃度的Simeprevir(0、3、6、12、24nM)或Daclatasvir(0、0.02、0.04、0.08、0.16nM)，每組化合物雙復孔檢測，DMSO終濃度為0.5％；二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(藥物組合物中各組分濃度見表1)。
2.向每孔細胞中加入細胞活力檢測試劑，檢測細胞活力。隨后向細胞中加入熒光素酶底物Bright-Glo，5分鐘后用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶表達水平，進而得到復制子抑制活性百分比。
3.利用Compusyn軟件，計算聯(lián)用指數(shù)(Combination Index，CI)，并通過CI值評價藥物組合物的聯(lián)用效果。
實驗結(jié)果
1.各組化合物均未表現(xiàn)出細胞毒性。
2-抗病毒活性及協(xié)同作用評價如表1-4所示：
表1 不同濃度的I-1及Simeprevir聯(lián)合用藥對HCV的抑制活性化合物I-1(nM)
表2 I-1與Simeprevir聯(lián)合用藥中，不同濃度配比的CI值
表3 不同濃度的I-1及Daclatasvir聯(lián)合用藥對HCV的抑制活性化合物I-1(nM)
表4 I-1與Daclatasvir聯(lián)合用藥中，不同濃度配比的CI值
表格內(nèi)記載的數(shù)據(jù)為藥物組合物在不同濃度下對HCV亞基因組復制子的抑制率。利用Compusyn軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，得到不同濃度配比下，I-1與Simeprevir或Daclatasvir的聯(lián)用指數(shù)(CI)。當CI＞1時，藥物組分存在拮抗作用；當CI＝1時，兩種藥物組分呈現(xiàn)加和作用；而當CI＜1時，藥物組分存在協(xié)同作用。通過表2和表4可以明顯看出，在不同濃度配比下，I-1與Simeprevir呈現(xiàn)出不同程度的協(xié)同作用；而與Daclatasvir呈現(xiàn)較強的協(xié)同作用。
實驗結(jié)果充分說明，本發(fā)明提供的新型藥物組合物中，NS5B聚合酶抑制劑與NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑或NS5A抑制劑均能夠起到協(xié)同作用；組合物聯(lián)合用藥，均表現(xiàn)出很強的抗病毒效果；這一實驗確證了本發(fā)明技術(shù)方案的合理性，并有希望在臨床應用中減少現(xiàn)有藥物的給藥劑量，增強抗HCV活性，以獲得更好的療效。
實施例2 NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑及NS5A抑制劑的聯(lián)合用藥
藥品：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞模型：1b基因型HCV亞基因組復制子細胞系統(tǒng)(Conl cells)。
實驗步驟：
1.藥物組合物溶液的配制：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir及Daclatasvir的濃度配比為1∶0.015∶0.000075，配制藥物組合物溶液S1；NS5B抑制劑I-1、Simeprevir及Daclatasvir的濃度配比為1∶0.015∶0.00015，配制藥物組合物溶液S2；NS5B抑制劑I-1、Simeprevir及 Daclatasvir的濃度配比為1∶0.0075∶0.000075，配制藥物組合物溶液S3；Simeprevir及Daclatasvir的濃度配比為200∶1，配制藥物組合物溶液S4；其中，S1-3中NS5B抑制劑I-1的起始濃度為10μM，S4中Simeprevir的起始濃度為10μM。
2.共孵育：將復制子細胞接種到96孔板中，每孔8000個細胞；將不同濃度配比的藥物組合物S1-4按3倍濃度梯度稀釋后，與細胞共孵育，雙復孔檢測，DMSO終濃度為0.5％；二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。
3.向每孔細胞中加入細胞活力檢測試劑，檢測細胞活力。隨后向細胞中加入熒光素酶底物Bright-Glo，5分鐘后用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達水平，進而得到藥物組合物S1-4對HCV復制子的抑制曲線。
實驗結(jié)果
1.各組化合物均未表現(xiàn)出細胞毒性。
2.抗病毒活性如表5所示：I-1、Simeprevir、Daclatasvir各自的EC50、EC90、EC95、EC99如表6所示。
表5 I-1與Simeprevir及Daclatasvir的聯(lián)合用藥
表6 I-1、Simeprevir及Daclatasvir的抗HCV活性
首先，在S1的抑制曲線中，選取I-1、Simeprevir及Daclatasvir EC50附近的濃度配比Com A，以及高于其EC50兩倍的濃度配比Com D；在S2的抑制曲線中，選取Daclatasvir的濃度為其 EC50兩倍時的濃度配比Com B；在S3的抑制曲線中，選取I-1與Daclatasvir的濃度均為其EC50兩倍時的濃度配比Com C；選取S4的抑制曲線中，各組分藥物單獨用藥時EC50附近的濃度配比Com E，以及高于各組分藥物EC50兩倍的濃度配比Com F。各濃度配比詳見表5Com A-F，通過比較不同濃度配比對HCV的抑制率來評價本發(fā)明藥物組合物的抗HCV效果。
實驗結(jié)果顯示，Com A對HCV復制子的抑制率達到82.91％，Com E的抑制率為73.14％，而三者單獨給藥抑制率僅在50％左右。這說明在給藥濃度相同的情況下，聯(lián)合給藥的抗HCV作用遠遠強于單獨給藥的效果。
其次，Com B對HCV抑制率達到91.06％，與單獨給藥時的EC90相比，各組分聯(lián)合用藥時的給藥濃度明顯降低；同樣的，Com C對HCV抑制率大于95％，各組分濃度卻遠遠小于其EC95。這兩組數(shù)據(jù)均說明在起到相同抗HCV作用效果的前提下，藥物組合物能夠顯著降低給藥濃度(劑量)。
當三組分濃度均提高至EC50的兩倍后，Com D的抑制率高達99.5％，而雙組份Com F抑制率僅為89.55％，這進一步證實了藥物組合物能夠顯著降低給藥濃度；此外更提示本發(fā)明在藥物組合物中加入核苷類NS5B抑制劑I能夠改善抗病毒效果。
以上實驗令人驚奇的證明了本發(fā)明涉及的藥物組合物，即NS5B抑制劑I、NS3/4A抑制劑及NS5A抑制劑聯(lián)合用藥，與各組分中任一組分單獨給藥或任兩組分聯(lián)合給藥相比，能夠顯著提高抗病毒效果，且大大降低用藥劑量，效果遠遠優(yōu)于已知藥物組合。
實施例3藥物組合物耐藥性質(zhì)的測試
藥品：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞模型：變異型HCV亞基因組復制子細胞系統(tǒng)。包括S282TNS5B變異型復制子、R155K NS3/4A變異型復制子、Q80K NS3/4A變異型復制子、Y93H NS5A變異型復制子。
實驗步驟：
1.藥物組合物溶液的配制：藥物組合物溶液S1與藥物組合物溶液S4比例與實施例2中相同；NS5B抑制劑I-1與Simeprevir的濃度配比為1∶0.015，配制藥物組合物溶液S5；NS5B抑制劑I-1與Daclatasvir的濃度配比為1∶0.000075，配制藥物組合物溶液S6；其中，S1、5、6中NS5B抑制劑I-1的起始濃度為10μM，S4中Simeprevir的起始濃度為10μM。
2.共孵育：將野生型及變異型復制子細胞接種到96孔板中，每孔8000個細胞；將藥物或藥物組合物S1、S4-6三倍濃度稀釋，分別與兩類復制子細胞共孵育，雙復孔檢測，DMSO終濃度為0.5％；二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時；
3.向每孔細胞中加入細胞活力檢測試劑，檢測細胞活力。隨后向細胞中加入熒光素酶底 物Bright-Glo，5分鐘后用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶表達水平，計算得到半數(shù)有效濃度EC50及Fold Change值，其中野生型復制子抑制活性為ECWT，變異型復制子抑制活性為ECMut，F(xiàn)old Change＝ECMut/ECWT；
3.用Fold Change衡量變異型HCV對藥物或藥物組合物的敏感程度。當Fold Change＞1.2時可認為HCV對藥物的敏感程度降低，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。
實驗結(jié)果如圖1所示：
由圖1可知，各組分單獨給藥時，I-1對S282T NS5B變異型復制子的抑制活性有所降低；Simeprevir對R155KNS3/4A變異型及Q80KNS3/4A變異型復制子的抑制活性出現(xiàn)明顯降低；Daclatasvir對Y93H NS5A變異型復制子的抑制活性也呈現(xiàn)明顯降低。
藥物組合物Com A對所選的4種變異型HCV均有理想的抑制活性；而與之相比，R155K、Q80K、Y93H變異型HCV對僅含有Simeprevir及Daclatasvir的組合物Com E仍產(chǎn)生一定程度的耐藥。
以上實驗證實了本發(fā)明所涉及的藥物組合物能夠?qū)σ吧图岸喾N變異型HCV產(chǎn)生良好的抑制作用；該實驗提示應用該藥物組合物能夠有效防止耐藥病毒的產(chǎn)生。
實施例4 片劑
將上表配方的粉末混合，通過壓片機壓片，制成每片1200mg的片劑。該片劑可以根據(jù)需要進行薄膜包衣或包糖衣。
實施例5 片劑
將上表配方的粉末混合，通過壓片機壓片，制成每片1200mg的片劑。該片劑可以根據(jù)需要進行薄膜包衣或包糖衣。
實施例6 片劑
將上表配方的粉末混合，通過壓片機壓片，制成每片1200mg的片劑。該片劑可以根據(jù)需要進行薄膜包衣或包糖衣。